Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.

Um maximale Erträge zu erzielen, müssen Pflanzen mit einer Reihe von Nährstoffen versorgt werden, Nährstoffmangel, Stress wie Kälte oder extreme Hitze, Trockenheit oder Krankheitserreger verursachen jedes Jahr massive Verluste beim Ernteertrag. Viele dieser Probleme haben oft ihren Ursprung im Untergrund. Die Wurzel ist der physische Anker der Pflanze, aber sie ist auch das Organ, das für die Wasseraufnahme und für die Aufnahme von Mineralstoffen wie Stickstoff, Phosphorsulfat und vielen Spurenelementen verantwortlich ist.

Wenn wir nachhaltige Ansätze für hohe Ernteerträge entwickeln wollen, müssen wir besser verstehen, wie sich die Wurzeln entwickeln, wie sie dieses breite Spektrum an Nährstoffen aufnehmen und wie sie mit symbiotischen und pathogenen Organismen interagieren. Um dies zu tun, müssen wir in der Lage sein, Wurzeln auf mikroskopischer Ebene zu erforschen Aus offensichtlichen Gründen. Die Erforschung der Biologie der Wurzeln war schon immer eine größere Herausforderung als die Untersuchung von oberirdischen Teilen der Pflanze.

Da die Wurzeln in der Regel unter der Erde verborgen sind, sind sie für mikroskopische Untersuchungen nicht leicht zugänglich. Die Entfernung aus dem Boden schädigt das Wurzelsystem stark und ist daher kein guter Weg, um ihr Verhalten zu untersuchen. Eine Lösung, um Wurzeln leichter zugänglich zu machen, besteht darin, sie auf Jeed zu züchten oder wird in diesem Beispiel in hydroponischen Medien gezeigt.

Wachstumspläne in gelierten Medien oder in hydroponischen Medien wurden in vielen Wurzelstudien sehr erfolgreich eingesetzt, aber mit diesen Methoden ist es immer noch sehr schwierig, Wurzeln mikroskopisch detailliert und über lange Zeiträume zu untersuchen, um so nah wie möglich an die wachsende Wurzel zu kommen und jeglichen körperlichen Stress durch die Vorbereitung der Bildgebung zu vermeiden. Wir bauen eine Plattform auf, die es uns ermöglicht, Wurzeln zu züchten und abzubilden, und die es uns gleichzeitig ermöglicht, die Mikroumgebung der Wurzeln mit sehr hoher Präzision und Geschwindigkeit zu kontrollieren und zu modifizieren. Diese Plattform nannten wir den Root-Chip. Der Wurzelchip ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus PDMS, einem organischen Polymer auf Silikonbasis, hergestellt wird.

Der Chip verfügt über Beobachtungskammern für das Wachstum und die Abbildung von Wurzeln aus einem Kaninchen-Opsis-Sämling. Die Samen keimen zunächst in Kunststoffkegeln aus Kunststoffpipettenspitzen, die wir mit festen Medien füllen. Die Wurzelspitze wächst dann durch das Medium und erreicht die Kammer, wo sie einen kontinuierlichen Fluss von flüssigem Medium erfährt, wobei die Bedingungen in der Kammer erhalten bleiben.

Konstante mikromechanische Ventile, die vom Labor von Steve Quake an der Stanford University entwickelt wurden, sind hier in roter Steuerung dargestellt. Da der Chip auf einem transparenten Deckglas montiert ist, wie es typischerweise für die Mikroskopie verwendet wird, können alle Vorgänge in der Beobachtungskammer an einem inversen Mikroskop überwacht werden. Unter dem Mikroskop ist die gegabelte Kanalstruktur zu sehen, die den Flüssigkeitsstrom leitet.

Der Wurzelchip besteht aus zwei Schichten, einer Kontrollschicht, die die Ventile enthält, und einer Strömungsschicht, die die Kanäle enthält, durch die die Testlösungen für Wachstumsmedien in die Beobachtungskammern fließen. Das Volumen dieser Kammern beträgt etwa 400 Nanoliter. Das bedeutet, dass nur sehr geringe Mengen an Lösung benötigt werden und die Bedingungen sehr schnell geändert werden können.

