Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, biopolymere Filme elektrisch abzuscheiden und mit biologischen Komponenten wie Proteinen und Zellen zu funktionalisieren. Die Elektroabscheidung wird erreicht, indem die pH-Änderung, die lokal an einer vorgespannten Elektrode auftritt, in Kombination mit einer pH-empfindlichen Polysaccharidlösung ausgenutzt wird. Bei der Wahl einer kathartischen oder anodischen Abscheidungsstrategie wird die Elektrode vorgespannt, um einen Seelengelübergang auszulösen, der einen dünnen Film erzeugt, dessen Muster durch die Elektrogeometrie definiert ist.

Darüber hinaus können biologische Komponenten wie Proteine und Zellen während des gesamten Elektrodenabscheidungsprozesses eingebracht werden. Um die Filme biologisch zu funktionalisieren, erhält man Ergebnisse, die zeigen, dass biologische Komponenten auf Basis der Fluoreszenzbildgebung auf den Filmen lokalisiert sind. Darüber hinaus sind die Komponenten funktionsfähig und in der Lage, mit ihrer Umgebung zu interagieren, was durch den elektrochemischen Nachweis der enzymatischen Aktivität und die Verwendung der Reporterzellantwort nachgewiesen wird.

Die Biofabrikation bietet einen neuartigen Werkzeugkasten für den Aufbau der Schnittstelle zwischen Biologie und Elektronik. Wir glauben, dass seine Hauptvorteile seine Einfachheit und seine Fähigkeit sind, sich unter nahezu physiologischen Bedingungen zusammenzubauen. Die Biologie ist Experte in der Herstellung im Nanomaßstab durch Selbstorganisation und enzymatische Mittel. Durch die Nutzung dieser Fähigkeiten umgehen wir komplexe, gefährliche und zeitaufwändige Synthesemethoden, die andere Assemblierungstechniken verwenden.

Unser kollaboratives Team kam auf die Idee, die BioD-Geräteschnittstelle mit biologischen Materialien und Mechanismen zu bauen, als wir beobachteten, dass ihre Drachen in Elektroden abgelegt werden könnten. Kitan ist ein pH-empfindlicher Film, der Polysaccharid bildet, der vom Gerät auferlegte elektrische Signale erkennen und sich als dünner Film ablagern kann. Als wir sahen, dass Kitan mit Elektroden abgeschieden werden konnte, erkannten wir, dass wir auf eine breitere Palette von Werkzeugen aus der Biochemie und Molekularbiologie zugreifen konnten, um eine BioD-Geräteschnittstelle zu erstellen.

Die Anwendung einer solchen Technik erstreckt sich auf Labon-Chip-Einstellungen, bei denen funktionelle biologische Komponenten erforderlich sind, da sie eine kostengünstige und einfache Möglichkeit bieten, solche Komponenten auf einer Elektrode zu lokalisieren, wo sie lebensfähig bleiben können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine Bio-Fabricat-Folie speziell verwendet und leicht beschädigt werden kann. Daher muss man darauf achten, beim Waschen oder Drehen des Films nicht zu hart zu sein.

Da der Film denominiert werden könnte, kann er leicht gestört werden. Als Vorteil kann jedoch die Wiederverwendung der Elektros angesehen werden, da die Folie leicht entfernt werden kann. Um dieses Protokoll zu starten, schließen Sie ein Netzteil über Patchkabel mit Krokodilklemmen an die speziell angefertigten Elektroden an

Ein mit Indiumzinnoxid oder ITO bedeckter Glasobjektträger fungiert als Anode oder Arbeitselektrode; Platinfolie dient als Kathode oder Gegenelektrode und positioniert die Elektrode so, dass die zu funktionalisierende Oberfläche des IT o der Gegenelektrode in einer Weise gegenübersteht, dass die Oberfläche des IT O entweder vertikal positioniert ist, um in die Lösung eingetaucht zu werden, oder horizontal. so, dass die Lösung auf der Oberfläche enthalten sein kann. Bereiten Sie anschließend eine Alginatabscheidungslösung vor, indem Sie 1 % Alginat und 0,5 % Calciumcarbonat in destilliertem Wasser mischen und die Mischung autoklavieren. Anschließend wird das Alginat mit Fluorkügelchen durch Mischen und Vortexen fluoreszierend markiert.

