Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für In vivo Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

Dieses Verfahren zielt auf die iontophoretische Applikation pharmakologischer Substanzen auf mikroskopische Schaltkreise im Gehirn ab, während gleichzeitig die neuronale Aktivität aufgezeichnet wird. Ziehen Sie zunächst eine einlumige Glaselektrode für die Einzelzellableitung und biegen Sie die Spitze. Ziehen Sie außerdem eine mehrkanalige Glaselektrode und brechen Sie deren Spitze auf den gewünschten Durchmesser.

Fahren Sie mit dem Zusammenbau der beiden Elektroden fort. Die hergestellte Elektrode wird letztendlich für extrazelluläre in-vivo-Ableitungen verwendet, bei denen pharmakologische Substanzen nach Bedarf ontisch appliziert werden können, um neuronale Mikroschaltkreise zu manipulieren. Hallo, mein Name ist Dr. Achim Klu, und unser Labor wird Ihnen heute zeigen, wie man Piggyback-Mehrfachkanalelektroden herstellt.

Mit diesen Elektroden kann man Ionenophore neuraler Agonisten und Antagonisten in die Mikroumgebung eines Neurons einführen und somit neuronale Schaltkreise eines Neurons in vivo manipulieren. Hallo, ich bin Dr. An Zillow. Ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. Ah him Crow, und ich werde heute das Verfahren demonstrieren. Für eine einrohrige Elektrode verwenden Sie eine einrohrige Glas-Kapillare mit Filament und ziehen die Spitze auf einen Durchmesser von etwa ein bis zwei Mikrometern bei einer Schaftlänge von 10 bis 12 Millimetern.

Überprüfen Sie die Widerstandsfähigkeit der gezogenen Elektrode gelegentlich, indem Sie sie mit dreimolarer Natriumchloridlösung füllen und mit einem Standard-O-Meter in 0,9 %iger Kochsalzlösung testen. Sobald die Elektrode mit Salzlösung gefüllt ist, trocknet die Lösung schnell aus, wodurch die Elektrode unbrauchbar wird. Führen Sie diesen Test daher nur durch.

Treten Sie auf einige Elektroden, die nicht für die Piggyback-Produktion verwendet werden. Um eine vollständige Multibarrel-Elektrode herzustellen, ziehen Sie das Glas zu einer Pipettenspitze mit einem Gesamtdurchmesser von etwa 10 Mikrometern oder weniger. Eine Elektrode mit korrekt gezogener Spitze ist entscheidend für den Erfolg.

Neben der Länge und Dicke muss die Spitze fest sein und sich leicht auf den gewünschten Durchmesser abbrechen lassen. Der Durchmesser der Spitze wird im nächsten Schritt korrekt eingestellt. Daher ist die genaue Größe der Spitze während des Pooling-Prozesses weniger kritisch als die Gesamtform der Elektrodenspitze, die lang und relativ dünn sein sollte.

Halten Sie nun die Einzelkanüle in einem Winkel von etwa 45 Grad mit der Spitze nach unten und führen Sie sie relativ schnell durch die Flamme. Ziel ist es, dass die Flamme das Glas im Übergangsbereich etwa 10 Millimeter von der Elektrodenspitze entfernt schmilzt, um sie um etwa 20 Grad zu verbiegen. Platzieren Sie die Mehrkanüle in einer Mulde aus Modellierknete auf einem Objektträger und schieben Sie sie anschließend in die Mikroskopstages.

Objektträgerhalter: Unter Verwendung der XY-Manipulatoren des Mikroskoptisches bewegen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig gegen das Plexiglasstück. Beobachten Sie das Abbrechen der Spitze durch die Okulare des Mikroskops. Die Montageanordnung der Elektrode ist hier dargestellt.

Die Multilumen-Elektrode wird auf einer Glasplatte auf dem Mikroskoptisch gehalten. Während die Einzellumen-Elektrode von einem manuellen mehrachsigen Manipulator gehalten wird, der es einem Benutzer ermöglicht, die Einzellumen-Pipette mit großer Präzision auf die Multilumen-Pipette abzusenken. Senken Sie die Einzellumen-Elektrode direkt in die Nut der Multilumen-Elektrode ab, die durch die Anordnung der fünf Lumen gebildet wird, wobei die Spitze etwa fünf bis zehn Mikrometer über die Spitze der Multilumen-Elektrode hinausragt.

