Name: Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung humaner fötaler Neuralvorläuferzellen in Oligodendrozyten in vitro. Dieses Protokoll ermöglicht reine Zellpopulationen ohne Stützzellen für Studien zur Entwicklungsneurobiologie.

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Diese Arbeit wurde von der Intramural Research Program des National Institutes of Health, NINDS unterstützt. Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors für Molekulare Medizin und Neurowissenschaften, Rick Dreyfuss für die Hilfe bei Mikroskopie und Pamela C. Sieben für die Hilfe bei der Bearbeitung danken.

Anmerkung: Für routinemäßige Kultivieren der neuralen Vorläuferzellen und oligodendrocytic Abstammungslinie Zellen, Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre durchgeführt. Alle 2 Tage, wird das Medium ausgetauscht Verwendung von 50 bis 100% des frischen Mediums ist, wenn die Kultur 40 bis 70% konfluent. Zum Zeitpunkt der Nähe der Konfluenz werden die Kulturen bei 2-2.5e6/T75 Kolben normalerweise auf einem Wochenprogramm passagiert. Ein. Herstellung des beschichteten Flask <ol><li> Zur Vorbereitung beschichteten Kolben zu verdünnen 5 mg Poly-D-Lysin (PDL) in 100 ml deionisiertem Wasser (DI-Wasser), dann Mantel T75-Flaschen mit 50 ug / ml PDL bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Nach 1 ½ Std. absaugen PDL und spülen Sie die Flaschen einmal mit DI-Wasser. Lassen Sie die Flaschen trocken vor der Aussaat der Zellen (Tabelle 1). </li></ol> 2. Ab Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in Progenitor-derived Oligodendrozyten (PDO) Das Protokoll istOlate menschlichen ZNS Vorläuferzellen in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Menschlichen ZNS Vorläuferzellen wurden aus dem Telencephalon eines 8-Schwangerschaftswoche fötalem Gehirn, in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien erhalten wurde, isoliert. <ol><li> Wachsen multipotenten Population von neuralen Vorläuferzellen auf PDL beschichteten Flaschen in Neurobasalmedium mit 25 ng / ml bFGF und 20 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (Abbildung 1A) ergänzt. Verwenden Sie sie nicht, wenn höher als Durchgang 11 (p11). </li><li> Start, um die neuronalen Vorläuferzellen zu unterscheiden, wenn die Kultur von etwa 70% konfluent. </li><li> Make vollständige Differenzierung Oligodendrozyten Medium mit serumfreien DMEM / Hams F12-Medium mit 1.01 Rinderserumalbumin, L-Glutamin, Gentamicin, N2 Komponenten, T3, Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA (Tabelle 1) ergänzt . Dieses Medium wird als Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren (Oligo mittel + GF) definiert werden. </li><li> Entfernen progenitor Medien aus den Flaschen spülen Zellen einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), dann fügen Oligo mittel + GF (Details unter 2.3 beschrieben) zu Oligodendrozyten Differenzierung beginnen. Nur Zellen, die sich für die oligodendrocytic Linie wachsen wird (Abbildung 1B). Kultur der Zellen in diesem Medium für 3 Wochen. </li><li> Jede Woche, wenn die Zellen bei 90-95% Konfluenz mit Trypsin ihnen Durchgang (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml für eine T75-Flasche). Übertragen das Medium von den Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen passagiert werden, dies konditionierte Medium wird verwendet, um das Trypsin zu quenchen werden. Achten Sie darauf, nicht zu trocknen die Zellen. Dann fügen Trypsin. </li><li> Inkubieren Zellen in Trypsin für 5 min bei RT, leichtes Antippen der Kolben mehrmals Zellablösung helfen. </li><li> Quench das Trypsin durch Zugabe von 4-5 ml des konditionierten Mediums in den Kolben mit den abgelösten Zellen. </li><li> Übertragen des Mediums und die Zellen auf den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge das Medium und die Zellen bei 1.200 rpm (~300 xg) für 5 min bei RT. </li><li> Überstand, Zellpellet vorsichtig Kippen der Röhre, und fügen Sie dann frische Oligo mittel + GF. Gently Pipette und Zellen nach oben und unten, um eine einheitliche Zellsuspension. </li><li> Zählen Sie die Zellen, und die Übertragung 2.5e6 in jede neue PDL-beschichteten T75-Flasche. </li></ol> 3. Letzter Schritt in der Differenzierung von Oligodendrozyten <ol><li> Nach 3 Wochen der Kultur in Oligo-Medium + GF, wenn die Zellen bei 70-80% Konfluenz sind, starten Sie den abschließenden Prozess der Differenzierung (Abbildung 1C). </li><li> Planen Medium in der gleichen Weise wie die Oligo-Medium + GF, aber ohne Zugabe der vier GF: Shh, NT-3, bFGF und PDGF-AA. GF - Dieses Medium ohne die vier GF wird als Oligo Medium definiert werden. </li><li> Saugen Sie die Oligo-Medium + GF aus der Flasche, einmal mit PBS spülen und fügen Sie dann ein Gesamtvolumen von 16 ml des Mediums, von denen ¾ (12 ml) Oligo Medium - GF und ¼ (4 ml) ist PDN konditioniertes Medium für 6-10 Tage). Die Verwendung von konditioniertem Medium aus PDN ist nicht kritisch für die Differenzierung oder das Überleben der Zellen. Wir tatsächlich beobachtet, dass nur direkten Kontakt mit PDO PDN Zellen in Co-Kultur-Experimente eine Wirkung auf die Länge der PDO Überleben hatte. Die Überlebenszeit in Oligo Medium - GF könnten auf zwei oder drei Wochen verlängert werden, wenn die Zellen mit PDO PDN Zellen co-kultiviert. Das Protokoll für die menschliche neurale Vorläuferzellen in PDN zu differenzieren ist in einer früheren Publikation beschrieben, und es ist nicht Bestandteil dieses Protokolls 1. Wachstumsfaktorentzug aus dem Kulturmedium führt fortschreitend differenziert Kultur von Zellen mit mehreren Prozessen (1D). </li></ol> 4. Durchflusszytometrie Assay Die Durchflusszytometrie-Assay vergleicht den Erwerb von Oligodendrozyten Marker während der Differenzierung in der Beziehung mit denen ihrer Eltern Bevölkerung. <ol><li> Verwenden neuronalen progenitors als Kontrolle. Saatgut PDO Zellen bei 2.5x10 6 Zellen in zwei T75-Flaschen, beschichtet mit Poly-D-Lysin in Oligo-Medium + GF. </li><li> Eine Woche später, ersetzen Medium mit frischem Oligo mittel + GF in Flaschen als Kontrolle Kultur für die Lebensfähigkeit der Zellen, während andere Flaschen hatten Oligo mittel - GF. </li><li> Um PDO-Zellen in beiden Medien distanzieren verwenden 20 U / ml Papain und nicht Trypsin. Dies liegt daran, Papain eine sanftere Wirkung auf die Zellen während der Dissoziation die Erhaltung der zellulären Morphologie. </li><li> 5 ml Balanced Salt Earle-Lösung (EBSS) zu einem Papain Fläschchen. Die Küvette bei 37 ° C für 10 min oder bis das Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Dies ist der Papain-Lösung verwendet, um die Zellen zu dissoziieren. </li><li> 0,5 ml EBSS einem Deoxyribonuclease I (DNase) Fläschchen (Tabelle 1). Vorsichtig mischen. 0,25 ml dieser Lösung in der Durchstechflasche gelöst Papain. Diese Zubereitung enthält eine Endkonzentration von etwa 20 E / ml und 0 Papain0,005% DNase. </li><li> Ort Papain-Lösung (wie oben beschrieben) auf die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 15-30 min; überwachen die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop. Stoppen der Reaktion mit 5 ml Medium mit oder ohne GF und Zentrifuge bei 1.200 rpm für 7 min. </li><li> Übertragen Zellpellets aus beiden Kolben in zwei unterschiedlichen 5 ml Polypropylen-Röhrchen und waschen Sie sie mit normalen physiologischen Medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes und 10 mM Glucose) mit 1 mg / ml ergänzt Rinderserumalbumin (NPM + BSA). </li><li> Führen Oberfläche Immunfärbung bei 4 ° C für 20 min unter Verwendung von spezifischen und entsprechend titriert Primärantikörper für A2B5, O4, GalC (Tabelle 2). </li><li> Waschen der Zellen mit NPM + BSA bei 4 ° C für 5 min und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper bei 4 ° C für 20 min (Tabelle 2). </li><li> Um intrazelluläre Antigene einschließlich Nestin, saure Gliafaserprotein (GFAP), Klasse III &amp; sein färbenta;-Tubulin und basischem Myelinprotein (MBP) (Tabelle 2), zu fixieren die Zellen in 2% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT und permeabilisieren mit kaltem 70% igem Ethanol 15 min bei -20 ° C. </li><li> Waschen der Zellen mit 1x PBS und Inkubation mit spezifischen Sekundärantikörper (Tabelle 2). </li><li> Um zwischen intakten Zellen und subzellulären Schmutz während der Durchflusszytometrie diskriminieren, Fleck Zellen mit 4,6-Diamino-2-phenyllindole, Dihydrochlorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Bei der Optimierung des obigen Protokoll, führten wir alle geeigneten Kontrollversuchen um die Spezifität jedes Immunreagenz