Name: Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Gewebetechnik des Dünndarms im Mausmodell mithilfe eines Organoid-Einheiten-auf-Scaffold-Ansatzes. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung funktioneller Darmsubstitute für regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung.

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Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, und Frédéric G. Sala von der California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), Gewährung Zahlen RN2-00946-1 (TCG) und TG2-01.168 (ERB, FGS) unterstützt. Allison L. Speer ist eine Gesellschaft der Universität Surgeons Ethicon Gelehrter. Yasuhiro Torashima wird von einem Kinderkrankenhaus in Los Angeles Saban Institut Forschung Career Development Fellowship gefördert.

Ein. Organoid Units Vorbereitung <ol><li> Instrumente geeignet für Maus Dissektion (Schere und Pinzette) sollte im Autoklaven sterilisiert werden. </li><li> Menschlich einschläfern den Spender Maus nach lokalen IACUC Protokolle. Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, bevor Sie fortfahren. </li><li> Einen Mittellinieneinschnitt um Zugang zu dem Peritonealraum gewinnen. Hautlappen können reflektiert je nach Bedarf, um die Exposition zu verbessern. </li><li> Ausweiden des Dünndarms und teilen sie knapp distal des Lig. Treitz. Trennen Sie den Dünndarm von seinem Mesenterium mit scharfen und sanften stumpf. Identifizieren Sie die ileocecal Kreuzung und unterteilen den Dünndarm 5 mm proximal dazu. </li><li> Mit Schere, öffnen Sie den Darm längs der Kraterbildung Grenze in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile Hanks &#39;Salzlösung (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X Antibiotika-Antimykotika (Anti-Anti, Invitrogen) Lösung. Löschen Fäkalien aus dem geöffneten Darm mitvorsichtiges Schütteln dann übertragen eröffnet Darm zu einem 15ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X Anti-Anti. </li><li> Waschen Sie die geöffneten Darm dreimal in 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti in einem Reagenzglas. Jede Wäsche kann mit mildem Schütteln der 15 ml Tube für 30 sec durchgeführt werden. Nach Schütteln, sinkt das Darmgewebe dem Boden des Röhrchens. Entsorgen schwimmenden Material, das mesenchymalen Fremdkörpern ist. Entfernen Sie die Waschlösung vorsichtig mit einer Pipette. </li><li> Mince des gewaschenen Darm in einer Petrischale mit 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti auf weniger als 1 mm quadratische Stücke mit einer Schere. Sammeln Sie die gehackte Material mit einer automatischen Pipette und legen Sie sie in ein Reagenzglas. </li><li> Zentrifugieren bei 500 Upm für 8 min. Überstand verwerfen, die Fett-und Bindegewebes enthält. </li><li> Verdauen zerkleinertem, gewaschenem Material mit 10 ml sterilem HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml Dispase (Invitrogen) und 800 Einheiten / ml Collagenase Typ 1 (Worthington, Lakewood NJ). Bis 40 ml der Aufschlusslösung vorzubereiten, abwiegen 5 mg Dispase, 142 mg Kollagenase, und fügen Sie sterile HBSS bis zu einem Volumen von 40 ml. Diese Lösung jeweils frisch organoide Einheiten vorbereitet sind, und halten bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Fügen Sie die Aufschlusslösung direkt an den Pellet aus Schritt 1.8. </li><li> Inkubieren der Test-Röhrchen mit dem zerkleinerten, gewaschenen Materials mit der Aufschlußlösung bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Rufen Sie das Reagenzglas und weiter stören die verdaute Gewebe durch Verreiben mit einer 10 ml Pipette. Wiederholen zwischen 20 bis 50 mal, bis ein einheitliches Erscheinungsbild entsteht. </li><li> Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Überstand verwerfen, die einzelne Zellen enthält. </li><li> Stoppen des Verdaureaktion mit 10 ml 4 ° C, steril Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS HALLO-, Invitrogen). Resuspendieren pellet und schütteln Sie die Röhre. </li><li> Zentrifuge das Reagenzglas 5 min bei 800 UpM. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer automatischen Pipette bis zu den letzten paar Tropfen. Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pipette für den letzten Tropfen zu vermeiden Resuspendieren des Pellets. </li></ol> 2. Laden von Polyglykolsäure Scaffold <ol><li> Form 2-mm lang, 5-mm Außendurchmesser zylindrischen Gerüste aus Vlies Polyglykolsäure (2-mm Blechdicke, 60 mg cm-3 Schüttdichte; Porosität&gt; 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) wie in Lit. beschrieben. 