Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, biopolymerische Filme elektrisch abzuscheiden und sie mit biologischen Komponenten wie Proteinen und Zellen zu funktionalisieren. Die Elektroabscheidung wird erreicht, indem man den lokal auftretenden pH-Wert-Wechsel an einer vorgespannten Elektrode in Kombination mit einer pH-empfindlichen Polysaccharidlösung nutzt. Nach Auswahl einer kathodischen oder anodischen Abscheidungsstrategie wird die Elektrode vorgespannt, um einen Sol-Gel-Übergang auszulösen, der einen dünnen Film erzeugt, dessen Muster durch die Elektrodengeometrie definiert ist.

Außerdem können während des Elektrodenabscheidungsprozesses biologische Komponenten wie Proteine und Zellen eingeführt werden. Um die Filme biologisch funktional zu gestalten, werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die biologischen Komponenten aufgrund von Fluoreszenzbildgebung in den Filmen lokalisiert sind. Zusätzlich sind die Komponenten funktionsfähig und können mit ihrer Umgebung interagieren, was durch die elektrochemische Detektion enzymatischer Aktivität und die Verwendung von Reporterzellantworten belegt wird.

Die Biofabrikation stellt eine neuartige Werkzeugkiste zur Schaffung der Schnittstelle zwischen Biologie und Elektronik bereit. Wir sind der Ansicht, dass ihre Hauptvorteile in der Einfachheit und der Fähigkeit zur Montage unter annähernd physiologischen Bedingungen liegen. Die Biologie beherrscht die Herstellung im Nanomaßstab durch Selbstorganisation und enzymatische Prozesse. Indem wir diese Fähigkeiten nutzen, umgehen wir komplexe, gefährliche und zeitaufwändige Synthesemethoden, wie sie von anderen Montagetechniken eingesetzt werden.

Unser gemeinsames Team kam auf die Idee, die BioD-Geräteschnittstelle unter Verwendung biologischer Materialien und Mechanismen aufzubauen, als wir beobachteten, dass sich ihre Drachen in einer elektrodenabscheidbaren Form befinden könnten. Kitan ist ein pH-empfindlicher, filmgebildender Polysaccharid, der elektrische Signale des Geräts erkennen und sich als dünner Film ablagern kann. Nachdem wir erkannt hatten, dass Kitan elektrodenabscheidbar ist, wurde uns bewusst, dass wir auf ein breiteres Spektrum an Werkzeugen aus der Biochemie und Molekularbiologie zugreifen könnten, um eine BioD-Geräteschnittstelle zu konstruieren.

Die Anwendung einer solchen Technik erstreckt sich auf Lab-auf-Chip-Systeme, bei denen funktionelle biologische Komponenten erforderlich sind, da sie eine kostengünstige und einfache Möglichkeit bieten, solche Komponenten auf einer Elektrode zu lokalisieren, wo sie lebensfähig bleiben können. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da ein biofabrizierter Film empfindlich und leicht beschädigt werden kann. Daher ist Vorsicht geboten, um beim Waschen oder Aufbringen des Films nicht zu grob vorzugehen.

Da der Film leicht gestört werden könnte. Als Vorteil lässt sich der Elektroden jedoch wiederverwenden, da der Film leicht entfernt werden kann. Um dieses Protokoll zu beginnen, schließen Sie eine Stromversorgung über Steckerkabel mit Krokodilklemmen an die selbstgefertigten Elektroden an.

Eine mit Indium-Zinn-Oxid oder ITO beschichtete Glasplatte dient als Anode oder Arbeitselektrode; Platinfoil dient als Kathode oder Gegenelektrode. Positionieren Sie die Elektroden so, dass die zu funktionalisierende Oberfläche des ITO der Gegenelektrode gegenübersteht, wobei die ITO-Oberfläche entweder vertikal zum Eintauchen in die Lösung oder horizontal ausgerichtet ist, sodass die Lösung auf der Oberfläche gehalten werden kann. Bereiten Sie anschließend eine Alginatelektroabscheidungslösung vor, indem Sie 1 % Alginate und 0,5 % Calciumcarbonat in destilliertem Wasser mischen und das Gemisch autoklavieren. Markieren Sie das Alginate anschließend fluoreszenzfarben mit Fluorosphären durch Mischen und Wirbeln.

