Name: Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Lernen Sie die Ex-vivo-Kultivierung ganzer Drosophila-Gehirne für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Analysen neuronaler Entwicklungsprozesse im Pilzkörper.

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Wir möchten alle Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Beratung, die hilfreichen Diskussionen und Kommentare zum Manuskript danken. Wir würden uns auch besonders gerne Marta Koch und Bassem Hassan für den ausgezeichneten Vorschlag, dass wir warten, bis 1,5 Stunden vor dem Sezieren APF Gehirne für die Kultivierung im Umbau Experimente danken. Wir danken auch dem NHGRI bildgebenden Einrichtung für die Nutzung ihrer konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der Basic Neuroscience Program der NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106) unterstützt.

A. Herstellung der Medien <ol><li> Planen kompletten Medien durch das Filter-Sterilisation Drosophila Schneider Medien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Die Medien sollten jedes Mal frisch zubereitet werden. Alternativ kann ein frisches Aliquot der vorgefrorene Medien vor jedem Gebrauch aufgetaut werden. </li><li> Vor der Kultivierung, fügen Sie 10 pg / ml Insulin und 2 pg / ml Ecdyson zu den Medien. Die Medikamente wurden als konzentrierte Bestände vorbereitet und in kleinen Portionen tiefgefroren. Aliquote aufgetaut waren nicht wieder eingefroren werden. </li><li> Alle arbeiten Lösungen sollten bei 25 ° C gehalten werden </li></ol> Die Züchtung von Larven Brains 1. Auswahl und Präparation der Larven Brains <ol><li> Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern. </li><li> Fügen Sie eine kleine Menge von präparierten Medien zu einer Dissektion Uhrglas. </li><li> Usingen einen kleinen Spachtel, abholen wandernden dritten Larvenstadium und legen Sie sie in das Uhrglas. (Wir gehen davon aus, dass die Ex-vivo-Kultur-Methode würde genauso gut auf erste oder zweite Larvenstadium, aber wir haben nicht getestet.) </li><li> Halten Sie das hintere Ende der Larve mit einer Pinzette vorsichtig öffnen, das vordere Ende mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange. </li><li> Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt. </li></ol> 2. Ex vivo Kultivierung der zerlegten Larven Brains <ol><li> Mit Pre-nass Pipettenspitzen, übertragen das Gehirn vorsichtig in die Zellkultur-Einsätzen, mit den Medien bereits ausgefüllt. </li><li> Transfer-Gehirn, in den Medien, zu einem Brutschrank bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist. Diese Methode funktioniert effizient für bis zu 48 h in Kultur. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien alle 5-6 Stunden. </li></ol> 3. Pharmakologische Manipulation vonLarven Brains Diese Methode der Ex-vivo-Kultivierung verwendet werden, um pharmakologisch bestätigen genetischen Interaktionen zuvor in unserem Labor 1 nachgewiesen werden. <ol><li> In 100 uM Roscovitin und 100 uM Olomoucin auf vorbereitete Medien. </li><li> Übertragen Sie sezierten Gehirne zu diesem Medium. </li><li> Kultur Gehirn bei 25 ° C für 24 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien (mit Drogen) alle 5-6 Stunden. </li></ol> Die Anzucht von Puppenstadium Brains 1. Die Auswahl der Puppen für Dissection <ol><li> Mark White Puppen auf Flaschen / Vials. </li><li> Wählen Sie nur Puppen, die komplett weiß sind. Puppen mit jeder Art von Färbung sollten nicht einbezogen werden. </li><li> Diese Phase ist 0 Stunden Nach Puparium Formation (APF). </li><li> Diese Puppen werden bereit sein für die Dissektion 1,5 Stunden nach der Markierung. