Eine praktische und neuartige Methode, um genomische DNA aus Blutentnahme Kits Auszug für Plasma Protein Preservation

In diesem Video wird eine praktische und neuartige Methode zur Extraktion genomischer DNA aus dem neuen BDP 100-Plasmaprotein-Stabilisierungssystem, bekannt als P 100-Röhrchen, beschrieben. Die Extraktion aus Serum- und Plasmaröhrchen war bisher ein gängiges Verfahren, doch die Kombination dieses neuen P 100-Röhrchens mit der hier vorgestellten Extraktionsmethode bietet einen neuartigen, einfacheren Ansatz, um DNA von besserer Qualität mit deutlich weniger Aufwand zu gewinnen. Die Innenseite des P 100-Röhrchens ist mit Kalium-EDTA und Proteaseinhibitoren beschichtet.

Dies verhindert die Gerinnung und stabilisiert die Plasmaproteine. Das Blut wird in diesen Röhrchen gesammelt, um nach der Zentrifugation Plasma für Tests zu gewinnen. Das in einem P 100 enthaltene Blut trennt sich in Schichten aufgrund der Dichte: oben das Plasma, darunter die weißen Blutkörperchen und ganz unten die roten Blutkörperchen.

Die Bürstenspitze zwischen diesen beiden Schichten. Die Gewinnung von Plasma ist in der Regel der primäre Verwendungszweck dieser Röhrchen. Mit diesem Plasma werden mehrere Messungen durchgeführt, wie beispielsweise die Bestimmung von Antikörper- und Proteinspiegeln.

Die Büffy-Schicht wird im Allgemeinen verworfen, enthält aber, wie in diesem Video gezeigt wird, ausreichend DNA für mehrere Analysen, einschließlich Sequenzierung, Genotypisierung, Identifizierung von Biomarkern und so weiter. P-one-Hunderter bestehen aus drei Hauptkomponenten: Kappe, Röhrchen und Separator. Der mechanische Separator wandert direkt oberhalb der Büffy-Schichtlage.

Um Zugang zum Buffy-Coat zu erhalten, ist es notwendig, den Abstand vom Separator zum Buffy-Coat zu vergrößern. Dies wird durch die Zugabe von 17% Sucrose erreicht. Normalerweise wird der Buffy-Coat zusammen mit der P 102 verworfen, aber wie in diesem Video gezeigt wird, ist es möglich, aus dieser Schicht leicht genügend DNA zu gewinnen, um mehrere analytische Tests durchzuführen, bevor die P 100-Röhrchen aus dem minus 80 Gefrierschrank entnommen werden.

Erhitzen Sie ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius, stellen Sie jedes P-100-Röhrchen in das heiße Wasserbad und inkubieren Sie es etwa fünf Minuten lang, um alle Proben aufzutauen. Sobald alle Proben vollständig aufgetaut sind, muss das verbleibende Serum oberhalb der Trennschicht entfernt werden. Danach werden 5 Milliliter 17 %iger Saccharose oberhalb der Trennschicht hinzugefügt. Nach dem Zugabe der Saccharose zentrifugieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang bei 2.500 ×g. Da sich die Trennschicht nun an der Spitze des Röhrchens befindet und vom Buffy Coat getrennt ist, kann sie leicht entfernt werden.

Sprühen Sie 70 % Ethanol auf ein Chem-Tuch und sterilisieren Sie einen Büroklammerhaken, indem Sie die gesamte Oberfläche gründlich abwischen. Halten Sie die P-100-Röhre unter einem Winkel von 45 Grad mit der sterilisierten Büroklammer. Beginnen Sie damit, den Trenner aus der Röhre zu entfernen, indem Sie vorsichtig am Rand des Trenners ziehen und ihn in eine Bioabfalltüte führen.

Wenn die Trennschicht entfernt ist, entfernen Sie so viel wie möglich von der 17 %igen Saccharoselösung, ohne die Büffel- oder Erythrozytenschicht zu stören. Die Büffelschicht sollte nun die oberste Schicht im Reagenzglas sein. Überführen Sie diese Schicht in ein neues, beschriftetes kegelförmiges 15-Milliliter-Gefäß. Die Menge der Büffelschicht, die aus jedem Reagenzglas entnommen wird, variiert, sollte jedoch unter drei Milliliter liegen.

Um das Volumen aller Röhrchen zu normalisieren, geben Sie so viel PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) hinzu, dass das Volumen jedes Röhrchens drei Milliliter beträgt. Da nun alle Buffy-Coats in einem gleichen Volumen suspendiert sind, müssen verbleibende rote Blutkörperchen durch Zugabe von neun Millilitern Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC-Lysis-Lösung) entfernt werden.