4. </li><li> Schneiden Sie die distalen 2 mm eines Einweg 1.000 Mikroliter Pipette mit einer Schere mit 70% Ethanol in destilliertem Wasser zubereitet kippen. </li><li> Legen Sie das Gerüst in ein 4-Loch-Kulturplatte. Laden der organoiden Einheiten auf das Stützgerüst mit der 1000 Mikroliter-Pipette, zuerst in das Lumen und dann auf die äußere Oberfläche. Verwenden Sie eine Pinzette Beschichtung des Lumen zu gewährleisten. Nicht stören oder Aufbrechen der zylindrischen Form des Polymers. </li&gt; </ol> 3. Implantation in Wirt Maus <ol><li> Verwenden Sie einen syngenen Host Maus auf dem gleichen Hintergrund wie der Spender, falls verfügbar. Ansonsten beschäftigen einen immungeschwächten nonobese diabetischen / schwere kombinierte Immunschwäche oder NOD / SCID Tier (Jackson Laboratories, Sacramento CA). </li><li> Erbrechen Vollnarkose mit Isofluran. Rasur, prep und drapieren der Maus den Bauch. </li><li> Eine 5 mm Mittellinieneinschnitt zum Eingang in die Bauchhöhle zu gewinnen. Identifizieren und sorgfältig ausweiden das Omentum. Setzen Sie den geladenen Polymers auf das Omentum und wickeln Sie es mit dem Gewebe. Nicht reißen die Omentum. </li><li> Sichern Sie das Polymer auf die Omentum mit einem 5-0 Monocryl Naht. Gently ersetzen Omentum mit dem gewickelt Polymer in seine anatomische Position. </li><li> Schließen Sie den Bauchschnitt in Schichten mit 4-0 Vicryl Nähte. Führen Sie den Muskel-Verschluss und kümmern sich nicht um die Bauchorgane unterhalb des Einschnitts zu verletzen. Verwenden Knopfnähte für die Haut. </li><li> Verwalten postoperative Analgesie mit 2 mg / kg Ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) in sterilem Wasser als subkutane Quaddel neben dem Einschnitt. Die Tiere sollten täglich ausgewertet werden, und wenn das Tier zeigt Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, eine zusätzliche Dosis von Ketoprofen können auf postoperativen Tag 2 verabreicht werden. Mit dem dritten postoperativen Tag, sollte das Tier komplett ohne Anzeichen von Schmerzen oder Leiden wiederhergestellt werden. Wenn Schmerzen oder Leiden weiter auf postoperativen Tag 3, wird dies als abnormal und sollte in Übereinstimmung mit den IACUC und Tier Betreuungseinrichtung Protokollen angesprochen werden. </li><li> Lassen Sie die Maustaste zu erholen und das Tissue-Engineering-Darm für vier Wochen wachsen. Geben Sie das Tier ad libitum Zugang zu Nagetierfutter (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) und Wasser mit Septra 200 mg / 40 mg pro 5 ml (Hallo-Tech Pharmacal, Amityville NY) bei einer Verdünnung von 1:100. </li></ol> 4. Ernte <ol><li> Humanely euthanize das Wirtstier vier Wochen nach der Implantation. </li><li> Erneuten Öffnen der ursprünglichen Einschnitt und spiegeln die Haut kopfwärts Zugang zur Bauchhöhle erleichtern. </li><li> Öffnen Sie die Muskulatur und Identifizierung der Tissue-Engineering-Konstrukt als eine Kugel von Gewebe. </li><li> Nehmen Sie sich Verwachsungen der Konstrukt aus intraabdominellen Eingeweide mit scharfen Dissektion. </li><li> Befestigen Sie das Konstrukt in Formalin für spätere Paraffin Montage oder Verwendung das Gewebe frisch biochemischen Assays wie real-time PCR-oder Protein-Isolation. </li></ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung Tissue-Engineering-Darm der Maus über ein organoides Einheiten-on-Gerüst Ansatz. Die wichtigsten Schritte sind solche der organoiden Einheiten Zubereitung. Es ist darauf zu reinigen und ausreichend mechanisch verarbeiten das Gewebe, aber gleich ist darauf nicht overdigest oder overtriturate die organoiden Einheiten werden nach dem Verdau durchgeführt (Schritt 1.11). Wenn dies erledigt ist, die organoiden Einheiten zu Einzelzellen, die in dem Überstand von Schritt 1,12 verlo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum-Antimykotikum 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 1 </td><td> Worthington </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM high glucose 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Hitzeinaktiviertem FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 100% PGA </td><td> Concordia Medical </td><td> FELT01-1005 </td><td> Für Polymer Zubereitung nach Ref.4 </td></tr><tr><td> Poly-L-Milchsäure </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> Für Polymer Zubereitung nach Ref. 4 </td></tr><tr><td> Typ-I-Kollagen, Rattenschwanz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3867-1VL </td><td> Für Polymer Zubereitung nach Ref. 4 </td></tr><tr><td> Ketoprofen 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 71-KETOI-100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5001 Nagetierfutter </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> Septra 200 mg / 40 mg pro 5 ml, USP </td><td> Hallo-Tech Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran, USP </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering des darms in einem mausmodell