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Entwicklungsstörungen Rebschnitt erfolgt in ex vivo </em&gt; Kultur. </li></ol> 2. Dissektion der Puppen <ol><li> Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. (Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern). </li><li> Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht worden ist, eine kleine Menge von zubereiteten Medien zu einer Dissektion Uhrglas. </li><li> Mit einem kleinen, nassen Spachtel, abholen Puppen zuvor für die Dissektion markiert und legen Sie sie in das Uhrglas. </li><li> Halten Sie das hintere Ende der Puppen mit einer Pinzette, öffnen Sie vorsichtig das vordere Ende der Puppe Fall mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange. </li><li> Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt und angeschlossen. </li></ol> 3. Ex vivo Kultivierung von Dissected Puppenstadium Brains <ol><li> Übertragen des Gehirns vorsichtig in die Zellkultur-Inserts, mit Medien vorgefüllt. </li><li> Übertragen Gehirn, in den Medien, in einen Inkubator bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-pSalben erreicht ist. Wir verwendeten diese Methode bis zu 10 Stunden in Kultur für das gezeigte Experiment, aber es können längere Beobachtung und Behandlung verlängert werden, wenn nötig. </li><li> Für Zeit-Punkte mehr als 8 Stunden APF, Medien ersetzen alle 5-6 Stunden. </li></ol> Von diesem Schritt auf, bleibt das Protokoll unverändert sowohl für Larven und Puppen. B. Befestigung Dissected Brains <ol><li> Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist, zu entfernen Medien und fügt 500 ul 4% Formaldehyd in 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST) für 30 Minuten, Ersetzen mit frischem Formaldehyd nach 15 Minuten. </li><li> Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, Hirn, um zu trocknen, während Ersatz von Medien mit Fixativ. </li><li> Abwaschen Formaldehyd mit vier 10-minütige Waschungen von 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST). </li></ol> C. Färbung Feste Brains <ol><li> Nach Formaldehyd gewaschen worden ist ausgeschaltet, blockiert Gehirne für 1 Stunde in einer Blocking-Lösung aus 1x PBS mit 1% NormalZiegenserum und 1% Rinderserumalbumin. </li><li> In primären Antikörper in Blockierungslösung gemacht. </li><li> Inkubieren Gehirne über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Morgen abwaschen primäre Antikörper mit vier 10-minütige Waschungen PBST. </li><li> Fügen Sie Sekundärantikörper in Blocking-Lösung gemacht. </li><li> Lassen Sie bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li><li> Abwaschen Sekundärantikörper mit vier 10 minütige Waschungen PBST. </li></ol> D. Montage fixiert und gefärbt Brains für die Mikroskopie <ol><li> Äquilibrieren Gehirne in Vectashield Eindeckmittel für 1 Stunde. </li><li> Montieren Gehirne auf Glasplättchen mit den Medien Vectashield Montage. </li><li> Legen Glaschips auf beiden Seiten des Gehirns vor der Montage des Deckglases. Dies verhindert, dass die Gehirne nicht gequetscht, unter Beibehaltung Probe dünn genug, um alle Fokalebenen mit einem konfokalen Mikroskop zu scannen. Brains waren grob orientiert sich bei der Montage zu erleichtern Betrachtung der Merkmale von Interesse. Wenn nötig,Gehirn Bilder waren verdreht Imaris Software, um eine optimale Sicht für die Dokumentation und Messung zu liefern. </li><li> Seal Deckgläser mit klarem Nagellack. </li><li> Shop gleitet weg vom Licht. </li></ol> E. repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt ein Panel von dritten Larvenstadium larvalen Gehirnen von (A) Wildtyp-Fliegen und (B) Fliegen, die eine dominant-negative