Name: Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Lernen Sie die RootChip-Mikrofluidik-Technik zur Langzeitbeobachtung von Arabidopsis-Wurzeln. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle des Wurzelmikroenvironments und kontinuierliches Fluoreszenz-Imaging.

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Wir danken Philipp Denninger um Hilfe bei der Vorbereitung und Video Bhavna Chaudhuri für die Bereitstellung von pflanzlichen Linien auszudrücken FRET-Sensoren. Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Science Foundation (MCB 1021677), das Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) zu WBF, die National Institutes of Health und dem Howard Hughes Medical Institute an SRQGG unterstützt wurde durch ein EMBO lange unterstützt -Term Fellowship. MM wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte vorbereitenden Schritte unter sterilen Bedingungen. 1. Vorbereitung von Kunststoff-Kegel für die Keimung der Samen <ol><li> In eine 10 cm Petrischale mit Wachstumsmedium, das 1% Agar in einer Dicke von 5 mm. Wir verwenden eine halbe Stärke modifizierte Hoagland Medium 4, aber mittel-Zusammensetzung sollte so gewählt werden, um individuelle experimentellen Anforderungen angepasst werden. </li><li> Während das Medium noch flüssig ist, verwenden Sie einen Mehrkanal-Pipette bis 10 ul Pipettenspitzen mit 5 ul Medium aus der Petrischale zu füllen. </li><li> Lagern Sie die gefüllten Spitzen in der Pipettenspitze Feld, bis das Medium ist solide, dann bis 4 mm langen Kunststoff-Kegel und aufrecht in eine Petrischale mit einem soliden Wachstum mittel geschnitten. </li></ol> 2. Samenkeimung und Wachstum des Keimlings <ol><li> Auftauchen sterilisieren Samen in 5% NaOCl für 5 min waschen dreimal mit sterilem Wasser, dann einen einzigen Samen oben auf jeder der mittel-gefüllten Kegels. </li><li> Verschließen Sie die Schale mit Mikroporeklebeband (3M) und bei 4 ° C zur Keimung zu synchronisieren. </li><li> Nach drei Tagen, übertragen Sie die Platten zu einem Wachstum Schrank, um Keimung zu beginnen. Unser Wachstum Bedingungen sind 23 ° C bei einer hohen light/8h 16h Dunkel-Zyklus (Lichtintensität: 100 uE m -2 s -1). </li><li> Zwischen 5 und 7 Tage nach der Keimung, die Sämlinge sollten bereit sein, für die Übertragung zum RootChip. Zu diesem Zeitpunkt sollte Wurzelspitzen in der Nähe der unteren Auslässe der Kunststoffkegeln sein. Überprüfen Sie Sämling Gesundheit, Wurzellänge und, falls zutreffend, Expression eines fluoreszierenden Marker unter einem Binokular. </li><li> Markieren Sie einzelne Setzlinge für die Übertragung auf den Chip. Wählen Sie zehn oder so Sämlinge falls man diese während der Übertragung beschädigt. </li></ol> 3. Transfer von Sämlingen auf die RootChip <ol><li> Um die RootChip für langfristige Experimente sterilisieren, wickelndas Gerät in Seidenpapier, in eine Glas-Petrischale, und Autoklaven. </li><li> Sobald die RootChip abgekühlt ist, bedecken Sie es mit flüssigen Nährmedium. Die RootChip sollten vollständig eingetaucht werden, sondern der Flüssigkeitsstand sollte nicht mehr als 3 mm über der Oberfläche RootChip sein. </li><li> Mit einem 20 ul Pipette, ziehen Medium durch die Wurzel Einlass-und Auslass Kammer, um die Beobachtung Kammer mit Medium füllen. </li><li> Stecken Kunststoffkonen in Schritt 2.5 in die Buchten RootChip ausgewählt. Die Kegel sollte eng anliegen in den Buchten. Da die RootChip auf einer dünnen Schicht aus optischem Glas montiert ist, nicht zu viel Druck auf den Chip. </li><li> Inkubieren Sie die RootChip über Nacht in einem flüssigen Medium. Um zu verhindern, schwimmend, legen Sie zwei Glasplättchen auf den Chip. Fügen Sie einen Magnetrührer und schließen Sie die Schüssel. </li><li> Übertragen Sie die Montage auf einem Magnetrührer und vorsichtig geschwenkt, das Medium. </li><li> Die RootChip die Buchten schneiden die Sender zu einem Winkel von 30 ° auf das Gerät normal FACIlitate Wurzelwachstum in die Kanäle (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterstützung des Wachstums in die gewünschte Richtung, kippen Sie die Montage leicht, indem Sie einen Objektträger aus Glas unter der Petrischale auf der Seite des Chips gegenüber der Auslässe. </li><li> Um das Licht / Dunkel-Zyklus zu halten, beleuchten die Sämlinge mit einer Ringleuchte (Lichtintensität: 100 uE m -2 s -1), verbunden mit einer Zeitschaltuhr. </li></ol> 4. Anschließen des RootChip an die LVG <ol><li> Am folgenden Tag, füllen einen verschließbaren, druckbeaufschlagbaren Fläschchen mit flüssigem Nährmedium (Abbildung 