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-Engineering Dünndarm (TESI) erfolgreich verwendet worden, um Lewis Ratten nach massiven Dünndarmresektion zu retten, was im Gegenzug die präoperative Gewichte innerhalb von 40 Tagen. 1 Bei Menschen, massive Dünndarmresektion in Kurzdarmsyndrom, eine funktionelle malabsorptive führen Staat, der erheblichen Morbidität, Mortalität und Kosten im Gesundheitswesen einschließlich der parenteralen Ernährung abhängig, Leberversagen und Zirrhose, und die Notwendigkeit für multiviszerale Organtransplantation. 2 In diesem Papier verleiht, beschreiben und dokumentieren wir unser Protokoll für die Erstellung von Tissue-Engineering-Darm in einem Mausmodell mit einem vielzelligen organoide Einheiten-on-Gerüst Ansatz. Organoiden Einheiten sind mehrzellige Aggregate aus dem Darm abgeleitet, die sowohl mukosale und mesenchymalen Elemente enthalten, 3 die Beziehung zwischen denen die intestinale Stammzellnische bewahrt. 4 In laufende und zukünftige Forschung, der Übergang der Technik in derMaus zur Untersuchung der Vorgänge während TESI Bildung durch die Nutzung der transgenen Instrumenten in dieser Art beteiligt zu erlauben. 5 Die Verfügbarkeit von immungeschwächten Mausstämmen auch erlauben uns, die Technik für die menschliche Darmgewebe anwenden und optimieren die Bildung des menschlichen TESI als Maus-Xenograft vor dessen Übergang in den Menschen. Unsere Methode beschäftigt Good Manufacturing Practice (GMP)-Reagenzien und Materialien, die bereits für die Verwendung bei menschlichen Patienten zugelassen wurden, und bietet somit einen deutlichen Vorteil gegenüber Ansätzen, die auf dezellularisierten tierischen Geweben verlassen. Das ultimative Ziel dieser Methode ist die Übersetzung für den Menschen als regenerative Medizin therapeutische Strategie für Kurzdarmsyndrom.

Abbildung 1 zeigt eine Gesamtansicht Schema für das Protokoll dokumentiert. Das Endergebnis dieses Protokolls ist eine Kugel oder kugelförmige Struktur des Tissue-Engineering murinen Darm mit einem Lumen, Schleimhaut, submucosa, Muscularis und Umgebung. 2A zeigt eine typische Globus im Vergleich zum Ausgangsmaterial Polymergerüst. 2B zeigt dasselbe Konstrukt zweiklappigen scharf zu sein Lumen offenbaren. Abbildung 3 zeigt eine Hämatoxylin / Eosin-gefärb...

Dieser Artikel und das dazugehörige Video präsentieren unser Protokoll zur Erzeugung von Tissue-Engineering-Darm der Maus, mit einem organoiden Einheiten-on-Gerüst Ansatz.