Ableitung des Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000) zum Ausdruck bringen. Beide drücken Aktin-GFP (grün) in MB Gamma Neuronen. Wie zuvor beschrieben (Trunova et al., 2011), gibt es eine Region in den proximalen Axone von Wildtyp-Gamma-Neuronen, die an Aktin-GFP akkumulieren fehl, so zeigt sich als ein &quot;clear zone&quot; (A, Klammer), und fasciclin 2-Protein (rot) sammelt sich in den Axonen nur bis zu dem ventralen dieser Zone (weiße horizontale Linie). Die gepunktete Linie in der dritten Platte der 1 (A) zeigt die Position des MB, Hervorhebung der Tatin &quot;freien Zone&quot; und seine ventrale Grenze. In Fliegen exprimieren Cdk5DN ist das Actin freien Bereich nicht vorhanden (B) und Fasciclin 2 (FasII) Immunreaktivität breitet dorsal durch diese Region. (Beachten Sie, dass variable Anzahl von FasII-positive Axone Projekt horizontal über die MB; diese sind nicht relevant für den Phänotyp). Maßstabsbalken repräsentiert 20 um. Mit unserem Verfahren der Ex-vivo-Kultivierung, behandelten wir Wildtyp-Fliegen mit einer Kombination aus Roscovitin und Olomoucin, pharmakologische Inhibitoren von Cdk5 Aktivität. Abbildung 2 zeigt eine Gruppe von Dritt-Stadiums larvalen Gehirnen der Kontrolle (A) und Arzneimittel-behandelten (B ) Wildtyp-Fliegen. Ähnlich wie bei Fliegen Expression einer dominant negativen Cdk5 Konstrukt, Gehirne mit Cdk5 Inhibitoren für 24 Stunden behandelt wurden, zeigen die charakteristische Verlust von Aktin-freien Bereich und Verschiebung FasII Grenze (eckige Klammern). Weiße Linien zeigen Position des Wildtyp-FasII Grenze. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um. FiguRE 3 zeigt eine repräsentative Reihe von Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF, mit Membran-gezielte mCD8-GFP (grün) gekennzeichnet. Klammern geben den Kelch, das heißt, die dendritischen Projektionen des MB. Vor der Metamorphose, kann man sehen MB Axone Coursing dorsoventral in dicken Bündeln, sowie einem &#39;Haze&#39; von Fluoreszenz-Signal aus dem dichten dendritischen Dorn (Bügel). Feld A zeigt Gehirne seziert zum Zeitpunkt angegeben. Beachten Sie, das Beschneiden von Dendriten in der Region angedeutet durch die Klammern, (obwohl die axonale Signal bleibt unberührt), so dass von 6-8 Std. APF, die Trübung der dendritischen Signal weg ist. Brains in Panel B wurden bei 0 Stunden APF seziert, bevor der interne Ecdyson Spike (Truman und Riddiford, 2002), ex vivo kultiviert und, wie angegeben. Diese zeigen keine Entwicklungsstörungen Beschneiden von Dendriten, sondern die dendritischen Signal bestehen bleibt bei 10 Stunden APF. Um dies zu umgehen, sind Puppen bei 0 Stunden APF markiert, aber seziert bei 1,5 Stunden APF und kultiviert. Scheibel C zeigt eine repräsentative Reihe dieser Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF. Wie in den nicht-kultivierten Proben, wird das durch dendritische 8 Stunden APF nicht nachweisbar. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
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<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Chronische genetische Manipulationen von Gewebe Struktur und Funktion, einschließlich Mutationen und Expression von Transgenen, erzeugen in der Regel eine Kombination aus sofortiger Wirkung und späten indirekte Folgen, die nur sehr schwer zu trennen sind. Als Ergänzung zu genetischen Methoden können mit Pharmakologie erleichtern Verhör des zeitlichen Verlaufs hinter einem Phänotyp. Zum Beispiel, war dies ein starker Ansatz zum Präparieren der Beiträge der verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts während der Sper...