Dies ermöglicht eine Fluoreszenzbildgebung des resultierenden Films. Nach dem Autoklavieren tauchen die beiden Elektroden der Lösung in die vorbereitete Abscheidungslösung und wenden eine konstante Stromdichte von drei Ampere pro Quadratmeter für zwei Minuten an. Die Spannung verschiebt sich im Bereich von zwei bis drei Volt Trennen Sie nach zwei Minuten die Elektrode und entfernen Sie die nicht ablagernde Lösung. Spülen Sie die Folie vorsichtig mit Natriumchlorid aus, um überflüssiges Alginat zu entfernen.

Inkubieren Sie den Film kurz in 0,1 molaren Calciumchlorid, um das Gel zu verstärken. Anschließend wird die Folie in der gewünschten Aufbewahrungslösung inkubiert. Fahren Sie mit der Fluoreszenzmikroskopie fort, um den Film vor der Co-Abscheidung abzubilden.

Züchten Sie eine Signalsender-Zellkultur und eine Signalempfänger-Zellkultur, wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben. Bereiten Sie anschließend eine Abscheidungslösung aus Alginat und Calciumcarbonat vor. Mischen Sie die Lösung mit jeder Zellkultur im Verhältnis eins zu eins auf eine Endkonzentration von 1 % Alginat und 0,5 % Calciumcarbonat, wobei die Zellen auf etwa die Hälfte der Kultivierungsdichte verdünnt werden.

Verwenden Sie einen Objektträger mit zwei ITO-Elektroden, die von einer Polydimethylsilan-Vertiefung und einer Platin-Gegenelektrode umgeben sind. Schließen Sie eine ITO-Elektrode und die Platinelektrode an ein Netzteil an. Tauchen Sie die Elektroden wie zuvor in die Abscheidungslösung, die die Empfängerzellen enthält.

Stellen Sie die Stromversorgung auf einen konstanten Strom mit einer Dichte von drei Ampere pro Quadratmeter ein, wobei die Oberflächenabmessung durch die einzelne Elektrode definiert wird, auf der die Abscheidung erfolgt. Wenden Sie den Strom zwei Minuten lang an, um eine gemeinsame Ablagerung der Zellen in der Alginatmatrix zu ermöglichen. Spülen Sie die Folie wie zuvor mit Natriumchlorid und schalten Sie den antiken Anschluss auf die benachbarte ITO-Elektrode um.

Wiederholen Sie den Auslegungsvorgang, aber diesmal. Einführung der Lösung, die die Senderzellen enthält. Inkubieren Sie den Zwei-Elektroden-Chip mit den co-abgelagerten Zellen und Calciumargenat über Nacht bei 37 Grad Celsius in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Ergänzt mit 10%LB Medium und einem Millimolar Calciumchlorid. Nach der Inkubation wird der Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, um mit der Abscheidung der Chitosan-Elektrode zu beginnen. Schließen Sie die Stromversorgung an die Elektroden an.

Feuern Sie Krokodilklemmen. Ein goldbeschichteter Siliziumchip fungiert als Kathode und eine Platinfolie als Anode. Positionieren Sie die Oberfläche der Goldelektrode so, dass sie die Gegenelektrode wie zuvor absetzt.

Bereiten Sie eine Kato-Sandlösung vor, indem Sie Kato-Sandflocken in Wasser mischen und langsam zwei molare Chlorwasserstoffe hinzufügen, um die Polysaccharide aufzulösen. Nach dem im Text beschriebenen Verfahren kann die Kato-Sandlösung fluoreszenzmarkiert werden, um den abgeschiedenen Elektrodenfilm durch Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Die Elektroden tauchen in die Kaizan-Lösung vollständig in den gewünschten Bereich für die Abscheidung ein.

Legen Sie zwei Minuten lang einen konstanten Strom an, der mit einer Dichte von vier Ampere pro Quadratmeter berechnet wird, basierend auf der Oberfläche der Arbeitselektroden. In diesem Fall wird ein Strom von 16 Mikroampere an eine vier Quadratmillimeter große Goldelektrode angelegt, die Spannung verschiebt sich im Bereich von zwei bis drei Volt, nachdem die Elektrode mit deionisiertem Wasser gespült wurde, um überflüssiges Chitosan zu entfernen. Fahren Sie fort, den Film mit einem Fluoreszenzmikroskop, Copos-Chitosan und Glukoseoxidase aus einer Lösung mit einer Stromdichte von vier Rampen pro Quadratmeter, die auf eine gemusterte Elektrode aufgetragen wird, abzubilden.