1B). </li><li> Kehren Sie die Chip-Träger und legen es auf eine stabile Oberfläche. Entfernen Sie die RootChip aus dem flüssigen Medium und setzen Sie sie PDMS Seite nach unten in die untere Öffnung des Chip-Trägers. Orient den Chip, so dass die Seite mit den Steuerschicht Einlässe zugewandten Seite der Druckleitung Schlauchverbinder in dem Träger Seitenwand. </li><li> Trocknen Sie das Deckglas auf dieBoden des Chips durch leichtes Blotting mit Tissue-Papier. Sichern Sie die RootChip auf dem Träger mit Klebeband und rechts der ganzen Versammlung. </li><li> Schlauchverbinder werden durch Schneiden flexiblem Kunststoff Microbore Schlauch (TYGON, 0,20 &quot;ID x 0.060&quot; OD) in 5 cm lange Stücke und deren Verbindung zu Edelstahl Microbore Röhren (New England Small Tube, 0,025 &quot;AD x 0,013&quot; ID x 0,75 gemacht &quot; lang). Füllen Sie die Schlauchanschlüsse mit Wasser mit einer Spritze und stecken jede Schlauch-Anschluss in das entsprechende Control Layer Einlass auf dem Chip. Das Wasser wird später füllen die Kontrolle Schicht Kanäle und verwendet, um den Druck auf die mikromechanische Ventile übertragen werden. </li><li> Stecken Sie die entgegengesetzten Enden der Linien in den Medien / Lösung Durchstechflasche (n). Üben Sie Druck auf die Lösung Fläschchen mit einer Spritze von Luft. Die erhöhte Luftdruck innerhalb der Lösung Fläschchen wird Flüssigkeit in die Leitungen zu zwingen. </li></ol> 5. Montage des RootChip am Mikroskop <ol><li> Setzen Sie den Träger auf den MikroskopOPE Bühne. Um die Möglichkeit der Anordnung Verschieben innerhalb des Experiments durch Vibrationen in den Raum zu verringern, sollte der Träger exakt in die Kerben der Einsatzplatte. </li><li> Die Chip-Ventile und die Strömung des Mediums durch den Chip werden durch Luftdruck gesteuert. Zwei Linien mit Regulatoren sind aus einer Hauptdruckleitung verzweigte - eine solche verwendet wird, um das Medium durch die Kanäle zu steuern, und der andere mit elektropneumatische Ventile, die die Push-up-Ventile der Steuerungsschicht Betätigung verbunden ist. Die Magnetventile werden vom Computer über den USB-Ventilsteuerung (entwickelt von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab) betrieben. Schließen Sie beide Druckregler, bevor Sie den Chip. </li><li> Fügen Sie ein paar ml Wasser zu den Stauseen des Trägers zu halten hoher Luftfeuchtigkeit innerhalb der Baugruppe. Dieser Schritt sollte über Verlauf der mehr Experimente, um die Pflanzen vor dem Austrocknen bewahren wiederholt werden. Lassen Sie die Lautstärke zu minimieren ter Menge an Flüssigkeit, die auf das Mikroskop fließen könnte. Für Langzeit-Experimenten, kann der Abfluss aus der Chip-Outlets in den Stauseen des Trägers durch die Verbindung der Chip-Filialen zu den Stauseen mit Microbore Schlauch (siehe Schritt 4.4) geführt werden. Alternativ kann der Ausfluss, der auf der Chip-Oberfläche sammelt durch Pipettieren gesammelt werden. </li><li> Bereiten squared Blatt aus transparentem Kunststoff von Klarsichthüllen (C-Line). Den durchsichtigem Kunststoff des Trägers durch doppelseitiges Klebeband mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Anordnung zu halten. </li><li> Positionieren Sie den Ring leicht über den Chip und Pflege der Hell / Dunkel-Zyklus. Das Ringlicht sollte ausgeschaltet werden, bevor dem Beginn jedes Experiment, das fluoreszierende Marker verwendet, da die direkte Beleuchtung mit Bild Kollektion stören wird eingeschaltet. </li></ol> 6. Die Bedienung des RootChip mit dem LabVIEW-Schnittstelle Die RootChip Controller-Schnittstelle für die LabVIEW-Software-Plattform könnenvon unserer Website heruntergeladen werden <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Die Ventile auf dem Chip werden durch Aufbringen von Druck auf die Steuerschicht, in diesem Fall durch Öffnen der elektropneumatische Ventile geschlossen. Der Controller-Schnittstelle ermöglicht die Betätigung der Ventile durch Anklicken des Buttons unter dem Ventil-Nummer. Helles Grün zeigt an, Anwendung von Druck und Schließen eines Ventils Chip (Abbildung 2B). Aktivieren Sie alle drei Einlassventile-Lösung in der Controller-Schnittstelle vor dem Öffnen der Druckregler. