Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte C. elegans

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die das Wachstum und die Körpergröße von Elganen regulieren. Unter Verwendung von RNA-Interferenz oder RNA-Auge zur Inaktivierung von Kandidatengenen werden erste Platten mit Bakterien, die doppelsträngige RNA exprimieren, hergestellt, die auf die interessierenden Gene abzielen. Hermaphroditen des vierten Larvenstadiums werden auf die RNAi-Platten übertragen.

Sobald sie das Stadium des jungen Erwachsenen erreicht haben, werden sie auf neue RNAI-Platten übertragen, um Eier zu legen. Nach einigen Stunden werden sie entfernt und hinterlassen synchronisierte Populationen von Embryonen. Im gewünschten Entwicklungsstadium wurden die Nachkommen gesammelt und auf Objektträger montiert.

Abschließend werden mikroskopische Bilder der Würmer aufgenommen. Die Analyse des Bildes zeigt Veränderungen in der Körpergröße, die durch die Inaktivierung von Genen verursacht werden. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Regulatoren des TGF-beta-Signalwegs zu identifizieren, kann sie auch auf andere Signalwege angewendet werden, die die postembryonale Entwicklung in Sea Elegance regulieren, wie z. B. den Insulin-Signalweg.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Zielgensequenzen in den Vektor L 4 4 4 0 Ein häufig verwendetes Wurm-RNAi-Plasmid transformiert das rekombinante Plasmid in den Bakterienstamm. HT one 15 DE drei Kulturen. Die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Kohlensäure und 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin wählen dann einen einzelnen Klon für die zukünftige Verwendung aus.

Wandeln Sie in der Zwischenzeit den leeren Vektor L 4 4 4 0 in den Bakterienstamm um. HT one 15. Zur Kontrolle für die Experimente werden die transformierten Bakterien in einem Milliliter LB-Bouillon mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin über Nacht bei 37 Grad Celsius kultiviert.

Tetracyclin wird nicht hinzugefügt, da es die RNAI-Effizienz verringert. Geben Sie weitere fünf Milliliter LB-Bouillon mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in die Nachtkultur und inkubieren Sie weitere vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kultur fertig ist, säen Sie 0,5 Milliliter Versuchs- oder Kontrollbakterien auf die RNAI-Wurmplatten, die mit dem entsprechenden Klonnamen beschriftet sind.

Für jede Bedingung sollten mindestens zwei Platten vorbereitet werden. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag.

Es sollte ein Rasen mit Bakterien vorhanden sein, die RNAi mit oder ohne die Zielgensequenz exprimieren. Die Tiere werden die Bakterien als Nahrungsquelle nutzen. Sobald die RNAI-Fütterungsplatten fertig sind, sterilisieren Flammen die Spitze eines Platindrahtes.

Dann überträgt man mit dem Platindraht sechs bis zehn Hermaphroditen im vierten Larvenstadium oder L vier Celgan-Hermaphroditen auf jede RNAi-Platte. Lassen Sie die Hermaphroditen über Nacht bei 20 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag werden die Tiere junge Erwachsene sein.

Übertragen Sie sie auf eine neue, entsprechend gekennzeichnete und vorbereitete RNAI-Platte. Inkubieren Sie die Platten vier bis sechs Stunden lang bei 20 Grad Celsius, damit die Erwachsenen Eier legen können. Nach der Inkubation nehmen Sie alle erwachsenen Tiere von der Platte, um die Nachkommen zu synchronisieren.

Sobald die erwachsenen Tiere entfernt sind, beginnen Sie mit dem Zeitzählen. Das ist die Zeit Null. Inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, damit die Tiere bis zum gewünschten Entwicklungsstadium heranwachsen können.

Hier werden junge Erwachsene für die phänotypische Analyse ausgewählt. Für Knockdowns, die sich mit normaler Geschwindigkeit entwickeln, ist eine 72-stündige Inkubation erforderlich. Denken Sie daran, dass verschiedene Gene die Entwicklung von Tieren unterschiedlich beeinflussen, so dass die Inkubationszeiten möglicherweise angepasst werden müssen.

Wenn die RNAi dazu führt, dass die Tiere mit einer anderen Geschwindigkeit wachsen, können junge Erwachsene als diejenigen identifiziert werden, die nicht mehr als 24 Stunden nach L vier mit abgeschlossener VUL-Entwicklung und zwei bis sechs Embryonen in der Gebärmutter sind, wie hier gezeigt. Um andere Entwicklungsstadien zu identifizieren, sollte der Prüfarzt die Gonaden- und VUL-Entwicklung als Leitfaden verwenden. Sobald die Tiere das entsprechende Stadium erreicht haben, bereiten Sie sich darauf vor, die Phänotypen der Körpergrößen-Phänotypen der RNAi-behandelten Würmer zu bewerten.

Legen Sie als Nächstes zwei Schichten farbiges Etikettenband auf ein Glas, einen Millimeter dicken Objektträger, wie hier gezeigt. Machen Sie zwei dieser Glasobjektträger. Platzieren Sie dann mit dem Klebeband einen neuen Objektträger zwischen den beiden Objektträgern und tragen Sie einen Tropfen 2%Agros in Wasser geschmolzen auf.