Dies ermöglicht die Fluoreszenz-Bildgebung des resultierenden Films. Nach der Autoklavierung wird die Lösung hergestellt, beide Elektroden in die vorbereitete Abscheidungslösung getaucht und eine konstante Stromdichte von drei Ampere pro Quadratmeter für zwei Minuten angelegt. Die Spannung verschiebt sich im Bereich von zwei bis drei Volt. Nach zwei Minuten wird die Elektrode abgetrennt und die nicht abgelagerte Lösung entfernt. Der Film wird vorsichtig mit Natriumchlorid gespült, um überschüssiges Alginsäure-Natrium zu entfernen.

Das Film kurz in 0,1-molarer Calciumchloridlösung inkubieren, um das Gel zu verstärken. Anschließend den Film in der gewünschten Lagerungslösung inkubieren. Danach den Film mittels Fluoreszenzmikroskopie abbilden, bevor eine gleichzeitige Abscheidung erfolgt.

Züchten Sie eine Signal sendende Zellkultur und eine Signal empfangende Zellkultur gemäß der schriftlichen Anleitung, die diesem Video beiliegt. Bereiten Sie anschließend eine Depositionslösung aus Alginate und Calciumcarbonat vor. Mischen Sie die Lösung im Verhältnis 1:1 mit jeder Zellkultur, sodass eine Endkonzentration von 1 % Alginate und 0,5 % Calciumcarbonat erreicht wird, wobei die Zellen auf etwa die halbe Kulturdichte verdünnt werden.

Verwenden Sie einen Glasobjektträger, der mit zwei ITO-Elektroden ausgestattet ist und von einem Polydimethylsiloxan-Gefäß umgeben ist, sowie eine Platinkounter-Elektrode. Schließen Sie eine ITO-Elektrode und die Platinelektrode an eine Stromquelle an. Tauchen Sie die Elektroden wie zuvor in die Abscheidungslösung, die die Empfängerzellen enthält, ein.

Stellen Sie die Stromversorgung auf einen konstanten Strom mit einer Dichte von drei Ampere pro Quadratmeter ein, wobei die Oberflächendimension durch die einzelne Elektrode definiert ist, auf der die Abscheidung erfolgen soll. Leiten Sie den Strom zwei Minuten lang, um eine gleichzeitige Abscheidung der Zellen in der Alginate-Matrix zu ermöglichen. Spülen Sie den Film wie zuvor mit Natriumchlorid ab und wechseln Sie die Stromzuführung zur benachbarten ITO-Elektrode.

Wiederholen Sie den Abscheideprozess, diesmal jedoch unter Zugabe der Lösung, die die Senderzellen enthält. Inkubieren Sie den zwei-Elektroden-Chip mit den gemeinsam abgeschiedenen Zellen und Calciumargenat über Nacht bei 37 Grad Celsius in phosphatgepufferter Salzlösung.

Versetzt mit 10 % LB-Medium und einem Millimolar Calciumchlorid. Nach der Inkubation das Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden, um die Abscheidung der Chitosan-Elektrode zu beginnen. Die Stromversorgung mit den Elektroden verbinden.

Feuer-Alligatorclips. Eine mit Gold beschichtete Siliziumchip fungiert als Kathode und eine Platinfoilie dient als Anode. Positionieren Sie die goldene Elektrodenoberfläche so, dass sie die Gegenelektrode wie zuvor abscheidet.

Bereiten Sie eine Kato-Sand-Lösung vor, indem Sie Kato-Sand-Flakes in Wasser geben und langsam zweimolares Salzsäure hinzufügen, um die Polysaccharide aufzulösen. Wie im Text beschriebene Verfahren befolgend, kann die Kato-Sand-Lösung fluoreszenzmarkiert werden, um den auf der Elektrode abgeschiedenen Film mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Anschließend werden die Elektroden vollständig in die Kaizan-Lösung getaucht, wobei der gewünschte Bereich für die Abscheidung vollständig untergetaucht sein muss.

Wenden Sie zwei Minuten lang einen konstanten Strom an, der anhand einer Stromdichte von vier Ampere pro Quadratmeter, bezogen auf die Oberfläche der Arbeitselektrode, berechnet wird. In diesem Fall wird ein Strom von 16 Mikroampere auf eine vier Quadratmillimeter große Goldelektrode angelegt; die Spannung verschiebt sich im Bereich von zwei bis drei Volt. Spülen Sie anschließend die Elektrode mit entionisiertem Wasser, um überschüssiges Chitosan zu entfernen. Fahren Sie fort, den Film mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, und ko-ponieren Sie Chitosan und Glucose-Oxidase aus einer Lösung bei einer Stromdichte von vier Ampere pro Quadratmeter auf eine strukturierte Elektrode.