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle verfügt über eine Feedback-Schleife, die Überwachung der den Zustand des Systems ermöglicht. Diese Funktion kann durch einen Klick auf den &quot;Rücklesen&quot;-Button in der Controller-Schnittstelle aktiviert werden. </li><li> Öffnen Sie den Druckregler für die Steuerung Schicht und zunächst auf 15 psi eingestellt, öffnen Sie dann den Regler für den Fluss-Schicht und zunächst auf 5 psi eingestellt. AbhängigkeitDing von der gewünschten Strömungsrate, können die Drücke später eingestellt werden. </li><li> Öffnen Sie das Einlassventil für das Wachstum Medium der Wahl, um die Kammern mit Medium spülen. </li><li> Überprüfen Sie Fließwege unter dem Mikroskop. Typischerweise wird die Luft in den Strömungskanälen gefangen und muss entfernt werden. Zusätzlich sind die Kanäle des Control-Schicht noch Luft enthalten, die durchgeführt werden müssen und gezwungen durch das Wasser aus dem Schlauch-Anschlüsse (Dead-End-Füllung) ersetzt. Beide Aufgaben werden durch Spülen jedes der acht Kammern mehrfach (5 psi) bis die gesamte Luft aus den Kanälen in der PDMS (&quot;Entgasen&quot;) gezwungen wird, erreicht. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle kann so programmiert werden, um Experimente zu automatisieren. Solche Routinen können auch zu entgasen dem Chip verwendet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Der Hauptzweck des RootChip ist es, eine Imaging-Plattform und einer Durchströmungsauslaßvorrichtung System in einem Gerät mit einem hohen Maß an Integration zu verbinden. Um die Manipulation nachweisender Mikroumgebung von Wurzeln gespült wir die Kammern mit dunklen Lebensmittelfarbe (1:4 Verdünnung in Hydrokultur-Medium) gemessen und den Austausch von Flüssigkeit in den Kammern. Bei der empfohlenen Druck von 5 psi messen wir einen vollständigen Austausch innerhalb von 10 Sekunden bei einem berechneten Flussrate von ca. 1,5 ml / min (Abbildung 3). Wir beobachteten auch Wurzelwachstum von Sämlingen, in diesem Fall im Dunkeln gewachsen und mit 10 mM Glucose als eine externe Energiequelle (4). Abhängig von den Wachstumsbedingungen wie Licht und Zusammensetzung des Mediums, können Pflanzen in der RootChip für bis zu drei Tage lang beobachtet. Die RootChip wurde genutzt, um intrazelluläre Glukose und Galaktose Ebenen in Wurzeln zum Ausdruck genetisch kodierte Nanosensoren, auf Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 7.5 basieren überwachen. Wurzeln in der Chip wurden mit Rechteckimpulsen von Glukose oder Galaktose-Lösung perfundiert ( <strong&gt; Abbildung 5). Die intrazelluläre Niveaus von Zucker wurden überwacht und werden hier ausgedrückt als Verhältnis der Intensität des Akzeptor-Fluorophor Citrin der Intensität des Spenders ECFP gezeigt. Der Anstieg der Kennzahl zeigt Anhäufung von Zucker. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. RootChip Prinzip. <ol class="ualpha"><li> Die Beobachtung RootChip verfügt über acht Kammern für das Wachstum von Wurzeln und Imaging. Die Samen zuerst in Kunststoffkonen keimen - gefertigt aus Kunststoff Pipettenspitzen - welche mit festen Medium gefüllt ist. Die Wurzelspitze wächst durch das Medium und erreicht den Raum, in dem ein kontinuierlicher Strom von flüssigem Medium hält die Bedingungen in der Kammer konstant. Mikromechanischen Ventilen (rot) steuern den Fluss. Der Chip basiert auf einem optischen Deckglas montiert. Zeichnung nicht maßstabsgerecht. (Adaptiert mit Erlaubnis von Grossmann et al., Plant Cell 2011.) </li><li> Scheme eines druckbeaufschlagbaren Lösung Fläschchen mit Membran (rot). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Anschließen und montieren RootChip. <ol class="ualpha"><li> Draufsicht auf die in vollem Umfang angeschlossen RootChip und Träger montiert auf einem inversen Mikroskop. </li><li> Schema, das die Ventilanordnung und die Controller-Schnittstelle. Ein Beispiel für ein Ventil Einstellung, um die Fluidströmung zu einer einzigen Kammer führen gezeigt. Während die Ventile 4 bis 8 wirken als einzelne Armaturen, Ventile 0 bis 3 Akt in Gruppen. Mit diesem System wird eine einzelne Kammer kann durch die Aktivierung einer Kombination von Ventilen gerichtet werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Austausch von Lösungen in der Beobachtung, chBernsteinen. Visualisierung der Austausch von Flüssigkeit in einem Beobachtungsraum mit Farbstofflösung. Das Bild ist eine Überlagerung von Hellfeld-und falsch-farbige Intensität des Farbstoffs Signal. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. On-Chip-Wurzelwachstum. Beobachtung eines einzelnen wachsenden Wurzel Expression eines fluoreszierenden FRET Nanosensor für Glucose / Galactose im Laufe der 20h. Zeitformat: hh: mm; Maßstab: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Messung der intrazellulären Blutzuckerspiegel mittels FRET Nanosensoren. <ol class="ualpha"><li> Die Höhe der Sensor als Citrin Intensität innerhalb der Wurzelspitze (links) dargestellt. Die Reaktion des intrazellulären FRET Nanosensor der Anwendung von Glucose oder Galactose Lösung ratiometrische Bildern gezeigt. (Mit freundlicher Genehmigung von Grossmann et al Angepasst., 2011 PlaNT-Cell) Balkenlänge. 100 um. </li><li> Tracing FRET-Verhältnis ändert sich als Reaktion auf drei wiederholten Rechteckimpulse von Glucose (grün) und Galactose (rot). </li></ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%3A+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li>