Dieses Protokoll beschreibt, wie lebende Wurzeln von acht oder Arabidopsis-Sämlingen für die parallele mikroskopische Bildgebung auf dem Wurzelchip vorbereitet und bis zu drei Tage lang beobachtet werden, indem zunächst eine 10-Millimeter-Petrischale mit einem Wachstumsmedium gefüllt wird, das 1%Agar enthält, solange das Medium noch flüssig ist. Füllen Sie 10 Mikroliter Pipettenspitzen mit einer Mehrkanalpipette mit fünf Mikrolitern Medium aus der Petrischale. Die gefüllten Spitzen werden in der Pipettenspitzenbox aufbewahrt, bis das Medium fest ist.

Schneiden Sie dann in vier Millimeter lange Kunststoffkegel und legen Sie sie aufrecht in eine Petrischale, die festes Wachstumsmedium enthält. Nach der Oberflächensterilisation werden einzelne Samen auf die mediengefüllten Kegel gelegt. Die Schale wird dann mit Mikroporenband versiegelt und die Platte bei vier Grad gelagert, um die Keimung zu synchronisieren.

Nach drei Tagen werden die Platten in einen Wachstumsschrank überführt, um mit der Keimung zu beginnen. Unsere Wachstumsbedingungen in diesem Experiment liegen bei 23 Grad. Bei einem 16-stündigen Dunkelzyklus zwischen fünf und sieben Tagen nach der Keimung sollte der Sämling bereit für den Transfer in die gesunde Wurzellänge des Wurzelchips-Sämlings sein, und gegebenenfalls sollte die Expression eines Fluoreszenzmarkers unter einem Präpariermikroskop überprüft werden.

Sobald die Wurzelspitzen der Sämlinge den unteren Auslass des Kunststoffkegels erreichen, werden einzelne Sämlinge für den Transfer auf den Chip markiert. Es sollten etwa 10 Pflanzensämlinge ausgewählt werden, falls einer während des Transfers beschädigt wird, um den Wurzelchip zu sterilisieren. Für Langzeitexperimente wird das Gerät in Gewebe gewickelt, in eine gläserne Petrischale und einen Autoklaven gelegt.

Dieser Chip wurde zuvor nur autoklaviert. Das Experiment nach dem Abkühlen des Chips wird mit flüssigen Wachstumsmedien überlagert. Der Chip sollte vollständig bedeckt sein, aber der Flüssigkeitsstand sollte nicht höher als drei Millimeter über der Chipoberfläche liegen.

Eine 20-Mikroliter-Pipette wird verwendet, um das Medium durch den Wurzeleinlass und den Kammerauslass zu ziehen. Dadurch wird die Beobachtungskammer gefüllt. Mit ausgewählten Medien werden nun Kunststoffkegel in den Wurzelchip gesteckt.

Der Konus sollte genau in die Einlässe passen. Da der Wurzelchip auf einer dünnen Schicht optischem Glas montiert ist, muss man darauf achten, nicht zu viel Druck auf den Chip auszuüben. Während dieses Schritts wird der Chip nun für eine Inkubation über Nacht im flüssigen Medium vorbereitet, um ein Aufschwimmen des Chips zu verhindern.

Zwei Glasobjektträger, einer in zwei Hälften geschnitten, werden auf den Chip gelegt. Ein magnetischer Rührstab wird hinzugefügt und die Schale wird verschlossen. Die Baugruppe wird nun in ein magnetisches Rührwerk überführt, das das Medium sanft bewegt, um das Wurzelwachstum in Richtung der Auslässe zu erleichtern.

Die Wurzelchips. Die Einlässe sind schräg gestanzt, um das Wachstum in die gewünschte Richtung weiter zu unterstützen. Kippen Sie die Baugruppe leicht, indem Sie die Seite des Chips, die den Ausgängen gegenüberliegt, anheben.

Der Chip wird mit einer Ringlampe beleuchtet Verbunden mit einer Zeitschaltuhr, um den Hell-Dunkel-Rhythmus beizubehalten. Nach der Inkubation über Nacht wird das flüssige Wachstumsmedium in einem verschließbaren, unter Druck stehenden Fläschchen hergestellt. Die folgenden Schritte sollten schnell und ohne Unterbrechung durchgeführt werden, um ein Austrocknen der Sämlinge zu verhindern.