Drücken Sie in die Mitte des neuen Objektträgers einen zweiten Objektträger darauf, um ein dünnes Agros-Pad zu erhalten. Sobald das Agros fest geworden ist, entfernen Sie das obere Glas. Schieben Sie die Rutsche mit dem Agros-Pad und ist bereit, Würmer zu laden.

Beschriften Sie die Folie mit dem Klonnamen. Geben Sie 10 Mikroliter 25 Millimolar Natriumazid in das Aros-Pad. Dann werden wie zuvor mit einem Platindraht 30 bis 40 Tiere in die Natriumazi-Lösung überführt.

Um sie ruhig zu stellen, legen Sie einen Abdeckzettel auf die Oberseite. Dies ist sowohl bei rekombinanten als auch bei leeren L 4 4 4 0 mit RNAi behandelten Tieren zu tun. Legen Sie anschließend den Mikrometer-Objektträger mit einer 2,5-fach-Objektivlinse unter das Präpariermikroskop

Nehmen Sie mit Q Capture oder einer ähnlichen Software ein Bild des Mikrometer-Lineals auf und speichern Sie es. Platzieren Sie dann die Würmer unter dem Zielfernrohr und nehmen Sie Bilder auf. Um zuerst die Körperlänge zu messen, öffnen Sie das Bild des Mikrometer-Lineals in der Image Pro-Software.

Klicken Sie dann auf Messen und wählen Sie Kalibrierung. Wählen Sie dann den räumlichen Kalibrierungsassistenten aus, wobei Sie das aktive Bild kalibrieren ausgewählt haben. Klicken Sie auf Weiter.

Geben Sie den Namen für die Kalibrierung ein, und stellen Sie sicher, dass die räumlichen Bezugseinheiten auf Mikrometer eingestellt sind. Aktivieren Sie dann die Schaltfläche Referenzkalibrierung erstellen und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf Referenzlinie zeichnen.

Eine Referenzmaßstabsleiste wird angezeigt. Positionieren Sie die Maßstabsleiste so, dass sie den Enden des Mikrometers entspricht. Geben Sie dann an, dass die Referenz 1000 Einheiten angibt.

Klicken Sie auf OK. Weiter und fertig. Sobald die Software kalibriert ist, öffnen Sie ein Wurmimage.

Wählen Sie dann im Menü "Messen" die Option "Kalibrierung" und klicken Sie dann auf "Räumlich auswählen". Wählen Sie im Pulldown-Menü den Dateinamen aus, der für die Mikrometer-Kalibrierung erstellt wurde. Wählen Sie dann im Menü "Messen" im sich öffnenden Fenster "Messungen" aus.

Wählen Sie das freie Zeichenwerkzeug und ziehen Sie mit der Computermaus eine Linie durch die Mitte des Tierkörpers vom Kopf bis zum Schwanz. Die Länge wird im Fenster angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Tiere auf dem Feld.

Exportieren Sie die Längenmessungen in eine Microsoft Excel-Datei oder eine andere geeignete Statistiksoftware. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Stichprobe berechnen. Vergleichen Sie dann die Ergebnisse für jede Gruppe mit dem T-Test eines Schülers.

Für die Aktivierung des TGF-beta-Signalwegs wird der transformierende Wachstumsfaktor beta oder TGF beta SUPERFAMILY Protein DBL one benötigt. Als Reaktion auf die Signalaktivierung translozieren intrazelluläre smad-Signalwandler in den Zellkern und initiieren die Gentranskription. Sehen Sie Eleganz, bei der der TGF-Beta-Signalweg gestört ist, haben eine kleinere Körpergröße, einschließlich einer kürzeren Körperlänge als Wildtyp-Tiere.

So schirmt man die Eleganz des Meeres ab. Mutanten der Körpergröße sind in der Lage, TGF-beta-Signalkomponenten und Modifikatoren zu identifizieren, um die Wirksamkeit von RNAi durch Fütterung zur Identifizierung von Mutanten der Körpergröße zu testen. RNAi wurde verwendet, um die Komponenten SMA drei des DBL-Einwegs bei SMA sechs in vier verschiedenen Stämmen der Meereseleganz zu zerlegen.

Zu den getesteten C-Elegance-Stämmen gehörten zwei RN AI-hypersensitive A eins, Lin 15 B und RF drei sowie der Standard-Wildtyp-Stamm N zwei und der LIN 36-Stamm, dessen RNAi-Empfindlichkeit der von N zwei ähnelt, wie hier gezeigt. Wenn die Expression von SMA drei oder SMA sechs gestört war, zeigten die Tiere eine signifikant geringere Körpergröße als Kontrolltiere, mit Ausnahme von SMA sechs RNAi in Lin 36. Hintergrund in RF drei.

Die Hintergrundkörperlängen junger Erwachsener nach der RNAi-Behandlung betrugen 84 bis 95 % des Vektors allein. In A 1 Lin 15 B Hintergrund betrug die Körperlänge junger Erwachsener nach RNAi 68 bis 86 % der Kontrolltiere. Der Stamm A one lin 15 B produziert jedoch Nachkommen.

Dies macht sie für großflächige Siebungen ungeeignet. Daher wird für diese Techniken die Verwendung des HF-Drei-Stammes empfohlen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Gene identifizieren können, die das Wachstum und die Körpergröße mithilfe der RNI-Interferenztechnik regulieren.