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<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
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<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
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<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Hauptvorteile des RootChip gegenüber herkömmlichen Methoden sind das Wachstum minimal-invasive Präparation für die Mikroskopie, die Fähigkeit, reversibel und wiederholt verändern die Root-Umgebung, und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Beobachtung von entwicklungspolitisch kompetente und physiologisch gesundes Gewebe über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Zuvor wurden die Keimlinge senkrecht auf gelierten Medium gezüchtet und auf eine Perfusionssystem unmittelbar vor dem Experiment, das nur die Messung eine einzige Ursache zu einer Zeit 8 erlaubt. Mikrofluidik-Tools wurden für Arabidopsis, aber auf einem niedrigen Integrationsgrad 9 oder ohne Perfusion Steuerung 10 verwendet worden. Die RootChip verbindet ein hohes Maß an Integration mit der Fähigkeit, durch genaue Experimente Strömungsführung zu automatisieren. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform Merkmal aller mikrofluidischen Vorrichtungen 11, ist, dass nur minimale Mengen an Flüssigkeit benötigt, um die Wurzel mit der erforderlichen Mutter zuzuführenkontrollierten Nährstoffeintrag, auch für Experimente über mehrere Tage. Die RootChip wird derzeit als Einweg-Gerät konzipiert, aber da die Produktionskosten von Chips niedrig sind, macht die kleine Mengen an Reagenzien verbraucht der Chip immer noch sehr kostengünstig. Es gibt ein paar kritische Schritte, die ergriffen werden, um die Gesundheit der Setzlinge garantiert werden muss: Das Volumen in der Kunststoff-Kegel ist nur 3-4 ul, die beginnen, um zu trocknen, wenn sie der Luft ausgesetzt wird. Daher ist es wichtig, dass die Zapfen auf den Chip übertragen werden schnell und Feuchtigkeit hoch gehalten wird, bis die Wurzeln der Beobachtungskammern, die sie mit ausreichend Wasser liefert erreicht haben. Schritte von 4,2 bis 4,5 sollte schnell und ohne Unterbrechung der Trocknung der Sämlinge zu verhindern durchgeführt werden. Schritte von 3,5 bis 3,8 beschreiben die Inkubation des Chips in flüssigen Medien, in denen die Wurzeln wachsen in die Beobachtungskammern. Dieser Schritt kann durch Montage des Chips in die c übersprungenarrier sofort ab und konstante Perfusion mit Wachstumsmedium. Wir empfehlen jedoch, Einweichen in Wachstumsmedium über Nacht, da sie einige Vorteile hat: 1) es schafft eine feuchte Umgebung, damit die Keimlinge weniger wahrscheinlich geworden ausgetrocknet, als sie in der Beobachtung Kammer wachsen sind; 2) wird der Chip in Flüssigkeit getränkt, so Entgasung (Schritt 6.4) wird schneller sein. Es ist wichtig, um Medien mit niedrigen Konzentrationen der gelösten Stoffe zu verwenden. Mehr konzentrierten Lösungen können ausfallen und verstopfen die Kanäle, insbesondere, wenn der Chip über mehrere Tage verwendet wird. Sobald das Gerät in der Druckluftleitung verbunden ist, wird die Strömung des Mediums, indem hydraulische Druck in den Ventile gesteuert. Um eine ordnungsgemäße Schließung der mikromechanische Ventile gewährleisten, ist es wichtig, einen Steuerdruck, die etwa dreimal höher als der Fließdruck zu wählen. Der Fließdruck sollte nicht mehr als 15 psi als die Flüssigkeit wird aus der Wurzel Buchten geschoben werden. Höhere Drücke may auch dazu führen, Delamination der Chip, der den Chip unbrauchbar macht. Eine Begrenzung der RootChip ist, dass PDMS porösen auch hydrophob ist. Während das Material praktisch inert ist gegenüber wässrigen Lösungen, kann es zu absorbieren organischen Verbindungen 12. Dies kann mit einem raschen Austausch von Lösungen als organische Verbindungen aus dem Material selbst wenn die Zufuhr dieser Verbindung an dem Einlass wurde gestoppt entweichen kann, beeinträchtigen. Aufgrund der Porosität kann die Verwendung von organischen Lösungsmitteln Aufquellen des PDMS 12. Wir unterstützen weiterhin die RootChip optimieren und erweitern ihren Nutzen, zum Beispiel mit Wurzeln von Nutzpflanzen. Wir glauben, dass durch die Verbesserung der Zugriff auf das Root für Behandlungen und Beobachtung, Mikrofluidik-Tools wie der RootChip eröffnen sich neue Dimensionen der Wurzel Forschung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Quelle </td><td> Information </td></tr><tr><td> Chip-Träger, Software und andere Informationen. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> CAD-und CNC-Dateien für Träger Fertigung, Controller-Software und weitere Informationen stehen zum Download auf der Website <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> Träger können auch von dieser Website bestellt werden. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Foundry </td><td> Mask Design und Fertigung Protokolle sind auf Anfrage erhältlich. Ready-to-use RootChips kann bestellt werden bei <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip-Controller </td><td> -Home-gebaut</td><td> Die automatisierte Ventilsteuerung System wurde ursprünglich von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab entwickelt. Eine detaillierte Anleitung, wie Sie Ihre eigenen Controller bauen Ventil sind zu finden unter <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

zeitraffer-fluoreszenz-imaging von arabidopsis wurzelwachstum mit rapid manipulation der root-umgebung mit dem rootchip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Die Root-Funktionen wie die physische Verankerung der Pflanze und ist das Organ für die Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphor-, Sulfat-und Spurenelementen, die Pflanzen aus dem Boden zu erwerben. Wenn wir nachhaltige Konzepte für die Herstellung qualitativ Ernteertrag entwickeln wollen, müssen wir besser verstehen, wie die Wurzel, entwickelt greift ein breites Spektrum an Nährstoffen, und interagiert mit symbiotischen und pathogenen Organismen. Um diese Ziele zu erreichen, müssen wir in der Lage sein Wurzeln im mikroskopischen Detail über Zeiträume von Minuten bis Tagen zu erkunden. Wir entwickelten die RootChip, ein Polydimethylsiloxan (PDMS) - basierte Mikrofluidik-Vorrichtung, die uns zu wachsen und Wurzeln Bild von Arabidopsis-Keimlinge können unter Vermeidung jeglicher körperlicher Belastung zu Wurzeln während der Vorbereitung für die Abbildung 1 (Abb. 1). Das Gerät enthält einen gegabelten Kanalstruktur mit mikromechanischen, um die Fluidströmung leitenaus der Lösung Einlässen zu jedem der acht Beobachtung Kammern 2. Diese Perfusion System ermöglicht die Wurzel Mikroumgebung gesteuert und modifiziert werden mit Präzision und Geschwindigkeit. Das Volumen der Kammern beträgt etwa 400 nl und erfordern somit nur minimale Mengen an Testlösung. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Studium der Biologie an der Wurzel RootChip mit bildgebenden Ansätze mit Echtzeit-Auflösung. Roots kann über mehrere Tage mit Zeitraffer-Mikroskopie analysiert werden. Roots mit Nährlösungen oder Inhibitoren durchströmt werden, und bis zu acht Sämlinge können parallel analysiert werden. Dieses System hat das Potenzial für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Analyse des Wurzelwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von Chemikalien, Fluoreszenz-basierte Analyse von Genexpression, und Analyse von Biosensoren, zB FRET Nanosensoren 3.

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

Die Wurzel fungiert als physischer Anker der Pflanze und ist das Organ, das für die Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen wie Stickstoff verantwortlich ist, ...

Um maximale Erträge zu erzielen, müssen Pflanzen mit einer Reihe von Nährstoffen versorgt werden; Nährstoffmangelerscheinungen sowie Stressfaktoren wie Kälte oder extremer Hitze, Trockenheit oder Krankheitserreger verursachen jedes Jahr massive Ernteverluste. Der Ursprung vieler dieser Probleme liegt häufig unter der Erde. Die Wurzel ist der physikalische Anker der Pflanze, aber auch das Organ, das für die Wasseraufnahme sowie die Aufnahme mineralischer Nährstoffe wie Stickstoff, Phosphat, Sulfat und zahlreicher Spurenelemente verantwortlich ist.Wenn wir nachhaltige Ansätze zur Erzeugung hoher Erträge entwickeln möchten, müssen wir besser verstehen, wie sich die Wurzel entwickelt, wie sie dieses breite Spektrum an Nährstoffen aufnimmt und wie sie mit symbiotischen und pathogenen Organismen interagiert. Um dies zu erreichen, müssen