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Schneiders Drosophila Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum (hitzeinaktiviertem) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdyson </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 &amp;mgr; </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 &amp;mgr; </td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Zellkultureinsätze </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 gut </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropräparate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 bis 548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo kultivierung von whole, entwickeln von drosophila brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex-vivo-Kultivierung von Drosophila ganze Gehirn. Dies kann als Kontrapunkt zu chronischen genetische Manipulationen zur Untersuchung der Zellbiologie und der Entwicklung der zentralen Gehirnstrukturen, indem akute pharmakologische Interventionen und Live-Imaging von zellulären Prozessen verwendet werden. Als ein Beispiel für die Technik, vor aus unserem Labor ein Arbeiten haben gezeigt, dass ein bisher nicht berücksichtigter subzellulären Kompartiment zwischen den Axonen und somatodendritischen Fächer von Axonen des zentralen Drosophila Gehirn liegt. Die Entwicklung dieser Kammer, die als das Axon ersten Segment (AIS) 2, wurde genetisch auf dem Neuronen-spezifischen Cyclin-abhängige Kinase, Cdk5 abhängen gezeigt. Wir zeigen hier, dass Ex-vivo-Behandlung von Wildtyp Drosophila Larve Gehirn mit dem Cdk5-spezifische pharmakologische Inhibitoren Roscovitin und Olomoucin 3 akuten Veränderungen im Aktin-Organisation verursacht, undin Lokalisation des Zelloberflächenprotein Fasciclin 2, die die Änderungen in Mutanten, die Cdk5 Aktivität fehlt genetisch gesehen zu imitieren. Ein zweites Beispiel für die Ex-vivo-Kultur Technik wird für Umbau der Verbindungen von embryonalen Pilzkörper (MB) Gamma-Neuronen während der Metamorphose von der Larve zum erwachsenen Verfügung gestellt. Der Pilzkörper ist das Zentrum des olfaktorischen Lernen und Gedächtnis in-the-fly 4, und diese Gamma-Neuronen beschneiden ihre Axonen und Dendriten Filialen während der gesamten Entwicklung und dann wieder verlängern Zweige zu einem späteren Zeitpunkt, um die erwachsenen Innervationsmuster 5 zu etablieren. Beschneiden dieser Neuronen des MB hat sich gezeigt, über lokale Degeneration von Neuriten Zweigen 6 auftreten, durch einen Mechanismus, durch Ecdyson, ein Steroidhormon, ausgelöst wird, prüft auf Ecdyson-Rezeptor B1 7, und das ist abhängig von der Aktivität der Ubiquitin-Proteasom-System 6. Unsere Methode der Ex-vivo-Kultivierung kann be verwendet werden, um weiter zu befragen, den Mechanismus der Entwicklungspsychologie Umbau. Wir fanden, dass in der ex vivo-Kultur Einstellung, Gamma-Neuronen des MB den Prozess der Entwicklung Beschneiden rekapituliert mit einem zeitlichen Verlauf ähnlich der in vivo. Es war jedoch wesentlich, um bis 1,5 Stunden nach Puparium Bildung vor Explantation des Gewebes, damit die Zellen irreversibel zu verpflichten, Metamorphose warten; Sezierung von Tieren zu Beginn der Puparium führten zu wenig oder gar keine Metamorphose in der Kultur. So, mit entsprechender Modifikation kann die Ex-vivo-Kultur-Ansatz angewendet, um zu studieren dynamische als auch stationäre zentrale Aspekte der Biologie des Gehirns werden.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann<em&gt; In-vivo-</em&gt; Entwicklung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Pilzkörper in ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur-System.