Nach dem Chitosan-Elektrodenabscheidungsverfahren wird ein Kaizan-Film erzeugt, der mit Glukoseoxidase eingeschlossen ist. Befestigen Sie die behandelte Elektrode an einem Drei-Elektroden-System als Arbeitselektrode, einem Platindraht als Gegenelektrode und Silber, Silberchlorid als Referenzelektrode, und tauchen Sie die Elektroden in eine Phosphatpufferlösung, die Natriumchlorid enthält. Konjugieren Sie das Protein elektrochemisch mit dem Kazam-Film, indem Sie nach der Konjugation eine konstante Spannung für 60 Sekunden mit Hilfe der Chronopyrometrie anlegen.

Legen Sie den Chip in Phosphatpuffer und waschen Sie ihn 10 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler, um nicht reaktives Natriumchlorid und unkonjugierte Glukoseoxidase zu entfernen. Bringen Sie das Drei-Elektroden-System wieder an und tauchen Sie eine Lösung von fünf Millimolar Glukose ein. Stellen Sie dann die gewünschten Parameter für die zyklische Lautstärketelemetrie ein, um das Potential in eine positive Richtung auf 0,7 Volt zu schwenken.

Entfernen Sie die Elektroden aus der Glukoselösung und spülen Sie sie mit Phosphatpuffer ab. Dann werden die Elektroden zwischen einem 10-Milliliter-Becherglas mit acht Millilitern Phosphatpuffer auf eine magnetische Rührplattenvorspannung gelegt. Der GOX-Chip funktionalisierte ihn auf 0,6 Volt und diente als Arbeitselektrode.

Nachdem Sie die gewünschten Parameter eingestellt haben, erfassen Sie eine Baseline-Aufzeichnung. Fügen Sie dem Puffer Glukosealiquote hinzu, um die Glukosekonzentration für jedes Aliquot um vier Millimolare zu erhöhen. In diesem Experiment werden dem Puffer 400 Mikroliter Aliquote von 80 Millimolar Glukose zugesetzt. Korrelieren Sie die Stromabgabe mit jeder Glukosekonzentration Um eine Standardkurve zur Durchführung der Proteinfunktionalisierung zu erzeugen, verwenden Sie einen Objektträger, der mit einer angrenzenden Gold- und ITO-Elektrode in A-P-D-M-S strukturiert ist.

Goldelektrode mit einem kathartischen Potential zur Elektrodenabscheidung tizen, wie zuvor gezeigt, gut vorspannen. Nach dem Spülen des Films fügen Sie eine Lösung aus blau fluoreszierend markierter Autoinduktor-Zwei-Synthase hinzu, die mit Tyrosinase ergänzt ist. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Folie wie zuvor mit PBS und legen Sie ein anodisches Potential an die ITO-Elektrode an, die in eine Alginatabscheidungslösung mit Empfängerzellen eingetaucht ist. Fahren Sie mit den gleichen Schritten fort, die in der Co-Abscheidung von Zellpopulationen in Alginat beschrieben sind, um das übertragene Signal enzymatisch zu erzeugen. Nach dem Spülen der Folien wird eine Lösung aus fünf Mikromolaren, SAB und PBS zugegeben, die mit 10 %LB und einem Millimolar ergänzt werden.

Calciumchlorid bedeckt die Elektroden, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern, und inkubiert über Nacht bei 37 Grad Celsius. Dies ermöglicht eine Empfängerzellantwort durch Erzeugung eines rot fluoreszierenden Proteins; DS rot benachbarte Elektroden können mit Fluoreszenzmikroskopie durch Justing abgebildet werden. Die Filter zum Einfangen der blauen Fluoreszenz der ebenfalls induktiven Zwei-Synthase und der roten Fluoreszenz, die von den kooptierten Empfängerzellen induziert wird, auferlegten elektrischen Signalen können lokalisierte Mikroumgebungen in der Nähe einer Elektrodenoberfläche erzeugen, und diese Reize können die Selbstorganisation von Polysacchariden, wie Alginat und Razan, auslösen, um sich als Hydrogelfilm auf der Elektrodenoberfläche abzulagern.

Da dieser Seelengel-Übergang an der Elektrodenoberfläche stattfindet, wird der resultierende Film mit seiner Geometrie, die dem Elektrodenmuster entspricht, elektroadressiert. Mit Hilfe von Alginat wurden einzigartige Zellpopulationen an unterschiedlichen Adressen deponiert. Der Nachweis ihrer Elektrodenadressen wird bei der Interaktion zwischen der Sender- und der Empfängerzellpopulation beobachtet.