wir in der Lage sein, Wurzeln aus mikroskopischer Sicht zu untersuchen. Aus offensichtlichen Gründen war die Erforschung der Wurzelbiologie stets schwieriger als die Untersuchung der oberirdischen Pflanzenteile.Da Wurzeln gewöhnlich unterirdisch verborgen sind, sind sie für mikroskopische Untersuchungen nur schwer zugänglich. Die Entnahme aus dem Boden verursacht schwere Schäden am Wurzelsystem und eignet sich daher nicht gut zur Untersuchung ihres Verhaltens. Eine Lösung, um Wurzeln besser zugänglich zu machen, besteht darin, sie auf Agar oder, wie in diesem Beispiel gezeigt, in hydroponischen Medien zu kultivieren.Das Kultivieren von Pflanzen in Gele oder hydroponischen Medien wurde bereits sehr erfolgreich in zahlreichen Wurzelstudien eingesetzt, doch bei diesen Methoden ist es nach wie vor äußerst schwierig, Wurzeln im mikroskopischen Detail und über längere Zeiträume hinweg zu untersuchen. Um möglichst nahe an die wachsende Wurzel heranzukommen und jegliche mechanische Belastung durch die Probenvorbereitung für die Bildgebung zu vermeiden, haben wir eine Plattform entwickelt, die es uns ermöglicht, Wurzeln zu kultivieren und abzubilden, und gleichzeitig die mikrobielle Umgebung der Wurzeln mit sehr hoher Präzision und Geschwindigkeit zu steuern und zu verändern. Diese Plattform bezeichnen wir als Root-Chip. Der Root-Chip ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus PDMS, einem silikonbasierten organischen Polymer, hergestellt ist.Der Chip verfügt über Beobachtungskammern für das Wachstum und die Abbildung von Wurzeln aus Kaninchen-Opsis-Keimlingen. Die Samen keimen zunächst in aus Plastikpipettenspitzen hergestellten Kunststoffkegeln, die wir mit festem Medium füllen. Die Wurzelspitze wächst dann durch das Medium hindurch und erreicht die Kammer, in der sie einem kontinuierlichen Fluss von flüssigem Medium ausgesetzt ist, wodurch die Bedingungen in der Kammer aufrechterhalten werden.Konstante mikromechanische Ventile, die im Labor von Steve Quake an der Stanford University entwickelt wurden, werden hier in roter Steuerung gezeigt. Da der Chip auf einer transparenten Deckglasplatte montiert ist, wie sie typischerweise für die Mikroskopie verwendet wird, können alle Vorgänge in der Beobachtungskammer mit einem umgekehrten Mikroskop überwacht werden. Die verzweigte Kanalstruktur, die die Flüssigkeitsströmung leitet, ist unter dem Mikroskop sichtbar.Der Wurzel-Chip besteht aus zwei Schichten, einer Steuerschicht mit Ventilen und einer Flussschicht mit Kanälen, durch die das Wachstumsmedium und Testlösungen zu den Beobachtungskammern fließen. Das Volumen dieser Kammern beträgt etwa 400 Nanoliter. Dies bedeutet, dass nur sehr geringe Mengen an Lösung benötigt werden und die Bedingungen sehr schnell geändert werden können.Dieses Protokoll beschreibt, wie lebende Wurzeln von acht oder mehr Arabidopsis-Keimlingen für die parallele mikroskopische Bildgebung auf einem Wurzelchip vorbereitet und bis zu drei Tage lang beobachtet werden. Beginnen Sie damit, eine 10-mm-Petrischale mit Wachstumsmedium, das 1 % Agar enthält, zu füllen, während das Medium noch flüssig ist. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10-μl-Pipettenspitzen mit jeweils fünf Mikrolitern Medium aus der Petrischale. Die gefüllten Spitzen werden im Pipettenspitzenbehälter aufbewahrt, bis das Medium erstarrt ist.Danach in vier Millimeter lange Kunststoffkegel schneiden und aufrecht in eine Petrischale mit festem Nährmedium stellen. Nach der Oberflächensterilisation werden einzelne Samen auf die mit Medium gefüllten Kegel gelegt. Die Schale wird anschließend mit Micropore-Band verschlossen und die Platte zur Synchronisierung der Keimung bei vier Grad gelagert.Nach drei Tagen werden die Platten in einen Wachstumsschrank überführt, um die Keimung zu beginnen. Unsere Wachstumsbedingungen in diesem Experiment betragen 23 Grad bei einem Licht-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit. Zwischen fünf und sieben Tage nach der Keimung sollten die Sämlinge bereit sein für die Übertragung auf den Wurzelchip; die Wurzellänge und gegebenenfalls die Expression eines fluoreszierenden Markers sollten unter einem Stereomikroskop überprüft werden.Sobald die Wurzelspitzen der Sämlinge die untere Öffnung des Kunststoffkegels erreichen, werden einzelne Sämlinge zur Übertragung auf den Chip markiert. Es sollten etwa 10 Pflanzensämlinge ausgewählt werden, um den Fall abzudecken, dass einer während der Übertragung beschädigt wird, um den Wurzelchip zu sterilisieren. Für Langzeitexperimente