Anschließend die Röhrchen mehrmals umkehren und während einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mischen, um die lysierten roten Blutkörperchen vom Buffy Coat zu trennen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 2.500 ×g, wodurch sich ein Pellet bildet, aus dem die DNA extrahiert wird. Gießen Sie die Überstände aus jedem Röhrchen in einen flüssigen Bioabfallbehälter, wobei ein kleines Restvolumen zurückbleibt, in dem das Pellet resuspendiert wird. Vortexen Sie das Röhrchen, um das Pellet zu lösen und erneut aufzuschwemmen.

Gegeben Sie drei Milliliter Zelllyselösung hinzu und wirbeln Sie mindestens 10 Sekunden intensiv. Nach der Zelllyse sind Proteine und DNA nun frei in der Lösung suspendiert und müssen getrennt werden. Beginnen Sie mit der Fällung der Proteine unter Verwendung von einem Milliliter Proteinfällungslösung und wirbeln Sie erneut mindestens 15 Sekunden stark. Zentrifugieren Sie die Röhrchen anschließend fünf Minuten bei 2.500 ×g, um die Proteine als Pellet abzutrennen.

Führen Sie die Schritte entsprechend durch. Beschriften Sie ein 15-Milliliter-Konischgefäß für jede Probe, die in jedes neue Röhrchen verarbeitet wird. Überführen Sie drei Milliliter 100 % Isopropanol.

Nachdem die Proteine ausgefällt und zentrifugiert wurden, sollte jedes Gefäß einen relativ großen Pellet und einen klaren, weitgehend wässrigen Überstand aufweisen. Dekantieren Sie den DNA-haltigen Überstand jedes Gefäßes in das entsprechende zuvor für die letzte Zentrifugation vorbereitete Isopropanol-Gefäß. Das Isopropanol bewirkt, dass die DNA in der Lösung ausfällt und als kleine, weiße, fadenförmige Strukturen sichtbar wird. Invertieren Sie alle Gefäße 50-mal, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie danach alle Gefäße drei Minuten lang bei 2.500 × g, um einen DNA-Pellet zu bilden. Die DNA ist gewöhnlich als kleiner, weißer Pellet am Boden des Gefäßes sichtbar. Bei einer geringen DNA-Ausbeute kann der Pellet jedoch mit bloßem Auge unsichtbar sein. Setzen Sie alle Extraktionen fort, bis die Konzentrationen gemessen wurden.

Unabhängig vom Vorhandensein eines DNA-Pellets wird das Isopropanol verworfen. Spülen Sie die DNA durch Zugabe von 70 %igem Ethanol. Dadurch werden verbleibende unerwünschte Bestandteile entfernt, die möglicherweise die spätere Analyse stören könnten. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 2.500 ×g. Um sicherzustellen, dass das DNA-Pellet gut am Röhrchenboden haftet, wird der gesamte Überstand mit 70 %igem Ethanol entfernt und das Röhrchen anschließend auf ein sauberes Papierhandtuch gestellt, um eine Stunde lang lufttrocknen zu lassen.

Beim Fortsetzen des Protokolls sollte kein sichtbares Ethanol mehr in den Röhrchen vorhanden sein. Der letzte Schritt der Extraktion besteht in der Resuspendierung der DNA in einer Lösung. Sowohl DNA-Hydratationslösung als auch Wasser sind für die meisten Extraktionen geeignete Optionen.

Fügen Sie 250 Mikroliter DNA-Hydrationslösung weniger hinzu für Proben, die wenig oder keine sichtbaren DNA-Fäden oder -Pellets bilden, und wirbeln Sie die DNA vorsichtig und schrittweise mit einem Vortex-Mischer, um sie aufzususpenderen. Überführen Sie abschließend die gesamte aufgeschwemmte DNA in ein Zentrifugenröhrchen. An diesem Punkt können Konzentration und Reinheit der DNA mit einem NanoDrop-Gerät oder einem anderen Spektrophotometer gemessen werden.

Im Allgemeinen wird die Reinheit der DNA nahe derjenigen liegen, die direkt aus Vollblut gewonnen wurde, das in Kalium-EDTA-Röhrchen gesammelt wurde, ausschließlich zum Zweck der DNA-Gewinnung. Die DNA-Konzentration hängt von der Menge des Ausgangsmaterials ab und kann zwischen 50 Nanogramm pro Mikroliter und nahezu 1000 Nanogramm pro Mikroliter liegen, wobei sie im Durchschnitt im Bereich von 200 Nanogramm pro Mikroliter liegt. Der Vorteil der Anwendung dieses Protokolls ist zweifach. Erstens ermöglicht es Ärzten, eine einzige Blutentnahme für zwei klinische Tests zu nutzen, anstatt zweimal Blut abnehmen zu müssen.

