Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für In vivo Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

Dieses Verfahren zielt auf die iontophoretische Applikation pharmakologischer Substanzen auf mikroskopische Schaltkreise im Gehirn ab, während gleichzeitig die neuronale Aktivität aufgezeichnet wird. Ziehen Sie zunächst eine einlumige Glaselektrode für die Einzelzellableitung und biegen Sie die Spitze. Ziehen Sie außerdem eine mehrkanalige Glaselektrode und brechen Sie deren Spitze auf den gewünschten Durchmesser.

Fahren Sie mit dem Zusammenbau der beiden Elektroden fort. Die hergestellte Elektrode wird letztendlich für extrazelluläre in-vivo-Ableitungen verwendet, bei denen pharmakologische Substanzen nach Bedarf ontisch appliziert werden können, um neuronale Mikroschaltkreise zu manipulieren. Hallo, mein Name ist Dr. Achim Klu, und unser Labor wird Ihnen heute zeigen, wie man Piggyback-Mehrfachkanalelektroden herstellt.

Mit diesen Elektroden können Ionenophore neuronale Agonisten und Antagonisten in die Mikroumgebung eines Neurons eingebracht werden, um so neuronale Schaltkreise in vivo zu manipulieren. Hallo, ich bin Dr. An Zillow. Ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. Ah him Crow und werde heute die Methode vorführen. Verwenden Sie für eine einrohrige Elektrode eine einrohrige Glas-Kapillare mit Filament und ziehen Sie die Spitze auf einen Durchmesser von etwa ein bis zwei Mikrometern bei einer Schaftlänge von 10 bis 12 Millimetern.

Überprüfen Sie die Widerstandswerte der gezogenen Elektrode gelegentlich, indem Sie diese mit dreimolarem Natriumchlorid füllen und mit einem standardmäßigen O-Messgerät in 0,9 %iger Kochsalzlösung testen. Sobald die Elektrode mit Salzlösung gefüllt ist, trocknet die Lösung schnell aus, wodurch die Elektrode unbrauchbar wird. Führen Sie diesen Test daher nur dann durch.

Treten Sie auf einige Elektroden, die nicht für die Piggyback-Produktion verwendet werden. Um eine vollständige Multibarrel-Elektrode herzustellen, ziehen Sie das Glas zu einer Pipettenspitze mit einem Gesamtdurchmesser von etwa 10 Mikrometern oder weniger. Eine Elektrode mit korrekt gezogener Spitze ist entscheidend für den Erfolg.

Neben der Länge und Dicke muss die Spitze fest sein und sich leicht auf den gewünschten Durchmesser abbrechen lassen. Der Durchmesser der Spitze wird im nächsten Schritt korrekt eingestellt. Daher ist die genaue Größe der Spitze während des Pooling-Prozesses weniger kritisch als die Gesamtform der Elektrodenspitze, die lang und relativ dünn sein sollte.

Halten Sie nun die Einzelkanüle in einem Winkel von etwa 45 Grad, wobei die Spitze nach unten zeigt, und führen Sie sie relativ schnell durch die Flamme. Ziel ist es, dass die Flamme das Glas im Übergangsbereich etwa 10 Millimeter von der Elektrodenspitze entfernt schmelzen lässt, um sie um etwa 20 Grad zu biegen. Stellen Sie die Mehrkanüle in ein Bett aus Modellierlehm auf einem Objektträger und setzen Sie sie anschließend in die Mikroskopstagen ein.

Objektträgerhalter Mit Hilfe der XY-Manipulatoren des Mikroskoptisches bewegen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig gegen das Plexiglasstück. Beobachten Sie das Abbrechen der Spitze durch die Okulare des Mikroskops. Die Montageanordnung der Elektrode ist hier dargestellt.

Die Multikanal-Elektrode wird auf einer Glasplatte auf dem Mikroskoptisch gehalten. Während die Einzelkanal-Elektrode von einem manuellen Multiaxis-Manipulator gehalten wird, der es einem Benutzer ermöglicht, die Einzelkanal-Pipette mit großer Präzision auf die Multikanal-Pipette abzusenken. Senken Sie die Einzelkanal-Elektrode direkt in die Nut der Multikanal-Elektrode ab, die durch die Anordnung der fünf Kanäle gebildet wird, wobei ihre Spitze etwa fünf bis zehn Mikrometer über die Spitze der Multikanal-Elektrode hinausragt.