bestätigen. Kurz gesagt, für direkt markierten Antikörpern, die geeignete Negativkontrolle ein direkt konjugierten Antikörper des gleichen Isotyps Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) und Fluorochrom-Konjugat als primärer Antikörper (dh die Isotyp-Kontrolle). Für indirekte Immunfärbung primärer Antikörper, die entsprechende negative Kontrolle wals sekundärer Antikörper, konjugiert an dem Fluorochrom von Interesse, dass speziell die Immunglobulin-Klasse (oder Unterklasse) von dem Wirt, in dem der primäre Antikörper erzeugt wurde angestrebt. Wenn primäre Antikörper von mehreren Hosts (Maus, Kaninchen, Huhn) zusammen verwendet wurden, nutzten wir die sekundären Antikörper gegen den primären Antikörper jeden Host und jeden sekundären Antikörper verwendet wurde typischerweise gegen die Immunglobuline aus den anderen Hosts-adsorbiert überqueren, um cross-Minimierung Gastgeber Immunreaktivität. Die positiven Kontrollen einbezogen direkten oder indirekten Immunfärbung von Zellpräparaten bekannt, die Antigene von Interesse exprimieren entweder mit direkten oder indirekten Immunreaktionen mit den primären Antikörpern, die spezifisch für diese Antigene. Die obigen Optimierungsmethoden wurden einmal für jeden Typ von Immunfärbung Experimente durchgeführt. Steuerung Immunreaktionen zeigten keine signifikante Cross-Epitop Immunreaktivität unter primären und sekundären Antikörpern. Durchflusszytometrie wurde auf einheitlich durchgeführtsuspendiert fluoreszenzmarkierte Zellen unter Verwendung eines FACVantage SE Zellsortierer (BD Biosciences, San Jose, CA) mit drei Laser, welche Anregungslicht Wellenlängen abgestimmt zu 488 nm, 647 nm bereitzustellen ausgestattet, und eine breite UV (351-364 nm) (Abbildung 2) . </li></ol> 5. Immunofluoreszenzassay Hinweis: Für Immunfluoreszenz Experimenten PDO sind in Oligo-Medium + GF oder Oligo ausplattiert - GF bei 2.5e5 in 6-Well-Platten mit PDL beschichtet. Die Zellen werden in 2% PFA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren fixiert. Der Antikörper Fleck ist auf Kunststoff-6-Well-Platten anstelle von Deckgläsern durchgeführt. <ol><li> Entfernen Sie das Medium und fügen Sie die 2% PFA. Inkubieren für 10 min bei RT. Entsorgen PFA. Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 min. Seien Sie vorsichtig, nicht zu trocknen die Zellen. </li><li> Permeabilisieren Zellen für intrazelluläre Marker mit 0,25% Triton-Lösung in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Um unspezifische Bindung, Block Zellen verhindern foder 10 min mit HHG (1 mM HEPES-Puffer, 2% Pferdeserum und 10% Ziegenserum in balanced salt Hanks-Lösung). Verdünnte spezifischen primären Antikörper (Tabelle 2) zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG. Zeigen verdünnte Antikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf dem Schüttler oder bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. Verdünnte geeigneten sekundären Antikörpern (Tabelle 2) mit einem Fluorochrom zu einer vorbestimmten Konzentration in HHG gekoppelt. Legen Sie die Mischung von verdünntem Sekundärantikörper auf Zellen. Inkubieren 1 h bei RT auf einem Schüttler im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, für jeweils 5 min. </li><li> Um zu vermeiden, Ausbleichen hinzufügen 10 ul verlängern Gold mit DAPI zu den Zellen und setzen Sie ein Deckglas auf sie. Visualisieren Sie markierten Zellen mit einem Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Abbildung 3). </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Ableitung fetaler Oligodendrozyten aus primären humanen neuralen Vorläuferzellen und zu charakterisieren ihren Phänotyp sowohl mit Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Der Ausbau und das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen aus fetalem ZNS wurde sehr gut 1-4 beschrieben. Allerdings erhalten ausreichende personelle Oligodendrozyten in vitro Experimente bleibt schwierig, obwohl es möglich ist, zu identifizieren und zu isolieren, glialen Vorläuferzellen aus ad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> DME / Hams F12 01.01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Rinderalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2-Komponenten </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ug / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Qualität Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase Vials </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold- mitDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primäre Abs (alle auf 1 pg / ml) </td><td></td><td> Species Isotyp </td><td> Quelle </td><td> Sekundäre Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Durchflusszytometrie </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Gift J. Nielson </td><td> Streptavidin PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Geschenk von J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Maus </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Maus </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII Tubulin </td><td> Maus </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunzytochemie </td></tr><tr><td> βIII Tubulin (1:1,500) </td><td> Maus </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Huhn </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Maus </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Kaninchen </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2 Antikörper (Abs) für Durchflusszytometrie und Immunzytochemie Assays verwendet Antikörper-Konjugate: PE, Phycoerythrin; PETR, Phycoerythrin Texas Red; AMCA, Amino-methyl-cumarin-acetat; Cy, Cyanin; FITC Fluoresceinisothiocyanat Ig:. Immunglobulin. . AF: Alexa Fluor; gαm: Ziege-Anti-Maus; gαrb: Ziege-Anti-Kaninchen; dαck: Esel-Anti-Huhn. </td></tr></tbody></table>

progenitor-abgeleiteten oligodendrozyten culture system von human fetal gehirn

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differenzierung von humanen neuronalen Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen ein Modell zu studieren und Vergleichen molekulare Regulation von neuronalen Zellstammbaums Entwicklung. In vitro Expansion von neuralen Vorläuferzellen aus fötalem ZNS-Gewebe ist gut charakterisiert worden. Trotz der Identifizierung und Isolierung von glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen subkortikalen weißen Substanz und Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten, Erhaltens ausreichender menschlichen Oligodendrocyten für in vitro Experimente ist weiterhin schwierig. Differenzierung Galactocerebrosid + (GalC) und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder Vorläuferzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen und schnell über die Zeit in Kultur verloren. Der Bedarf bleibt für eine Kultur-System an Zellen des Oligodendrozyten Linie geeignet für in vitro Experimente erzeugen. Kultur von primären humanen Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell für die Pathogenese von neurotropen Infektionserreger wie das menschliche Polyomavirus, JCV, die in vivo infiziert jene Zellen zu studieren. Diese kultivierten Zellen konnten auch Modelle von anderen demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Primary, humanen fötalen brain-derived vermehren multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro unter Beibehaltung der Fähigkeit, sich in Neuronen (Vorläuferzellen abgeleiteten Neuronen, PDN) und Astrozyten (Vorläuferzellen abgeleitete Astrozyten, PDA) Diese Studie zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden kann differenzieren durch viele der Stufen oligodendrocytic Linie Entwicklung (Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten, PDO) zu unterscheiden. Wir Kultur neuralen Vorläuferzellen in DMEM-F12 serum-freien Medien unterstütztumgesetzt mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), neurotrophen Faktor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3). Die kultivierten Zellen werden bei 2.5e6 Zellen pro 75cm Flaschen etwa alle 7 Tage passagiert. Mit diesen Bedingungen behält die Mehrzahl der Zellen in Kultur eine Morphologie von wenigen Prozessen und Express Marker des Pre-Oligodendrozyten-Zellen, wie A2B5 und O-4 ist. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditionierten Medien von PDN, beginnen die Zellen zu mehreren Prozesse und Express Marker spezifische Differenzierung der Oligodendrozyten, wie GalC und Myelin erwerben basisches Protein (MBP). Wir führten phänotypischen Charakterisierung mit multicolor Durchflusszytometrie einzigartige Marker der Oligodendrozyten zu identifizieren.