Verkleben Sie die Schaftteile der beiden Elektroden mit Cyanoacrylat. Beginnen Sie an der am weitesten distal gelegenen Position der Spitzen und bewegen Sie langsam einen Zahnstocher mit einem Tropfen Klebstoff entlang der Elektrodenschäfte in Richtung der Elektrospitzen. Wenn der Klebstoff zu nahe an den Elektrospitzen aufgebracht wird, verstopfen sich die Spitzen und die Elektrode wird zumindest teilweise funktionsunfähig.

Mischen Sie eine kleine Menge Zahnzement. Lassen Sie ihn etwa 15 Minuten trocknen. Entfernen Sie dann vorsichtig die fertige Piggyback-Elektrode.

Zuerst vom Halter des Mikromanipulators lösen und dann von der Objektträgerplatte abnehmen. Unmittelbar vor der Verwendung der Elektrode jede Kammer mit dem jeweiligen Wirkstoff rückseitig befüllen. Die vier äußeren Kammern der Fünf-Kammer-Konfiguration mit vier gewählten Wirkstoffen füllen und die mittlere Kammer mit dreimolarer Natriumchloridlösung als Ausgleichskammer.

Füllen Sie dann die Einzelkanal-Aufnahmeelektrode mit dreimolarer Natriumchloridlösung. Schalten Sie nun die Ionenphorose-Pumpmodule ein und testen Sie alle Kanäle. Die Elektroden-Testfunktion jedes Pumpmoduls hilft dabei festzustellen, ob der Elektrodenkanal für Tiefenhirnaufnahmen funktionsfähig ist.

Eine fertige Fünf-Loch-Elektrode, zusammengebaut mit einer Einzel-Loch-Ableitelektrode, weist einen langen Schaft von etwa sieben Millimetern auf. Verschiedene synaptische Agonisten und Antagonisten werden üblicherweise bei der Iontophorese eingesetzt, um die Glycin-Hemmung mit Wirkstoffen wie Glycinrezeptorantagonisten zu blockieren. Straits Neun-Hydrochlorid erhöht typischerweise die Feuerrate von Neuronen.

Diese Beispieldaten messen die Entladungsrate eines auditorischen Neurons in Abhängigkeit von der Intensität und zeigen die Antworten auf sinusförmige Schallreize steigender Intensität, die an die Ohren des Tieres angelegt wurden. Lautere Töne führten vor der Anwendung von strict nine zu höheren Spikeraten. Die Raten-Intensitäts-Funktion des Neurons zeigt niedrige Spikeraten.

Die Anwendung eines initialen Iontophoresestroms von 15 Nanoampere führt zu einer leichten Erhöhung des Ausstoßstroms. Progressiv höhere Ausstoßströme blockieren zunehmend mehr Glycinrezeptoren am Neuron, was zu progressiv höheren Feuerraten führt. Bei einem Strom von 45 Nanoampere scheinen alle Glycinrezeptoren dieses Neurons durch Strichninehydrochlorid blockiert zu sein.

Jede weitere Erhöhung des Ausstoßstroms und die Freisetzung einer noch größeren Menge an Norepinephrin führte nicht zu einer weiteren Veränderung. Die Aktivitätsrate der Neuronen kehrt nach Beendigung der Iontophorese wieder auf das Ausgangsniveau zurück, wobei die vollständige Wiederherstellung der neuronalen Antworten nach etwa 25 Minuten eintritt. Dieser Erholungsprozess hängt von der Art und Menge des ausgestoßenen Wirkstoffs ab.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Ferre-Medikament in die Umgebung der Ableitstelle diffundieren und auch Rezeptoren an benachbarten Neuronen blockieren kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Ableitelektrode mit einer mehrkanaligen Arzneimitttelelektrode kombiniert, um geräuscharme Tiefenhirn-Ableitungen zusammen mit einer zeitlich kontrollierten Applikation von bis zu vier pharmakologischen Substanzen zu erhalten.