Verkleben Sie die Schaftteile der beiden Elektroden mit Cyanoacrylat. Beginnen Sie an der am weitesten distal gelegenen Position der Spitzen und bewegen Sie langsam einen Zahnstocher mit einem Tropfen Klebstoff entlang der Elektrodenschaufte in Richtung der Elektrospitzen. Wenn der Klebstoff zu nahe an den Elektrospitzen aufgetragen wird, verstopfen sich die Spitzen und die Elektrode wird zumindest teilweise funktionsunfähig.

Mischen Sie eine kleine Menge Zahnzement. Lassen Sie ihn etwa 15 Minuten trocknen. Entfernen Sie dann die fertige Piggyback-Elektrode vorsichtig.

Zuerst vom Mikromanipulatorhalter lösen und anschließend von der Objektträgerplatte abnehmen. Unmittelbar vor der Verwendung der Elektrode, jedes Barrel mit dem jeweiligen Wirkstoff rückseitig befüllen. Die vier äußeren Barrels der Fünf-Barrel-Anordnung mit vier gewählten Wirkstoffen füllen und das mittlere Barrel mit dreimolarer Natriumchloridlösung als Ausgleichsbarrel verwenden.

Füllen Sie dann die Einzelkanal-Aufnahmeelektrode mit dreimolarem Natriumchlorid. Schalten Sie nun die Ionenphorese-Pumpenmodule ein und testen Sie alle Kanäle. Die Elektroden-Testfunktion jedes Pumpenmoduls hilft dabei festzustellen, ob der Elektrodenkanal für Tiefenhirnaufnahmen funktionsfähig ist.

Eine fertige Fünf-Loch-Elektrode, zusammen mit einer Einzel-Loch-Ableitelektrode montiert, weist einen langen Schaft von etwa sieben Millimetern auf. Verschiedene synaptische Agonisten und Antagonisten werden üblicherweise bei der Iontophorese eingesetzt, wobei beispielsweise Glycin-hemmende Substanzen mit Glycinrezeptorantagonisten blockiert werden. Tryptophan-9-Hydrochlorid erhöht typischerweise die Feuerrate von Neuronen.

Diese Beispieldaten messen die Entladungsrate eines auditorischen Neurons in Abhängigkeit von der Intensität und zeigen die Antworten auf sinusförmige Schallreize steigender Intensität, die an die Ohren des Tieres übertragen wurden. Lautere Töne führten zu höheren Spikerraten vor der Anwendung von Strict Nine. Die Intensitätsfunktion der Neuronenrate weist niedrige Spikerraten auf.

Die Anwendung eines initialen Iontophoresestroms von 15 Nanoampere führt zu einer leichten Erhöhung des Ausstoßstroms. Progressiv höhere Ausstoßströme blockieren zunehmend mehr Glycinrezeptoren am Neuron, was zu progressiv höheren Feuerraten führt. Bei einem Strom von 45 Nanoampere scheinen alle Glycinrezeptoren dieses Neurons durch Strichninehydrochlorid blockiert zu sein.

Jede weitere Erhöhung des Ausstoßstroms und die Freisetzung noch strengerer Neun führte nicht zu einer weiteren Veränderung. Die Funktionskurve der Entladungsrate der Neuronen nach Beendigung der Iontophorese zeigt eine vollständige Wiederherstellung der neuronalen Antworten auf den Ausgangswert nach etwa 25 Minuten. Dieser Erholungsprozess hängt von der Art und Menge des ausgestoßenen Wirkstoffs ab.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Ferre-Medikament in die Umgebung der Ableitstelle diffundieren und auch Rezeptoren an benachbarten Neuronen blockieren kann. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Ableitelektrode mit einer mehrfachlumigen Arzneimitttelelektrode kombiniert, um geräuscharme Tiefenhirn-Ableitungen zusammen mit einer zeitlich kontrollierten Applikation von bis zu vier pharmakologischen Substanzen zu erhalten.