Es ist sehr wichtig, um die Differenzierung von einer 70% -80% konfluente Zellkultur neuralen Vorläuferzellen (1A) zu starten. Viele Zellen sterben nach dem Wechseln des Kulturmediums aus Vorläuferzellen zu Oligo Medium, da es bestimmte Wachstumsfaktoren enthält. Dies zeigt, daß das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen nicht zu einem Phänotyp oligodendrocytic begangen wird nicht von dem neuen Medium (1B) gestützt werden. Inkubation in Oligo-Medium + GF für eine Woche in Folge einer Zwi...

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen<em&gt; In vitro</em&gt; Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Die Differenzierung humaner neuraler Progenitorzellen in neuronale und gliale Zelltypen bietet ein Modell zur Untersuchung und zum Vergleich der molekularen Regulation der Entwicklung neuraler Zelllinien. Die In-vitro-Expansion neuraler Progenitorzellen aus fetalem ZNS-Gewebe ist bereits gut charakterisiert. Trotz der Identifizierung und Isolierung glialer Progenitorzellen aus adulter humaner subkortikaler weißer Substanz sowie der Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen zur Steuerung der Differenzierung fetaler neuraler Progenitorzellen in myelinproduzierende Oligodendrozyten bleibt die Gewinnung ausreichender humaner Oligodendrozyten für In-vitro-Experimente schwierig. Die Differenzierung von Galactocerebrosid-positiven (GalC+) und O4-positiven Oligodendrozyten-Vorläufer- oder Progenitorzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde unter Verwendung von fetalem Gehirngewebe aus dem zweiten Trimester beschrieben. Diese Zellen proliferieren jedoch in Abwesenheit von Stützzellen, einschließlich Astrozyten und Neuronen, nicht und gehen in der Kultur schnell verloren. Es besteht weiterhin Bedarf an einem Kultursystem zur Herstellung von Zellen der Oligodendrozyten-Linie, die für In-vitro-Experimente geeignet sind. Die Kultur primärer humaner Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell zur Untersuchung der Pathogenese neurotroper Infektionserreger wie dem humanen Polyomavirus JCV sein, das diese Zellen in vivo infiziert. Diese kultivierten Zellen könnten zudem Modelle für andere demyelinisierende Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) liefern. Primäre, aus dem humanen fetalen Gehirn gewonnene, multipotente neurale Progenitorzellen proliferieren in vitro und behalten dabei die Fähigkeit bei, in Neuronen (progenitor-derived neurons, PDN) und Astrozyten (progenitor-derived astrocytes, PDA) zu differenzieren. Diese Studie zeigt, dass neurale Progenitorzellen induziert werden können, um viele Stadien der oligodendrozytären Linienentwicklung zu durchlaufen (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). Wir kultivieren neurale Progenitorzellen in serumfreiem DMEM-F12-Medium, das mit basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3) ergänzt wurde. Die kultivierten Zellen werden etwa alle sieben Tage mit 2,5e6 Zellen pro 75-cm-Flask passaged. Unter diesen Bedingungen behält die Mehrheit der Zellen in der Kultur eine Morphologie bei, die durch wenige Fortsätze charakterisiert ist, und exprimiert Marker von Prä-Oligodendrozyten, wie A2B5 und O-4. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditioniertes Medium von PDN hinzufügen, beginnen die Zellen, mehr Fortsätze auszubilden und Marker zu exprimieren, die spezifisch für die Oligodendrozyten-Differenzierung sind, wie GalC und Myelin-Basisprotein (MBP). Wir haben eine phänotypische Charakterisierung mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie durchgeführt, um spezifische Marker von Oligodendrozyten zu identifizieren.