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Das im Tissue Engineering hergestellte Dünndarmgewebe (Tissue-engineered small intestine, TESI) wurde erfolgreich eingesetzt, um Lewis-Ratten nach einer massiven Dünndarmresektion zu retten, was zu einer Rückkehr zu ...

Dieses Video wird unsere Technik zur Erzeugung eines gewebeengineering-basierten kleinen Darms in der Maus mithilfe eines Organoid-Einheiten-auf-Träger-Material-Ansatzes demonstrieren. In diesem Experiment wurden die Tiere gemäß den Richtlinien des Instituts für Tierpflege und -nutzung sowie der Tierpflegeeinrichtung des Savon Research Institute des Children's Hospital Los Angeles behandelt. Der erste Schritt ist die Gewinnung des gesamten Mäusedarms.Die human getötete Maus und die Instrumente werden mit 70 %igem Ethanol in Wasser präpariert, und ein medianer Schnitt wird durchgeführt, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Der Dünndarm wird ausgeweidet und kurz distal zum Ligamentum de Trietz durchtrennt. Anschließend wird er scharf und stumpf vom Mesenterium und dessen Gefäßen abpräpariert.Schließlich wird das Ileum fünf Millimeter proximal zur Ileozäkalklappe durchtrennt. Der entnommene Dünndarm ist maßstabsgetreu dargestellt. Anschließend öffnen wir den Darm entlang der antimesenterialen Grenze in Hank’s gepufferter Salzlösung mit einer antibiotisch-antimykotischen Lösung (1×).Der Darm wird dann im Gefäß von fäkalen Bestandteilen befreit, gefolgt von drei weiteren Waschschritten mit HBSS und einem Reagenzglas. Das Darmgewebe setzt sich auf den Boden des Röhrchens ab, während schwimmendes Material mesenchymalen Abfall darstellt und verworfen werden kann. Die Waschlösung wird vorsichtig mit einer Pipette entfernt.Der Darm wird dann mit einer Schere in Stücke von weniger als einem Quadratmillimeter zerkleinert. Das zerkleinerte Material wird mit einer automatischen Pipette aufgenommen. Das zerkleinerte Waschmaterial ist nun bereit zur Verdauung.Die Verdauungslösung enthält DASE 0,125 Milligramm pro Milliliter und Kollagenase 800 Einheiten pro Milliliter in HBSS mit Antibiotikum und Antimykotikum. Achten Sie auf die bräunliche Farbe der Verdauungslösung im Vergleich zu HBSS mit Antibiotikum und Antimykotikum. Sie wird frisch hergestellt, und 10 Milliliter werden dem zerkleinerten Material zugegeben.Das wird 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator inkubiert. Das Gewebe wird zusätzlich durch mehrfaches Pipettieren wie hier gezeigt aufgelöst. Dieser Vorgang wird 20 bis 50 Mal wiederholt, bis eine homogene Erscheinung erreicht ist.Die 10-Milliliter-Pipettenspitze ist optimal dimensioniert. Dazu wird die Reaktion mit drei Millilitern DMEM bei vier Grad Celsius mit 10 % Fötales Rinderserum gestoppt. Das Material wird zehn Minuten lang zentrifugiert.Bei 500 U/min wird das Überstand entfernt und das Pellet in 10 Milliliter vier Grad kaltem DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum resuspendiert. Anschließend wird fünf Minuten bei 800 U/min zentrifugiert, um das gesamte Gewebe zurückzugewinnen, mit Ausnahme einzelner Zellen, die im Überstand S verbleiben und verworfen werden. Das Pellet enthält die Organoid-Einheiten, das leichtere Material oben, gekennzeichnet durch die Pinzette, und das Material am Rand.Unterhalb dieser Schicht wird das DMEM mit Serum mit einer Pipette entfernt. Dabei wird darauf geachtet, das Pellet nicht mit der Pipette aufzuschieben. Die letzten Tropfen können sicherer mit der Einweg-Plastikpipette entfernt werden.Hier ist das Polymerscaffold aus Polyglykolsäure oder PGA dargestellt, das in unseren Experimenten verwendet wird. Die distalen zwei Millimeter einer Einweg-Pipettenspitze für 1000 Mikroliter werden mit sterilen Scheren abgeschnitten. Wir laden das Polymer mit Organoid-Einheiten in Vier-Wand-Kulturplatten auf, um die Ausbreitung des Materials vom Polymer weg zu minimieren.Die Organoid-Einheiten werden mit der Pipette zuerst in das Lumen und anschließend auf die äußere Oberfläche des Scaffolds aufgebracht. Eine zweite Pinzette wird verwendet, um eine ausreichende Beschichtung des Lumens sicherzustellen; dabei ist darauf zu achten, die zylindrische Form des Polymers nicht zu beschädigen. Die verwendete Maus als Wirt im Fall eines transgenen Spenders ist immungeschwächt und nicht fettleibig, diabetisch.Schwere kombinierte immundefiziente Gamma-Ketten-defiziente oder nod skid gamma Tiere. Alternativ können syngeneische Wirte für die Implantation verwendet werden. Nach Einleitung der Vollnarkose wird der Bauch rasiert, präpariert und abgedeckt.Ein 0,5 cm langer medianer Schnitt wird angelegt. Das große Netz wird identifiziert und vorsichtig ausgeschält. Das beladene Polymer wird in das Netz eingewickelt und mit einer 5-0-Monocryl-Naht fixiert.Es ist äußerst wichtig, dass das Omentum nicht einreißt, da sonst die Zellen in das Peritoneum austreten können. Das beladene Polymer befestigt, wird das Omentum in der Bauchhöhle zurückplatziert und diese schichtweise verschlossen. Zur Naht wird eine Vicryl-Naht vier Null in diskontinuierlicher Technik verwendet.Zunächst die Muskelschicht und dann die Haut für die postoperative Analgesie, zwei Milligramm pro Kilogramm. Ketoprofen in steriler Wasserlösung wird als subkutanes Rad neben der Inzision injiziert. Vier Wochen nach der Implantation wird das Versuchstier artgerecht euthanasiert und die ursprüngliche Inzision erneut geöffnet. Der gewebeengineeringtechnisch hergestellte Konstrukt wird als kugelförmige Struktur identifiziert und kann am Magen und intraabdominalen Organen adhärieren.Die Adhäsionen werden sorgfältig gelöst und ein Steroid aus dem gewebetechnisch hergestellten Darm gewonnen. Hier ist das gewonnene Steroid im direkten Vergleich mit dem Ausgangspolymer dargestellt. In diesem Bild wurde das Lumen des konstruierten Darms scharf eröffnet, um das Innere freizulegen.Das Gewebe kann für eine histologische Analyse fixiert oder frisch für verschiedene molekularbiologische Assays verwendet werden, wie wir in anderen Veröffentlichungen gezeigt haben. Gezeigt ist hier eine Mikroaufnahme mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung bei geringer Vergrößerung eines typischen, erfolgreich hergestellten, gewebeengineeringbasierten Dünndarm-Konstrukts. Der linke Pfeil zeigt das mit Darmschleimhaut ausgekleidete Lumen, der rechte Pfeil das Wirtspankreas.Das an den Konstrukt gebunden hat.