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

Wir beschreiben eine Methode zur Ex-vivo-Kultivierung ganzer Drosophila-Gehirne. Diese kann als Gegenstück zu chronischen genetischen Manipulationen für ... verwendet werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ganze sich entwickelnde Drosophila-, Larven- und Puppenhirne unter ex vivo-Bedingungen zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Drosophila, Larven und Puppen des geeigneten Entwicklungsstadiums identifiziert werden. Anschließend werden die Gehirne rasch präpariert. Anschließend werden die Gehirne für den erforderlichen Zeitraum bei 25 Grad Celsius kultiviert. Schließlich werden die kultivierten Gehirne fixiert, gefärbt, präpariert und abgebildet. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass es möglich ist, die in-vivo-Entwicklung des Pilzkörpers von Oph durch eine Ex-vivo-Kultivierungstechnik nachzuahmen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass wir nun in vivo-Phänotypen im Pilzkörper von Drosophila in einem ex vivo-Kultursystem nachahmen können, was eine hochauflösende Analyse der Dynamik des Entwicklungsprozesses ermöglicht. Um Larvengehirne zu kultivieren, bereiten Sie frisches, vollständiges Medium mit Insulin vor und geben 500 µL davon in eine 12-mm-Zellkulturschale mit Insert zur Behandlung mit Wirkstoffen. Bereiten Sie vollständiges Medium mit jeweils 100 µM Rosco batin und Oli moin vor.Geben Sie eine kleine Menge Medium auf eine Dissektions-Unterschale. Heben Sie mit einem kleinen Spatel wandernde Larven im dritten Larvenstadium auf und legen Sie sie in die Unterschale. Halten Sie anschließend mit einer Pinzette das hintere Ende der Larve fest.Dann mit der Pinzette Nummer fünf das vordere Ende öffnen und das Gehirn vorsichtig herausschneiden, wobei der ventrale Nervenstrang intakt bleibt. Mit vorbenetzten Pipettenspitzen das Gehirn vorsichtig in die zuvor vorbereitete Zellkulturschale überführen. Anschließend eine feuchte Kammer herstellen und die Schale in die Kammer stellen.Inkubieren Sie das Gehirn bis zu 48 Stunden bei 25 Grad Celsius, um Pupillengehirne zu kultivieren. Beginnen Sie damit, weißes Puy auf den Gefäßen zu markieren. Notieren Sie diesen Zeitpunkt als null Stunden nach ER-Bildung oder als PF nach 1,5 Stunden.Fügen Sie 500 Mikroliter komplettes Medium zu einer 12 Millimeter großen Zellkulturschale mit Insert hinzu. Geben Sie eine kleine Menge des vorbereiteten Mediums in ein Zerlegungsuhrglas. Nehmen Sie anschließend mit einem kleinen, feuchten Spatel die zuvor für die Zerlegung markierten PPE auf und legen Sie sie in das Uhrglas.Die weißen Puppen auf der linken Seite zeigen den Zeitpunkt null, auf der rechten Seite ist der 1,5-Stunden-A-PF zu sehen. Halten Sie dann mit einer Pinzette das hintere Ende der Puppe fest und öffnen Sie mit einer Nr.-5-Pinzette vorsichtig das vordere Ende des Puppenkokons. Entfernen Sie anschließend schnell das Gehirn, wobei das ventrale Nervenband intakt bleibt und angeheftet ist. Nachdem Sie die Spitze eines 20-Mikroliter-Kunststoffpipettenspitze abgeschnitten haben, befeuchten Sie die Pipettenspitze und verwenden Sie sie, um die Gehirne der Puppen vorsichtig in die Schalen mit Medium zu überführen.Inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius für die gewünschte Dauer. Nachdem die Gehirne von Larven oder Pupillen für die gewünschte Zeit inkubiert wurden, entfernen Sie das Medium und geben 500 Mikroliter 4 % Formaldehyd in PBST-Puffer hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten lang, ersetzen Sie dann durch frisches gepuffertes 4 % Formaldehyd und inkubieren Sie weitere 15 Minuten.Einmaliges Waschen der Gehirne mit XPBS mit 0,5 % Triton X-100, viermal jeweils zehn Minuten. Nach dem letzten Waschschritt die Proben eine Stunde in Blockierungslösung inkubieren.Fügen Sie die primären Antikörper in die Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen waschen Sie die Proben viermal mit PBST, jeweils zehn Minuten lang. Anschließend inkubieren