Name: Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie die RNAi-Feeding-Strategie zur Identifizierung von Genen, die das Körperwachstum bei C. elegans regulieren. Diese Methode ermöglicht großangelegte genetische Screens zur Aufklärung von Wachstumsregulationsmechanismen.

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Wir danken James Clark für die Bereitstellung Figuren von Tieren in verschiedenen Entwicklungs-Zeitpunkten. C. elegans-Stämme in dieser Studie wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) getragen wird erhalten. Diese Arbeit wurde von CIRG 1817 vom CUNY JL und CSD unterstützt und durch NIH 1R15GM073678-01 und 1R15GM097692-01 bis CSD Wir danken Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman und Melissa Silvestrini für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde in teilweiser Erfüllung der Anforderungen für eine Promotion an der Graduate Center der City University of New York (S. Xiong) durchgeführt.

Ein. Vorbereiten RNAi Feeding Plates Tragen Zielgensequenz <ol><li> Bei der Verwendung von kommerziell erhältlichen RNAi-Bibliotheken (zB von Quelle BioScience LifeSciences), fahren Sie mit Schritt 1.4. Alternativ klonen Target-Gensequenzen in Vektor L4440, ein häufig verwendetes Wurm RNAi Plasmid 8, Standard-Klonen Protokoll. </li><li> Verwandeln Sie das rekombinante Plasmid in Bakterienstamm HT115 (DE3), Kultur sie auf LB-Agar-Platten mit 25 ug / ml Carbenicillin und 12,5 pg / ml Tetracyclin, und wählen Sie einen einzigen Klon für die zukünftige Verwendung. </li><li> Unterdessen transformieren Leervektor L4440 in Bakterienstamm HT115 als Kontrolle für die Experimente verwendet. </li><li> Kultur sowohl rekombinante und leer L4440-tragenden Bakterien in 1 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht bei 37 ° C. Tetracyclin nicht hinzugefügt wird aufgrund der Tatsache, dass es RNAi Effizienz abnimmt. </li><li> Weitere 5 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin in die Nacht culture, für etwa 4-6 h bei 37 ° C. </li><li> Seed 0,5 ml rekombinanten oder leer L4440 tragenden Bakterienkultur auf die RNAi-Wurm Platten. Beschriften Sie alle Platten mit Klon Namen. </li><li> Markieren Sie die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C bis Bakterienrasen wachsen, das sind die RNAi Platten mit oder ohne Ziel Gensequenz. Mindestens 2 Platten sollten für jede Bedingung vorbereitet werden. </li></ol> 2. Kultur Worms auf den RNAi Feeding Plates <ol><li> Flamme sterilisieren die Spitze eines Platin Drahtwurm Wahl. Verwenden Sie den Wurm holen zu holen 6-10 vierten Larvenstadium (L4) Zwitter jedem RNAi Platte, die entweder rekombinante oder leer L4440 enthält; die Tiere werden die Bakterien als Nahrungsquelle zu nutzen. </li><li> Lassen Hermaphroditen bei 20 ° C (ein Standard-Kulturbedingungen für C. elegans) über Nacht wachsen, werden sie als junge Erwachsene am nächsten Tag. </li><li> Übertragen 6-10 jungen Erwachsenen in einer neuen entsprechend gekennzeichnet und vorbereitet RNAi Platte. </li><li> Lassen Sie dieErwachsene legen Eier für 4-6 Stunden, dann entfernen Sie alle Erwachsenen von der Platte; dieser Schritt ist, um die Nachkommenschaft zu synchronisieren. Sobald die Mütter entfernt werden, beginnen zu zählen. Dies ist zeit Null. </li><li> Die Inkubation bei 20 ° C zu lassen Tieren zu bestimmten Entwicklungsstadium wachsen; in diesem Protokoll, wählen wir junge Erwachsene für phänotypische Analyse. Für Niederschlägen, die in einem normalen Tempo zu entwickeln, ist 72-stündigen Inkubation ausreichend für die Tiere zu jungen Erwachsenen geworden. Allerdings wirken sich verschiedene Gene tierischen Entwicklung anders. Wenn RNAi verursacht Tiere mit einer anderen Rate wachsen, können junge Erwachsene wie die nicht mehr als 24 Stunden letzten L4 werden mit abgeschlossener Vulva Entwicklung und 2-6 Embryonen in die Gebärmutter (wenn fruchtbaren) identifiziert. Um andere Entwicklungsstadien zu erkennen, sollte der Prüfer Gonaden und Vulva Entwicklung als Leitfaden verwenden. </li></ol> 3. Ergebnis Body Size Phänotypen der RNAi behandelt Worms <ol><li> Zeigen zwei Schichten von farbigen Etikettenbänder auf einem Glasträger. Machen Sie zwei derse Glasträger. Dann legen Sie eine neue Glasplatte zwischen den beiden Folien mit Klebeband. Melt 2% Agarose in Wasser; einen Tropfen in die Mitte des neuen Glasträger; drücken Sie dann die zweite Glasplatte auf der Oberseite eine dünne Schicht von 2% Agarose wie zuvor beschrieben 9 machen. </li><li> Sobald Agarose verfestigt wird, entfernen Sie die obere Glasplatte; der Schlitten mit Agarose-Pad ist bereit, Würmer zu laden. Label slide mit Klon Namen. </li><li> Fügen Sie 10 ul 25 mM NaN 3 zu dem Agarose-Pad; holen 30-40 Tiere in die NaN 3-Lösung, um sie zu immobilisieren; dann legte Deckglas auf der Oberseite; wiederholen sowohl für rekombinante und leer L4440 tragenden RNAi-behandelten Tieren. </li><li> Bild die Würmer unter Binokular mit 2.5x Objektiv; hier benutzen wir Leica Digitalkamera mit unterstützender Software Qcapture. </li><li> Zur Kalibrierung ersten Aufnehmen eines Bildes eines Standard-Mikrometer-Herrscher. Dann öffnen Sie das Bild in Image-Pro Software, die auf &quot;Messen&quot; klicken und wählen Sie &quot;Kalibrierung&quot; und wählen Sie dann&quot;Spatial Calibration Wizard&quot;. Mit &quot;kalibrieren das aktive Bild&quot; gewählt haben, auf &quot;weiter&quot; klicken. Geben Sie den Namen für die Kalibrierung und sicherzustellen, dass die Raumbezug Einheiten Mikrometer eingestellt sind. Dann überprüfen Sie die &quot;eine Referenz Kalibrierung&quot; und klicken Sie auf &quot;weiter&quot;. Klicken Sie auf &quot;draw Bezugslinie.