Das Molekül Auto Inducer Two diffundiert von den Senderzellen und wird von den Empfängerzellen aufgenommen, was zur Expression des rot fluoreszierenden Proteins DS führt. Hier. Rote Fluoreszenz wird nur an der Elektrode beobachtet, an der die Empfänger adressiert sind. Umgekehrt bietet das Biosensor-Enzym Glukoseoxidase die Möglichkeit, Glukose durch eine enzymatische Reaktion durch die Erzeugung von Wasserstoffperoxid nachzuweisen, das dann elektrochemisch oxidiert werden kann, um einen Ausgangsstrom zu erzeugen.

Auf diese Weise kann ein chemisches Signal in ein elektrisches umgewandelt werden. Diese Grafik zeigt, dass Filme, in denen Geo X chemisch konjugiert wurde, in Gegenwart von Glukose ein starkes antikes Signal erzeugen, im Gegensatz zu Filmen, die kein Geo X enthalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Geo X auf einem abgeschiedenen Zam-Film montiert werden kann und/oder seine katalytische Aktivität beibehält. Darüber hinaus wird eine schrittweise Erhöhung des otischen Stroms als Reaktion auf steigende Glukosekonzentrationen erzeugt.

Die ebenfalls vorhandene Standardkurve zeigt, dass die Stufenerhöhungen in Abhängigkeit von der Menge der zugesetzten Glukose nahezu linear verliefen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Enzym auch bei der Konjugation an den Razza-Film seine Empfindlichkeit beibehält, wie hier dargestellt, die I-Synthase enthält einen Penta-Tyrosin-Tag. Tyrosinase wirkt auf das Tyrosin-Tag und oxidiert die Reste der Phenolgruppen zu o Chinonen, die dann kovalent an das Kasan-Amin binden. Ein Nachweis der Funktionalisierung des Kazam-Films innerhalb der a i zwei Synthase durch Tyrosinase-Assemblierung ist in diesem Fluoreszenzbild zu beobachten, das einen Kaza-Film auf Gold zeigt, wobei die funktionalisierte I zwei Synthase fluoreszierend blau markiert wurde, weil a I zwei Synthase a I zwei aus dem Substrat SAH auf die gleiche Weise erzeugt Als Senderzellen bewirkt die Nähe zu kooptierten Empfängerzellen in Gegenwart von SAH auch, dass die Empfängerzellen fluoreszierend reagieren, indem sie DS exprimieren.

Die rot-rote Fluoreszenz der Empfängerzellen zeigt erneut die Interaktion zwischen den Adressen aufgrund der Diffusion von ai, zwei von einer zur anderen, und zeigt weiterhin, dass 10 Enzyme, die auf Tizen immobilisiert sind, ihre Aktivität beibehalten, sobald sie kovalent gebunden sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Polysaccharidfilme elektroabscheidet und wie man sie mit einer Vielzahl von Techniken funktionalisiert. Wir haben die Vielseitigkeit dieser Funktionalisierungsschritte unter Beweis gestellt, so dass wir in weiteren Tests mit einer Vielzahl von biologischen Komponenten arbeiten können.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, um genau definierte Filmmuster zu erzeugen, auf die biologische Komponenten präzise aufgepfropft werden können. Auf diese Weise sind wir in der Lage, sehr einfach biologisch strukturierte und aktive Oberflächen auf bestimmten Elektroden zu erzeugen, und zwar alles auf organisierte Weise und dennoch in der Lage, komplexe biologische Wechselwirkungen zu erzielen. Nach diesem Verfahren kann Kreativität sowohl bei der Gestaltung des Elektroarrays als auch bei der Auswahl der biologischen Komponenten eingesetzt werden, um die Designinteraktion zu erreichen.

Unsere Hoffnung ist, dass die Biofabrikationswerkzeuge eine Brücke zwischen zwei unterschiedlichen Bereichen schlagen werden, der Biotechnologie und der Mikroelektronik, von denen jeder unser Leben individuell revolutioniert hat. Wir glauben, dass wir durch die Verknüpfung dieser beiden Bereiche neue Lösungen für einige der drängendsten Probleme der Gesellschaft schaffen werden. Zum Beispiel stellen wir uns vor, dass die Biofabrikation einfache und vielseitige Methoden für neue Wege der Erfassung, für den Point-of-Care, die Diagnose von Krankheiten und die Wahrnehmung biologischer und chemischer Bedrohungen bieten könnte.

Ein weitreichendes Beispiel könnte sein, dass der arterielle Stent der nächsten Generation auch in der Lage wäre, Ihr Stoffwechselprofil zu überwachen und Ihre Arterie offen zu halten.