Sie sie vier Stunden bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern.Wiederholen Sie die Waschschritte, um die Gehirne für die Mikroskopie zu präparieren. Beginnen Sie damit, sie zusammen mit dem Einbettungsmedium eine Stunde lang zu äquilibrieren, und bringen Sie sie anschließend auf Objektträgern unter, um ein Zerquetschen der Proben zu vermeiden. Legen Sie Glasstückchen auf beiden Seiten ab. Bringen Sie dann die Deckgläser auf, nachdem Sie diese mit Nagellack versiegelt haben. Lagern Sie die Präparate im Dunkeln. Diese Abbildung zeigt eine Ansicht von Larvengehirnen des dritten Larvenstadiums von Wildtyp-Fliegen und Fliegen, die eine dominant negative Form von CDK5 oder CDK5-dn exprimieren; beide exprimieren Actin-GFP in den Gamma-Neuronen des Pilzkörpers (MB). Im Bereich der proximalen Axone der Wildtyp-Gamma-Neuronen kommt es zu keinem Anstieg von Actin-GFP, wodurch eine klare Zone sichtbar wird. Fächlich betrachtet sammelt sich das Protein in den Axonen nur bis zur ventralen Grenze dieser Zone an.Die gestrichelten Linien zeigen die Position des MB an, wobei die aktive klare Zone und ihre ventrale Grenze hervorgehoben sind. Bei Fliegen, die CDK fünf dn exprimieren, ist die Aktin-klare Zone abwesend und faszial breitet sich die Immunreaktivität zwei- oder fast zwei-weise dorsal durch diesen Bereich aus. Unter Verwendung der hier vorgestellten Methode wurden ex vivo kultivierte Wildtyp-Fliegenhirne mit einer Kombination aus pharmakologischen Inhibitoren der CDK-fünf-Aktivität, ROS cottin und ene, behandelt.Hier gezeigtes ist ein Panel von Larvengehirnen im dritten Larvenstadium von Kontroll- und drogenbehandelten Wildtyp-Fliegen, vergleichbar mit Fliegen, die ein dominant-negatives CDK-fünf-Konstrukt exprimieren. Gehirne, die 24 Stunden mit CDK-fünf-Inhibitoren behandelt wurden, zeigen den charakteristischen Verlust der aktinreichen klaren Zone und eine Verschiebung des Färbemusters. Zwei begrenzende weiße Linien zeigen die Position des Wildtyp-Färbemusters an. Zwei begrenzende Linien, hier gezeigt, stellen eine repräsentative Serie von Drosophila-Pilzkörpern von null bis 10 Stunden dar.Ein mit einer membrantargetierten PF markiertes Gehirn. MCD acht GFP-Klammern weisen auf die dendritischen Fortsätze des MB hin, die vor der Metamorphose als Calyx bezeichnet werden. Die Axone des MB verlaufen dorsoventral in dicken Bündeln, und ein fluoreszierendes Signal geht von der dichten dendritischen Verzweigung aus.Diese Spalte zeigt Gehirne, die zum angegebenen Zeitpunkt präpariert wurden. Beachten Sie das Beschneiden der Dendriten in dem durch die Klammern markierten Bereich, sodass der verschwommene dendritische Signal bereits sechs bis acht Stunden a PF verschwunden ist. Die Gehirne in dieser Spalte wurden null Stunden A PF vor der internen Handlung präpariert.Dyson-Spitze und in Kultur gehaltene x vivo zu den angegebenen Zeitpunkten zeigen keine entwicklungsbedingte Abschnürung der Dendriten. Vielmehr bleibt das dendritische Signal bei 10 Stunden a PF bestehen, um diese PPR, die bei null Stunden EPF markiert ist, zu umgehen, jedoch bei 1,5 Stunden a PF präpariert und in Kultur gehalten. Diese Spalte zeigt eine repräsentative Serie dieser DLA-Pilzkörper von null bis 10 Stunden.Ein PF, wie in den nicht kultivierten Proben, ist das dendritische Signal acht Stunden nach PF nicht nachweisbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rosler-Gehirne ex vivo kultiviert. Sie sollten in der Lage sein, Gehirne aus späten Larvenstadien oder weißen PrepU entweder vor oder nach dem hormonellen Anstieg, der die Metamorphose einleitet, zu isolieren. Anschließend sollten Sie entweder fixiertes Material mittels Mikroskopie analysieren oder die Gehirne als Ausgangsmaterial für Live-Bildgebung verwenden können.

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JoVE Journal

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Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

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