Dieses Video zeigt eine Methode zur Differenzierung primärer menschlicher fetaler neuronaler Vorläuferzellen in Oligodendrozyten. Zunächst werden neuronale Vorläuferzellen in einem Vorläufer-Medium bis nahe der Konfluenz kultiviert. Anschließend wird das Vorläufer-Medium durch ein Oligodendrozyten-Medium ersetzt, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist, welche den Differenzierungsprozess fördern. Die Zellen werden dann drei Wochen lang kultiviert und expandiert.Das Wachstumsfaktor-supplementierte Oligodendrozyten-Medium wird dann durch Oligodendrozyten-Medium ohne Wachstumsfaktoren ersetzt, und die Zellen werden weitere sechs bis zehn Tage kultiviert, bis mikroskopisch phänotypische Veränderungen sichtbar werden. Die Differenzierung wird anschließend mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie unter Verwendung von Oligodendrozyten-Linie-spezifischen Antikörpern bestätigt. Letztendlich können die erfolgreich differenzierten Oligodendrozyten für In-vitro-Studien der Oligodendrozytenbiologie und der Interaktionen mit Infektionserregern wie dem humanen Polyomavirus JCV verwendet werden.Ein echter Vorteil der in diesem Labor etablierten Technik im Vergleich zur bereits veröffentlichten Literatur besteht darin, dass in unserem System die Oligodendrozyten kultiviert und differenziert werden können, ohne dass Stützzellen wie Astrozyten und Neuronen benötigt werden. Ein weiterer Vorteil unseres Protokolls besteht unserer Ansicht nach darin, dass es möglich ist, eine große Anzahl dieser Vorläufer-Oligodendrozyten zu kultivieren, die Marker wie OH4 exprimieren und über viele Wochen in der Pathogenkultur zu großen Zellpopulationen herangezogen werden können, wobei sie ihr Phänotyp beibehalten. Das Endergebnis der Differenzierung liefert uns nahezu eine reine Population von Oligodendrozyten.Wir brachten die Idee zu dieser Methode erstmals zum Ausdruck, als wir die umfangreiche Literatur zur in-vitro-Differenzierung von Oligodendrozyten in Ratten- und meinen Zellen lasen. Auch verschiedene andere Forscher entfernten Wachstumsfaktoren aus engen Kulturen, um die Differenzierung der Zellen abzuschließen. Diese Methode anhand unseres Protokolls demonstriert Alexa Bandon, eine Studentin in unserem Labor hier beim N-I-N-D-S.Zur Vorbereitung der Differenzierung kultivieren Sie eine multipotente Population von neuronalen Vorläuferzellen in polylysinbeschichteten Kolben in neuronalem Basalmedium, ergänzt mit BFGF und EGF, und entsorgen Sie ungenutzte Zellen. Nach 11, wenn die Kultur etwa 70 bis 80 % konfluent ist, wird die Differenzierung eingeleitet. Dazu saugt man das Vorläufermedium aus den Kolben ab.Spülen Sie die Zellen einmal mit PBS und geben Sie dann 12 Milliliter Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach einer Woche weisen die verbleibenden Zellen eine schlanke bipolaren Morphologie auf.Wenn die differenzierten Zellen mindestens 70 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium und überführen Sie es in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das aufbewahrte konditionierte Medium für einen späteren Gebrauch beiseite. Geben Sie dann schnell vier Milliliter 0,05 %iger Trypsin, 0,1 %iger EDTA zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Die Flasche mehrmals vorsichtig ankippen, um die Zellablösung zu unterstützen. Nach der Inkubation die Trypsinierung durch Zugabe von vier bis fünf Milliliter des aufbewahrten konditionierten Mediums in die Flasche stoppen. Danach das Medium zusammen mit den Zellen in einen 50-Milliliter-Konischkolben überführen.Anschließend zentrifugieren Sie das Medium und die Zellen sieben Minuten lang bei Raumtemperatur mit 310 RCF. Nach Beendigung der Zentrifugation saugen Sie das Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Antippen des Röhrchens und geben Sie frisches Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren hinzu.Pipettieren Sie das Medium und die Zellen vorsichtig mehrmals auf und ab, um eine homogene Zellsuspension herzustellen. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Überführen Sie anschließend 2,5 Millionen Zellen in neue mit Poly-D-Lysin beschichtete T-75-Flaschen und stellen Sie die Kultur in den Inkubator. Nach drei Wochen, wenn die Zellen 80 bis 85 % konfluent sind, aspirieren Sie das Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren aus der Flasche.Einmal mit PBS spülen und anschließend 12 Milliliter Oligo-Medium ohne Wachstumsfaktoren sowie 4 Milliliter unconditioniertes Medium von Vorläufer-abgeleiteten Neuronen hinzufügen. Die Zellen sechs bis zehn Tage lang an abwechselnden Tagen in diesem Medium kultivieren. Die Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie auf Differenzierung und Konfluenz untersuchen und mindestens 50 % des Mediums nach Entzug der Wachstumsfaktoren erneuern; die Zellen entwickeln dann progressiv mehrere Fortsätze, was auf eine erfolgreiche Differenzierung in Vorläufer-abgeleitete Oligodendrozyten hinweist.An diesem Punkt können die aus Vorläuferzellen stammenden Oligodendrozyten für Durchflusszytometrie- oder Immunfluoreszenzexperimente verwendet werden, wie in den folgenden Abschnitten dieses Videos beschrieben. Der Durchflusszytometrie-Assay vergleicht den Erwerb von Oligodendrozyten-Markern während des Differenzierungsprozesses im Verhältnis zu denen der Ausgangspopulation. Menschliche neuronale Vorläuferzellen dienen als Kontrollen. 2,5 Millionen aus Vorläuferzellen stammende Oligodendrozyten in jeweils zwei mit Poly-D-Lysin beschichteten T-75-Flaschen in Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren werden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Eine Woche später wird das Medium in einer Flasche durch frisches Oligo-Medium mit Wachstumsfaktoren ersetzt, um die Zellviabilität zu kontrollieren.Ersetzen Sie das Medium im zweiten Kolben durch frisches Oligo-Medium ohne Wachstumsfaktoren. Kultivieren Sie diese Zellen bis zu 10 Tage lang; drei bis neun Tage nach der Entfernung der Wachstumsfaktoren beginnen die Zellen, mehr Fortsätze auszubilden, die typisch für ein Oligodendrozyten-Phänotyp sind. Um die aus Vorläuferzellen stammenden Oligodendrozyten zu dissoziieren, aspirieren Sie das Medium und geben Sie 5,25 Milliliter Perian-Lösung zu jedem Kolben hinzu.Perian wird statt Trypsin verwendet, da es eine schonendere Wirkung auf die Zellen während der Dissoziation hat. Um die zelluläre Morphologie zu erhalten, die Probe 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Ablösung der Zellen periodisch mittels Mikroskop überprüfen.Wenn die Zellen abgelöst sind, fünf Milliliter Medium mit oder ohne Wachstumsfaktoren hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Danach den Inhalt jedes Kolbens in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Gefäße bei 310 RCF sieben Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und die Zellpellets in vier Milliliter normalem physiologischem Medium resuspendieren, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin oder NPM plus BSA.Danach die Zellen wie zuvor zählen und für jede Immunfärbungsbedingung jeweils eine Million Zellen in einen fünf Milliliter fassenden Polypropylen-Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, alle geeigneten Kontrollen einzuschließen, um die Spezifität jedes Immunnachweismittels zu bestätigen. Als Nächstes werden zur Durchführung der Immunfärbung die Zellen zunächst mit Antikörpern gegen die Oberflächenproteine A2B5, O4 und GalC inkubiert. Anschließend werden die Zellen gewaschen, um nicht gebundene primäre Antikörper zu entfernen, und danach mit den entsprechenden fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern inkubiert.Anschließend werden die Zellen erneut gewaschen, um die sekundären Antikörper zu entfernen. Nach Fixierung mit 2 % Paraldehyd und Permeabilisierung mit kaltem, 70 %igem Ethanol zur Färbung intrazellulärer Proteine werden die Zellen gewaschen und anschließend mit Antikörpern gegen Nestin, gliales fibrilläres saures Protein, Klasse-drei-beta-Tubulin und myelinsches Grundprotein inkubiert. Danach werden die nicht gebundenen primären Antikörper ausgewaschen.Die Zellen werden mit den entsprechenden mit Fluorochrom markierten sekundären Antikörpern inkubiert. Schließlich, um zwischen intakten Zellen und subzellulärem Zelltrümmern während der Durchflusszytometrie-Analyse zu unterscheiden, werden die Zellen mit vier Sechs DIA Medino versorgt. Zwei Phenol Lind Dihydrochlorid oder Dappy durchführen die Durchflusszytometrie an einem Gerät, das mit drei Lasern ausgestattet ist und Anregungs-Wellenlängen von 488 Nanometern, 647 Nanometern sowie einem