Der Chip wird nun aus dem flüssigen Medium entnommen und kopfüber in die untere Öffnung des Chipträgers gelegt, die ebenfalls invertiert ist. Der Chip muss so ausgerichtet sein, dass die Seite, die die Steuerschichteinlässe enthält, zur Seite der Druckleitung zeigt. Zwei große Verbinder in der Seitenwand des Trägers.

Das Deckglas auf der Unterseite des Chips wird durch schonendes Tupfen mit Seidenpapier getrocknet und auf den Träger geklebt. Mit Klebeband wird dann die gesamte Baugruppe umgedreht. Die Schlauchverbinder werden mit einer Spritze mit Wasser befüllt und jeder Schlauchverbinder wird in den entsprechenden Einlass gesteckt.

Auf dem Chip. Der Schlauch wird in das Medium und die Lösung eingesteckt. Fläschchen und Luft werden dann aus den Leitungen entfernt, indem mit einer Luftspritze Druck auf die Lösungsgalle ausgeübt wird, wobei der Träger mit transparentem Kunststoff bedeckt ist.

Um eine hohe Luftfeuchtigkeit in der Baugruppe aufrechtzuerhalten, wird der Träger auf den Mikroskoptisch gelegt. Er sollte genau in die Kerben der Bühne passen. Die Späneventile sowie der Durchfluss des Mediums durch den Späne werden durch den Luftdruck gesteuert.

Zwei Leitungen mit Reglern sind von einer Hauptdruckleitung abgezweigt. Einer wird zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses verwendet und der andere ist mit Magnetluftventilen verbunden. Diese Ventile werden vom Computer aus über die USB-Ventilsteuerung bedient und sind für die Ansteuerung der Ventile auf dem Chip zuständig.

Beide Druckregler sollten geschlossen werden, bevor der Chip angeschlossen wird. Schläuche, Konnektoren und Lösungsfläschchen werden nun an den entsprechenden Druckleitungen befestigt. Einige Milliliter Wasser werden in die Behälter des Trägers gegeben.

Dieser Schritt muss möglicherweise im Laufe längerer Experimente wiederholt werden. Um die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, halten Sie die Volumenlast, um die potenzielle Menge an Flüssigkeit zu minimieren, die auf das Mikroskop verschüttet werden könnte. Das Ringlicht wird über dem Chip in Position gebracht, um den Helldunkelzyklus bis zum Beginn des Experiments aufrechtzuerhalten.

Ventile auf dem Chip werden durch Ausüben von Druck geschlossen, in diesem Fall durch Öffnen der Magnetluftventile. Die Benutzeroberfläche der Laboransicht ermöglicht die Steuerung der Ventile, indem Sie auf die Schaltfläche unter der Ventilnummer klicken. Hellgrün zeigt an, dass Druck ausgeübt und das Späneventil geschlossen wird.

Dieses Schema veranschaulicht die Organisation des Ventilsystems, während die Ventile vier bis acht als Einzelventile wirken, Ventil null bis drei wirken. In Gruppen mit diesem System kann eine einzelne Kammer angesprochen werden, indem beispielsweise eine Kombination von Ventilen aktiviert wird, um den Fluidstrom ausschließlich in die dritte Kammer zu leiten, müssen die oberen Ventile Null, Drei und Vier geschlossen werden. Darüber hinaus steuern die Ventile sechs, sieben und acht, welche Lösung zum Spülen der Einlässe A, B und C verwendet wird, und aktivieren nun alle drei Lösungseinlassventile, um sie zu schließen.

Die Controller-Schnittstelle verfügt über eine Rückkopplungsschleife, die eine Überwachung des Systemzustands ermöglicht. Diese Funktion kann durch Klicken auf die Schaltfläche "Zurücklesen" aktiviert werden. Der Druckregler für die Steuerschicht wird zuerst geöffnet und auf 15 PSI eingestellt.