Gemäß dem Abscheidungsverfahren für Chitosan-Elektroden wird ein Kaizan-Film, der Glucose-Oxidase einschließt, erzeugt. Befestigen Sie die behandelte Elektrode an einem Dreielektrodensystem als Arbeitselektrode, einen Platindraht als Gegenelektrode und Silber, Silberchlorid als Bezugselektrode. Tauchen Sie die Elektroden in eine Phosphatpufferlösung, die Natriumchlorid enthält. Koppeln Sie das Protein elektrochemisch an den Kaizan-Film, indem Sie mittels Chronoamperometrie eine konstante Spannung für 60 Sekunden anlegen, nach der Koppellung.

Legen Sie den Chip in Phosphatpuffer und waschen Sie ihn 10 Minuten lang auf einem Rotationserschütterer, um nicht umgesetztes Natriumchlorid und nicht konjugierte Glucose-Oxidase zu entfernen. Befestigen Sie das Dreielektrodensystem erneut und tauchen Sie es in eine Lösung mit fünf Millimolar Glucose. Stellen Sie dann die gewünschten Parameter für die zyklische Voltammetrie ein, um das Potential in positiver Richtung auf 0,7 Volt zu erhöhen.

Entfernen Sie die Elektroden aus der Glucoselösung und spülen Sie sie mit Phosphatpuffer ab. Danach platzieren Sie die Elektroden in einem 10-Milliliter-Becher, der acht Milliliter Phosphatpuffer enthält, auf einer magnetischen Rührplatte. Legen Sie am GOX-funktionellisierten Chip 0,6 Volt an, um ihn als Arbeitselektrode zu verwenden.

Nachdem die gewünschten Parameter eingestellt wurden, nehmen Sie eine Basislinienaufnahme vor. Geben Sie Aliquote von Glukose zum Puffer hinzu, um die Glukosekonzentration um jeweils vier Millimolar zu erhöhen. In diesem Experiment werden 400-Mikroliter-Aliquote einer 80-Millimolar-Glukoselösung zum Puffer hinzugefügt. Korrelieren Sie das Stromausgangssignal mit jeder Glukosekonzentration, um eine Standardkurve zu erstellen. Zur Durchführung der Protein-Funktionalisierung verwenden Sie einen Glasobjektträger, der mit benachbarten Gold- und ITO-Elektroden in A-P-D-M-S strukturiert ist.

Biase die Gold-Elektrode mit einem kathodischen Potential, um Tizen wie zuvor gezeigt elektrochemisch abzuscheiden. Nach dem Spülen des Films füge eine Lösung aus blau fluoreszenzmarkierter Autoinduktor-2-Synthase, angereichert mit Tyrosinase, hinzu. Anschließend einestündige Inkubation bei Raumtemperatur.

Spülen Sie den Film wie zuvor mit PBS, und legen Sie ein anodisches Potential an die in eine Alginate-Abscheidungslösung getauchte ITO-Elektrode an, die Empfängerzellen enthält. Fahren Sie mit den gleichen Schritten fort, die unter der Co-Abscheidung von Zellpopulationen in Alginate beschrieben sind, um das übertragene Signal enzymatisch zu erzeugen. Nach dem Spülen der Filme geben Sie eine Lösung aus fünf Mikromolar SAH in PBS, ergänzt mit 10 % LB-Medien und einem Millimolar, hinzu.

Calciumchlorid bedeckt die Elektroden, um die Verdunstung der Lösung zu verhindern, und inkubiert über Nacht bei 37 Grad Celsius. Dies ermöglicht eine Antwort der Empfängerzellen durch die Expression des roten fluoreszierenden Proteins DS-Red. Angrenzende Elektroden können mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, indem die Filter angepasst werden, um die blaue Fluoreszenz des Induktors Two Synthase sowie die rote Fluoreszenz der umprogrammierten Empfängerzellen einzufangen. Angelegte elektrische Signale können lokalisierte Mikroumgebungen nahe der Elektrodenoberfläche erzeugen, und diese Stimuli können die Selbstassemblierung von Polysacchariden wie Alginate und Razan auslösen, die sich als Hydrogelschicht auf der Elektrodenoberfläche ablagern.

Da dieser Sol-Gel-Übergang an der Elektrodenoberfläche stattfindet, wird der resultierende Film elektrisch adressiert, wobei seine Geometrie dem Elektrodenmuster entspricht. Mithilfe von Alginate wurden bereits einzelne Zellpopulationen an separaten Adressen gemeinsam abgeschieden. Hinweise auf ihre elektrische Adressierung zeigen sich beim Zusammenspiel zwischen der sendenden und der empfangenden Zellpopulation.