breiten UV-Spektrum bereitstellt. Zur Vorbereitung der Immunfluoreszenzmikroskopie bereiten Sie sechs mit Poly-D-Lysin beschichtete.Sechswell-Platten mit 250.000 Zellen von Vorläufer-abgeleiteten Oligodendrozyten pro Mulde. Für jeden Zeitpunkt werden zwei Platten benötigt. Eine wird mit Wachstumsfaktoren kultiviert, die andere ohne, sobald die Zellen 70 bis 80 % konfluent sind.Entfernen Sie das Medium mit Wachstumsfaktoren vom Probenträger. Spülen Sie einmal mit PBS und geben Sie anschließend 12 Milliliter Medium ohne Wachstumsfaktoren hinzu. Führen Sie die Immunfärbung fünf und neun Tage nach dem Entzug der Wachstumsfaktoren wie folgt durch: Fixieren Sie die Zellen zunächst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 % PFA.Als Nächstes verwerfen Sie die PFA und waschen die Zellen dreimal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang. Danach behandeln Sie die Zellen mit 0,25 % Triton und blockieren Sie anschließend, um unspezifische Bindungen zu verhindern, mit 2 % Pferdeserum und 10 % Zieuserserum. Nach der Blockierung inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen Beta-drei-Tubulin, G-F-A-P-M-V-P oh vier und Gal C. Waschen Sie dann die nicht gebundenen Antikörper aus den Zellen heraus und inkubieren Sie die Zellen mit den entsprechenden mit Fluorochrom markierten sekundären Antikörpern.Spülen Sie die nicht gebundenen sekundären Antikörper aus den Zellen aus, um eine Photobleiche und Verfärbung zu vermeiden. Die Kernmontage. Den Deckglaser mit 10 Mikrolitern ProLong Gold mit dpi.Visualisieren Sie markierte Zellen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops mit dem geeigneten Filter, um festzustellen, ob humane primäre neuronale Vorläuferzellen sich in Oligodendrozyten differenzieren können. Multipotente neuronale Vorläuferzellen wurden wie in diesem Video beschrieben kultiviert. Anschließend wurden phänotypische Veränderungen mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht.Wie hier zu sehen ist, exprimieren die Mehrheit der neuronalen Vorläuferzellen den Marker für neuroepitheliale Stammzellen, Nestin, während nur kleine Teilpopulationen linienrestringierende Marker exprimieren, wie den Astrozyten-Marker GFAP, den neuronalen Marker Klasse-drei-Beta-Tubulin oder den Oligodendrozyten-Marker O4. Nachdem das Kulturmedium durch Oligo-Medium ergänzt mit Wachstumsfaktoren ersetzt wurde und die Zellen eine Woche lang kultiviert wurden, zeigte sich nach zwei Wochen eine verminderte Expression von Nestin und eine erhöhte Expression von A2B5.Die Nestin-Expression wurde noch weiter verringert, und die Expression des neuroglialen Vorläufermarkers A two B five stieg an. Die Expression eines weiteren Oligodendrozytenmarkers, oh four, nahm zwei Tage nach dem Entzug der Wachstumsfaktoren ebenfalls zu. Die Expression von oh four sowie die Expression von GAL C, einem späten Oligodendrozytenmarker, stiegen sechs Tage nach dem Entzug der Wachstumsfaktoren an. Die Ko-Expression von oh four und gal C nahm zu und war vergleichbar mit der Ko-Expression von gal C und MBP. Die multiepitope Immunfärbung zeigt, dass 72 % der Zellen in der Kultur MBP exprimierten. Weitere Hinweise auf die Differenzierung von Vorläuferzellen in Oligodendrozyten wurden mittels eines Immunfluoreszenz-Assays charakterisiert. Zwei Tage nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren wurde die Expression von MVP, dargestellt in Grün, nachgewiesen.Dieser Wert stieg am Tag fünf an und erhöhte sich weiter bis zum Tag neun. Die Lokalisation von MVP in den differenzierten Oligodendrozyten ist deutlich erkennbar. Insgesamt zeigen diese Daten, dass Kulturen menschlicher fetaler neuronaler Vorläuferzellen, die mit der beschriebenen Methode gezüchtet wurden, in der Lage sind, in vitro zu proliferieren und dabei die Fähigkeit zur Differenzierung entlang der Stadien der Oligodendrozyten-Linie beizubehalten.Nach der Entwicklung dieses Protokolls ermöglicht die Technik Forschern auf den Gebieten der Entwicklungsbiologie, der Neurowissenschaften und der Virologie, die Biologie des menschlichen Gehirns sowie Erkrankungen, die das menschliche Gehirn betreffen, insbesondere solche, die zu weißen Materie-Erkrankungen führen, zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

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