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Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests.

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Kleintierbildgebung Techniken ermöglichen Serien diagnostische Untersuchungen und therapeutische Interventionen in vivo. Vor kurzem hat der Umfang der Anwendungen erheblich erweitert und umfasst gegenwärtig Beurteilung Colontumorentwicklung, Wundheilung und Kontrolle von Entzündungen. Dieses Protokoll zeigt diese verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der murinen Endoskopie.

Murine Endoskopie für In Vivo Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung des Darms, die starke Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, und verhindert den Durchgang von Stuhl verursachen können. Dieses Verfahren zum Erstellen von Darm teilweise Obsructions bei Mäusen ist zuverlässig bei der Untersuchung der Mechanismen, die krankhaften Zellwachstum und Tod im Darm.

Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Wir beschreiben ein Mausmodell des postoperativen Ileus, das durch intestinale Manipulation erzeugt wurde. Die gastrointestinale Transitfunktion, die pathologischen Veränderungen und die Aktivierung der Immunzellen wurden 24 Stunden nach der Operation beurteilt.

Postoperatives Ileus-Mausmodell

Erfahren Sie die Gewebetechnik des Dünndarms im Mausmodell mithilfe eines Organoid-Einheiten-auf-Scaffold-Ansatzes. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung funktioneller Darmsubstitute für regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung.

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

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