wird die Vorrichtung in Gewebe eingewickelt, in eine Glas-Petri-Schale gelegt und autoklaviert.Dieser Chip wurde gerade vor Kurzem autoklaviert. Nach dem Abkühlen des Chips wird das Experiment mit flüssigem Nährmedium überlagert. Der Chip sollte vollständig bedeckt sein, jedoch sollte der Flüssigkeitsstand nicht höher als drei Millimeter über der Chip-Oberfläche liegen.Mit einer 20-Mikroliter-Pipette wird Medium durch den Wurzelzulauf und den Kammereinlass gezogen. Dadurch wird die Beobachtungskammer gefüllt. Nachdem das Medium ausgewählt wurde, werden nun Plastikkegel in den Wurzelchip eingesteckt.Der Kegel sollte fest in den Einlässen sitzen. Da der Wurzelchip auf einer dünnen Schicht aus optischem Glas montiert ist, muss darauf geachtet werden, den Chip nicht mit zu viel Druck zu belasten. In diesem Schritt wird der Chip nun für eine Übernachtsinkubation in flüssigem Medium vorbereitet, um ein Aufschwimmen des Chips zu verhindern.Zwei Glasscheiben, wobei eine in zwei Hälften geschnitten ist, werden auf den Chip platziert. Ein magnetischer Rührstab wird hinzugefügt und die Schale geschlossen. Die gesamte Apparatur wird nun auf einen magnetischen Rührer übertragen, der das Medium sanft bewegt, um das Wachstum der Wurzeln in Richtung der Auslässe zu fördern.Die Einlässe des Wurzelchips sind in einem Winkel angebracht, um das Wachstum in die gewünschte Richtung weiter zu unterstützen. Kippen Sie die Apparatur leicht, indem Sie die Seite des Chips anheben, die gegenüber den Auslässen liegt.Der Chip wird mit einer Ringlampe beleuchtet, die an einen Zeitschalter angeschlossen ist, um den Hell-Dunkel-Rhythmus aufrechtzuerhalten. Nach der Übernacht-Inkubation wird flüssiges Wachstumsmedium in einem dicht verschließbaren, druckbeständigen Gefäß vorbereitet. Die folgenden Schritte sollten schnell und ohne Unterbrechung durchgeführt werden, um das Austrocknen der Keimlinge zu verhindern.Der Chip wird nun aus dem flüssigen Medium entnommen und umgedreht in die untere Öffnung des umgekehrten Chipträgers eingesetzt. Der Chip muss so ausgerichtet sein, dass die Seite mit den Zuführungen der Steuerschicht zur Seite der Druckleitung zeigt. Zwei große Anschlüsse in der Seitenwand des Trägers.Das Deckglas auf der Unterseite des Chips wird vorsichtig durch Abtupfen mit Papiertuch getrocknet und am Träger befestigt. Mithilfe von Klebeband wird die gesamte Montage anschließend umgedreht. Die Schlauchanschlüsse werden mit Wasser mittels einer Spritze gefüllt, und jeder Schlauchanschluss wird in den entsprechenden Zulauf gesteckt.Auf dem Chip. Schläuche werden an das Medium und die Lösung angeschlossen. Fläschchen und Luft werden anschließend durch Anlegen von Druck auf die Lösung mit einer Luftspritze aus den Leitungen entfernt, der Träger wird mit transparentem Kunststoff abgedeckt.Um eine hohe Luftfeuchtigkeit in der Apparatur aufrechtzuerhalten, wird der Träger auf den Mikroskopständer platziert. Er sollte exakt in die Aussparungen des Ständers passen. Die Chip-Ventile sowie der Mediumfluss durch den Chip werden über Luftdruck gesteuert.Zwei Leitungen mit Reglern zweigen von einer Hauptdruckleitung ab. Eine wird zur Steuerung des Fluidstroms verwendet, die andere ist mit magnetbetätigten Luftventilen verbunden. Diese Ventile werden über den USB-Ventilcontroller vom Computer aus gesteuert und sind für die Betätigung der Ventile auf dem Chip verantwortlich.Beide Druckregler sollten geschlossen sein, bevor der Chip angeschlossen wird. Schläuche, Verbinder und Lösungsfläschchen werden nun den entsprechenden Druckleitungen zugeordnet. Einige Milliliter Wasser werden den Reservoiren des Trägers hinzugefügt.Dieser Schritt muss möglicherweise im Verlauf längerer Experimente wiederholt werden. Um die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, sollte die Flüssigkeitsmenge begrenzt werden, um die potenzielle Menge an Flüssigkeit, die auf das Mikroskop verschüttet werden könnte, zu minimieren. Die Ringleuchte wird über dem Chip in Position gebracht, um den Hell-Dunkel-Wechsel bis zum Beginn des Experiments aufrechtzuerhalten.Die Ventile auf dem Chip werden durch Anlegen von Druck geschlossen, in diesem Fall durch Öffnen der magnetgesteuerten Luftventile. Über die LabVIEW-Oberfläche lässt sich die Steuerung der Ventile durch Klicken auf die Schaltfläche unterhalb der Ventilnummer vornehmen. Ein leuchtendes Grün zeigt die Anwendung von Druck und das Schließen eines Chipventils an.Dieses Schema veranschaulicht die Anordnung des Ventilsystems, wobei die Ventile vier bis