Das Molekül Autoinduktor zwei diffundiert aus den Senderzellen heraus und wird von den Empfängerzellen aufgenommen, was zur Expression des DS-red-Fluoreszenzproteins führt. Hier wird rote Fluoreszenz nur an der Elektrode beobachtet, an der die Empfänger adressiert sind. Umgekehrt verleiht das Biosensor-Enzym Glucose-Oxidase die Fähigkeit zur Glukosedetektion durch eine enzymatische Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid gebildet wird, das anschließend elektrochemisch oxidiert werden kann, um einen Ausgangsstrom zu erzeugen.

Auf diese Weise kann ein chemisches Signal in ein elektrisches umgewandelt werden. Diese Darstellung zeigt, dass Filme, in denen Geo X chemisch konjugiert wurde, ein starkes Antisignal in Gegenwart von Glukose erzeugen, im Gegensatz zu Filmen ohne Geo X. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Geo X auf einem abgeschiedenen Zam-Film angeordnet werden kann und dabei katalytische Aktivität behält. Darüber hinaus wird eine stufenförmige Zunahme eines otischen Stroms als Reaktion auf steigende Glukosekonzentrationen erzeugt.

Die ebenfalls dargestellte Standardkurve zeigt, dass die Anstiege nahezu linear verliefen und von der Menge des zugegebenen Glukoses abhängig waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Enzym auch nach der Konjugation an den Razza-Film seine Empfindlichkeit beibehält, wie hier dargestellt; die I-zwei-Synthase enthält ein Penta-Tyrosin-Tag. Tyrosinase wirkt auf das Tyrosin-Tag ein und oxidiert die Phenolgruppen der Reste zu o-Chinonen, die dann kovalent an die Amingruppen von Kazam binden. Ein Hinweis auf die Funktionalisierung des Kazam-Films innerhalb der a-i-zwei-Synthase durch die Tyrosinase-Assembly ist in diesem Fluoreszenzbild zu erkennen, das einen Kaza-Film auf Gold zeigt, wobei die funktionalisierte I-zwei-Synthase blau fluoreszenzmarkiert wurde. Da die I-zwei-Synthase aus dem Substrat SAH I-zwei auf die gleiche Weise wie die Senderzellen erzeugt, führt ihre Nähe zu gekoppelten Empfängerzellen in Gegenwart von SAH ebenfalls dazu, dass die Empfängerzellen fluoreszierend reagieren, indem sie ds exprimieren.

Die erneute rote Fluoreszenz der Empfängerzellen zeigt die Wechselwirkung zwischen den Adressen aufgrund der Diffusion von ai-2 von einer zur anderen an und weist zudem darauf hin, dass die an Titanzioxid immobilisierten Enzyme ihre Aktivität nach kovalenter Bindung beibehalten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Polysaccharidfilme elektrochemisch abscheidet und wie man sie mithilfe einer Vielzahl von Methoden funktionalisiert. Wir haben die Vielseitigkeit dieser Funktionalisierungsschritte demonstriert, wodurch wir mit einer Vielzahl biologischer Komponenten in weiteren Untersuchungen arbeiten können.

Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, kann sie in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, um gut definierte Filmstrukturen herzustellen, auf die biologische Komponenten präzise aufgepfropft werden können. Auf diese Weise können wir sehr einfach biologisch strukturierte und aktive Oberflächen auf bestimmten Elektroden erzeugen, alles auf organisierte Weise und dennoch in der Lage, komplexe biologische Wechselwirkungen zu erzielen. Nach diesem Verfahren kann sowohl bei der Gestaltung des Elektrodenarrays als auch bei der Auswahl der biologischen Komponenten Kreativität angewendet werden, um die gewünschte Wechselwirkung zu erreichen.

Unsere Hoffnung ist, dass die Biofabrikationswerkzeuge zwei unterschiedliche Bereiche – die Biotechnologie und die Mikroelektronik – miteinander verbinden werden, von denen jeder für sich genommen unser Leben revolutioniert hat. Durch die Vernetzung dieser beiden Bereiche glauben wir, neue Lösungen für einige der dringendsten Probleme der Gesellschaft schaffen zu können. Beispielsweise stellen wir uns vor, dass die Biofabrikation einfache und vielseitige Methoden für neuartige Sensormethoden bieten könnte, für die Anwendung direkt am Patienten, die Diagnose von Krankheiten sowie die Detektion biologischer und chemischer Gefahrenstoffe.

Ein weiterreichendes Beispiel könnte sein, dass der arterielle Stent der nächsten Generation nicht nur Ihre Arterie offen hält, sondern auch in der Lage ist, Ihr metabolisches Profil zu überwachen.