Zweitens vereinfacht es den Zugang zu DNA-haltigen Zellen, indem moderne mechanische Trennröhrchen anstelle früherer Generationen verwendet werden. Bei Gel-Trennröhrchen der vorherigen Generation bildeten sowohl der Geltrenner selbst als auch ein Blutgerinnsel Barrieren für die DNA-haltigen Zellen. Bei P 100-Röhrchen lässt sich der mechanische Trenner durch Dichtetrennung mit 17 % Saccharose leicht entfernen.

Dies ist eine Bildschirmaufnahme der NanoDrop-Messung einer durchschnittlichen DNA-Extraktion. Bei dieser Methode pro Probe P 109 ergab die Extraktion eine 250 Mikroliter umfassende Lösung mit einer Konzentration von 209 Nanogramm pro Mikroliter DNA. Die Gesamtausbeute betrug etwa 52 Mikrogramm.

Das Verhältnis von 260 zu 280, das primäre Maß für die DNA-Reinheit, lag mit 1,88 im optimalen Bereich von 1,8 bis 1,9. Ein sekundäres Maß für die DNA-Reinheit, das Verhältnis von 260 zu 230, befand sich mit 2,35 nahe dem erwarteten Bereich von 2,0 bis 2,2.

Das sind ziemlich typische Ergebnisse. In der Praxis variieren die Extraktionen hinsichtlich Ausbeute und Qualität, abhängig vom Volumen und Zustand des Blutes vor der Extraktion, unter Verwendung der standardmäßigen Gelelektrophorese mit Thio-Bromid-Färbung. Weitere Qualitätsprüfungen zeigen, dass genomische DNA, die aus P 100-Röhrchen gewonnen wurde, genauso intakt ist wie DNA, die aus Vollblut extrahiert wurde.

Dies zeigt sich anhand des hellen, dicken Bandes, der an der Oberseite jeder Spur erscheint, die genomische DNA enthält. Die Verwendung dieses Protokolls anstelle früherer Methoden bietet zwei wesentliche Vorteile. Erstens kombiniert es, was typischerweise zwei Blutentnahmen wären, in einer einzigen Entnahme.

Zweitens ist dieses Protokoll schneller und sauberer als ein Protokoll, das typische SST-Gel-Trennröhrchen beinhaltet. Um die Notwendigkeit zu umgehen, regelmäßig geronnenes Blut aufzubrechen, entnehmen Ärzte routinemäßig zwei Blutröhrchen, wenn genetische und serologische Tests erforderlich sind. Üblicherweise wird ein SST-Gel-Trennröhrchen, auch „Goldkappe“ genannt, und ein Kalium-EDTA-Röhrchen, die „Violette“ genannt wird, verwendet: Die Serumprobe wird aus dem SST-Röhrchen gewonnen und die DNA aus dem EDTA-Röhrchen extrahiert. Bei dieser Methode muss lediglich ein einziges rotes P-100-Röhrchen entnommen werden.

Während Einrichtungen, die mit der Gelelektrophorese-Methode zur DNA-Extraktion vertraut sind, möglicherweise bereits eine Röhrchenentnahme für serologische und genetische Tests durchführen, stellt die hier vorgestellte Methode eine schrittweise, aber wesentliche Verbesserung gegenüber diesen bestehenden Gelelektrophorese-Methoden dar. Beide Methoden erfordern das Entfernen einer Art Trennschicht, wobei Gele im Allgemeinen unordentlicher sind als kunststoffbasierte Trennschichten.

Separatorröhrchen erfordern, dass geronnenes Blut vor der DNA-Extraktion durch ein Drahtsieb homogenisiert wird. Diese Homogenisierung kann unübersichtlich sein, und die DNA-Extraktion erweist sich als schwieriger, wenn eine nennenswerte Menge roter Blutkörperchen, die keine DNA enthalten, vorhanden ist. Diese P 100-Extraktionsmethode ermöglicht die Trennung von DNA-haltigen weißen Blutkörperchen vom Hämatokrit und lässt nur wenige rote Blutkörperchen zurück, die die DNA-Extraktion stören könnten.

Das System, DNA aus einer P 100-Plasmaröhrchen anstelle von Gel-Trennröhrchen der vorherigen Generation zu gewinnen, bietet zahlreiche Vorteile. P 100-Röhrchen enthalten EDTA, das magnesiumabhängige Endonukleasen hemmt, sowie Antikoagulanzien zur Verhinderung der Blutgerinnung. Das Endergebnis ist eine höhere DNA-Integrität bei einem deutlich einfacheren Extraktionsverfahren, insbesondere durch die Vermeidung des Zerstörens und Homogenisierens geronnenen Blutes.

Zusätzlich kann das plasmadepletierte Blut unbegrenzt bis zu drei Jahre lang in P100s gelagert werden, bis die DNA-Extraktion gewünscht ist. Darüber hinaus könnten Ärzte nützlichere Patientendaten mit weniger Blutentnahmen generieren und somit die Belastung für die Patienten, die den Verfahren unterzogen werden, verringern.