acht als Einzelventile fungieren, während die Ventile null bis drei in Gruppen arbeiten. Bei diesem System kann eine einzelne Kammer angesteuert werden, indem eine Kombination von Ventilen aktiviert wird. Um beispielsweise den Flüssigkeitsfluss ausschließlich zur dritten Kammer von oben zu lenken, müssen die Ventile null, drei und vier geschlossen werden. Zusätzlich steuern die Ventile sechs, sieben und acht, welche Lösung zum Spülen der Einlässe A, B und C verwendet wird. Aktivieren Sie nun alle drei Lösungszulaufventile, um sie zu schließen.Die Steuerungsschnittstelle verfügt über eine Rückkopplungsschleife, die die Überwachung des Systemzustands ermöglicht. Diese Funktion kann aktiviert werden, indem auf die Schaltfläche „Rücklesefunktion“ geklickt wird. Der Druckregler für die Steuerungsschicht wird zuerst geöffnet und auf 15 PSI eingestellt.Dann wird der Regler für die Flussschicht geöffnet und auf fünf PSI eingestellt. Das Einlassventil für das gewählte Wachstumsmedium wird geöffnet, und die Kammern werden mit Medium gespült; die Flusspfade sollten unter dem Mikroskop überprüft werden. In den meisten Fällen bleibt Luft in den Kanälen eingeschlossen und muss entfernt werden.Zusätzlich enthalten die Kanäle der Steuerungsluft noch Luft, die herausgedrückt und durch das Wasser aus den Schlauchverbindern ersetzt werden muss. Dieser Vorgang wird als Dead-End-Füllung bezeichnet. Beide Aufgaben werden erreicht, indem jede der acht Kammern mehrmals gespült wird, bis die gesamte Luft aus den Kanälen in das PDMS gedrückt ist.Das System kann zur Automatisierung von Experimenten programmiert werden. Solche Abläufe können auch verwendet werden, um den Chip zu entgasen. Der eigentliche Zweck des Wurzelchips besteht darin, eine Bildgebungsplattform und ein Perfusionssystem in einem einzigen Gerät zu kombinieren.Um die Manipulation des Wurzel-Mikroumfelds zu demonstrieren, spülten wir die Kammern mit Farbstoff und maßen den Flüssigkeitsaustausch innerhalb der Kammern. Bei dem empfohlenen Druck von fünf PSI konnten wir einen vollständigen Austausch innerhalb von 10 Sekunden bei einer berechneten Flussrate von etwa 1,5 Mikrolitern pro Minute messen. Außerdem beobachteten wir das Wurzelwachstum von Keimlingen, die in diesem Fall im Dunkeln kultiviert und mit 10 Millimolar Glukose als externer Energiequelle versorgt wurden.Abhängig von den Wachstumsbedingungen wie Licht und Zusammensetzung des Mediums können die Pflanzen im Wurzel-Chip bis zu drei Tage lang beobachtet werden. Mit diesem System wurde die intrazelluläre Glukose- und Galaktosespiegel in Wurzeln überwacht, die genetisch kodierte Nanosensoren exprimieren. Diese auf Förster-Resonanzenergietransfer oder FRET basierenden Sensoren wurden im Fromer-Labor entwickelt.Für dieses Experiment wurden die Wurzeln im Chip mit quadratischen Pulsen einer Glukose- oder Galaktoselösung perfundiert. Die intrazellulären Zuckerspiegel wurden überwacht und hier dargestellt, ausgedrückt als Verhältnis der Intensität des Akzeptorfluorophors Citrin zur Intensität des Donors ECFP auf der linken Seite. Wir beobachten die Menge der Sensoren Citrin in der Mitte bzw. das verhältnisbasierte Bild der Wurzelspitze, und rechts tragen wir die Zuckermenge als Antwort auf drei wiederholte quadratische Pulse von Glukose in Grün und Galaktose in Rot auf.Der Anstieg des Verhältnisses weist auf eine Anreicherung von Zucker hin. Die Hauptvorteile des Wurzel-Chips gegenüber herkömmlichen Wachstumsmethoden sind die minimal invasive Vorbereitung für die Mikroskopie, die Möglichkeit, das Wurzelumfeld reversibel und wiederholt zu verändern, sowie die Fähigkeit, entwicklungs- und physiologisch gesundes Gewebe über einen Zeitraum von mehreren Tagen kontinuierlich zu beobachten. Ein weiterer sehr wichtiger Vorteil ist, dass nur minimale Flüssigkeitsmengen benötigt werden, um die Wurzeln über die Zeit mit allen notwendigen Nährstoffen zu versorgen.Dies macht die Wurzelchipp sehr kosteneffektiv, insbesondere wenn teure Reagenzien verwendet werden. Wir arbeiten weiter an der Optimierung der Wurzelchipp und der Erweiterung ihrer Anwendbarkeit, da wir der Überzeugung sind, dass mikrofluidische Werkzeuge wie der Wurzelchip neue Dimensionen der Pflanzenforschung erschließen können, indem sie dieses wichtige Organ für Behandlungen und Beobachtungen besser zugänglich machen. Weitere Informationen zum Aufbau eines Wurzelchipsystems finden Sie auf unserer Website.Chips können über die Stanford Foundry bestellt werden.

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