Dann wird der Regler für die Strömungsschicht geöffnet und auf fünf PSI eingestellt. Das Einlassventil für das Wachstumsmedium der Wahl wird geöffnet und die Kammern werden mit dem Medium gespült. Die Strömungswege sollten unter dem Mikroskop überprüft werden. In den meisten Fällen ist Luft in den Kanälen eingeschlossen und muss abgeführt werden.

Zusätzlich befindet sich in den Kanälen der Steuerluft noch Luft, die herausgedrückt und durch das Wasser aus den Schlauchanschlüssen ersetzt werden muss. Dieser Vorgang wird als Sackgassenfüllung bezeichnet. Beide Aufgaben werden erreicht, indem jede der acht Kammern mehrmals gespült wird, bis die gesamte Luft aus den Kanälen in das PDMS gedrückt wird.

Das System kann so programmiert werden, dass es Experimente automatisiert. Solche Routinen können auch zur Entgasung des Chips verwendet werden. Der Hauptzweck des Root-Chips besteht darin, eine Bildgebungsplattform zu kombinieren Und ein Profusion-System in einem einzigen Gerät.

Um die Manipulation der Mikroumgebung von Wurzeln zu demonstrieren, spülten wir die Kammern mit Farbstoff und maßen den Flüssigkeitsaustausch innerhalb der Kammern. Bei dem empfohlenen Druck von fünf PSI maßen wir innerhalb von 10 Sekunden einen vollständigen Austausch bei einer berechneten Durchflussrate von etwa 1,5 Mikrolitern pro Minute. Wir beobachteten auch das Wurzelwachstum von Sämlingen, in diesem Fall, die im Dunkeln gezüchtet und mit 10 Millimolar Glukose als externe Energiequelle versorgt wurden.

Abhängig von den Wachstumsbedingungen wie Licht und Zusammensetzung des Mediums können die Pflanzen bis zu drei Tage im Wurzelchip beobachtet werden. Dieses System wurde verwendet, um intrazelluläre Glukose- und Galaktosespiegel in Wurzeln zu überwachen, die genetisch kodierte Nanosensoren exprimieren. Diese Sensoren, die auf der Erst- oder Resonanzenergieübertragung oder dem Bund basieren, wurden im Fromer-Labor entwickelt.

Für dieses Experiment wurden die Wurzeln im Chip mit quadratischen Impulsen aus Glukose- oder Galaktoselösung durchblutet. Die intrazellulären Zuckerspiegel wurden überwacht und sind hier dargestellt, ausgedrückt als Verhältnis der Intensität des Akzeptors Fluoro-4-Citrin zur Intensität des Spender-ECFP auf der linken Seite. Wir beobachten die Menge der Sensoren Citrin im mittleren oder ratiometrischen Bild der Wurzelspitze, und auf der rechten Seite verfolgen wir die Zuckermenge als Reaktion auf drei wiederholte Quadratimpulse von Glukose in Grün und Galaktose, dargestellt in Rot.

Der Anstieg des Verhältnisses deutet auf eine Anhäufung von Zucker hin. Die Hauptvorteile des Wurzelchips gegenüber herkömmlichen Wachstumsmethoden sind die minimalinvasive Vorbereitung für die Mikroskopie, die Möglichkeit, das Wurzelmilieu reversibel und wiederholt zu verändern und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Beobachtung von entwicklungskompetentem und physiologisch gesundem Gewebe über einen Zeitraum von Tagen. Ein weiterer wirklich wichtiger Vorteil ist, dass nur minimale Mengen an Flüssigkeit benötigt werden, um die Wurzeln im Laufe der Zeit mit allen notwendigen Nährstoffen zu versorgen.

Dies macht den Wurzelhack sehr kostengünstig, insbesondere wenn teure Reagenzien ausgebracht werden. Wir optimieren den Wurzelchip weiter und erweitern seine Nutzbarkeit, weil wir glauben, dass mikrofluidische Werkzeuge wie der Wurzelchip durch die bessere Zugänglichkeit dieses wichtigen Organs für Behandlungen und Beobachtungen möglicherweise neue Dimensionen der Pflanzenforschung eröffnen werden. Weitere Informationen zum Aufbau eines Root-Chip-Systems finden Sie auf unserer Website.

Chips können bei der Stanford Foundry bestellt werden.