&quot; Ein Verweis Maßstab erscheint. Neupositionierung des Maßstabsbalken, um die Enden des Mikrometers übereinstimmen, dann zeigen, dass die Referenz 1.000 Einheiten anzeigt. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, &quot;Weiter&quot; und &quot;Fertigstellen&quot;. </li><li> Sobald die Software kalibriert ist, öffnet sich ein Wurm Bild. Dann, unter dem Menü &quot;Messen&quot;, wählen Sie &quot;Kalibrierung&quot; und klicken Sie auf &quot;select räumliche&quot;. In dem Pull-Down-Menü wählen Sie den Dateinamen für die Mikrometerkalibriervorrichtung erstellt. Dann, unter dem Menü &quot;Messen&quot;, wählen Sie &quot;Messungen.&quot; In dem sich öffnenden Fenster wählen Sie die freie Zeichnen Werkzeug und eine Linie durch die Mitte des tierischen Körpers von Kopf bis Schwanz mit Computer-Maus (Abbildung 1). Die Länge wird im Fenster anzuzeigen. JetztSie haben zwei Gruppen von Daten: Rumpflänge von Tieren mit Zielgen RNAi und Kontrolltieren mit leeren L4440 Vektor behandelt wurden. </li><li> Exportieren Sie die Längenmessung in eine Microsoft Excel-Datei, oder einem anderen geeigneten statistischen Software. Analyse der Daten durch die Berechnung der Mittelwert und die Standardabweichung für jede Probe. Dann vergleichen Sie Proben mittels Student-t-Test. </li></ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll beschreiben wir unsere Methode zur Identifizierung von Körpergröße Defektmutanten von C. elegans durch RNAi Fütterung. Dieses Verfahren ist anwendbar auf die Identifizierung von TGF-β-Signalisierung Komponenten. Da diese Komponenten stark durch Evolution 15 konserviert sind, sind solche Bildschirme relevant zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der TGF-β-Signalisierung in allen Metazoen. Eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines solchen Bildschirms ist der Ausgangssta...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi-Wurm Platten 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren. 3 ml 1M IPTG (steril) und 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (steril), dann gießen Sie in 60 mm Petrischalen. Worm Platten 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g Streptomycinsulfat 60 g Agar Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren. Gießen Sie in 60 mm Petrischalen. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterin 200 g NaCl Gründlich mischen und achten Sie darauf, Stücke zu vermeiden, das pulverisierte Mischung kann für viele Monate vor der Verwendung gelagert werden. 2% Agarose 0,5 g Agarose Anzeiged 25 ml dH 2 O. Hitze in der Mikrowelle bis zur Auflösung. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) 2 g IPTG Lösen in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml Caenorhabditis elegans aus Caenorhabditis Genetics Center L4440 Plasmid (trägt Ampicillinresistenzgen) Bakterien-Stamm HT115 (DE3) (enthält IPTG induzierbaren T7-Polymerase; defizient für RNAse III-Gen (a dsRNAse), das auch für Tetracyclin-Resistenz-Gen) 16 60 mm Petrischalen 100 mm Petrischalen 14 ml Rundkolben Falcon Kulturröhrchen Glasobjektträger Deckgläschen 1-20 ul Pipette 20-200 ul Pipette 200-1000 ulPipette 1-200 ul Pipettenspitzen 200-1000 ul Pipettenspitzen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen Platindraht Wurm Pick </td></tr></tbody></table>

mit rna-interferenz feeding strategy to screen for genes in body größe der rechtsetzung in der nematode beteiligte<em&gt; c. elegans</em

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Doppel-Strang-RNA-Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um knock down Zielgenexpression 1-3. Es wurde in viele Modellsysteme einschließlich Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren angewendet worden. Es gibt verschiedene Methoden, um RNAi in vivo 4,5 zu erreichen. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen kann in einen RNAi Vektor transformiert werden und dann entweder dauerhaft oder transient in Zelllinien oder primäre Zellen nach Gens Knockdown Effekte zu erzielen transformiert, alternativ synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide aus spezifischer Zielgene (RNAi Oligos) kann transient sein transformiert, in Zelllinien oder primäre Zellen nach Zielgene Schweigen; oder synthetisierten Doppelstrang-RNA-Moleküle können in einen Organismus mikroinjiziert werden. Seit dem Fadenwurm C. elegans verwendet Bakterien als Nahrungsquelle, die Fütterung der Tiere mit Bakterien, die doppelsträngige RNA gegen Zielgene bietet eine tragfähige Strategie 6. Hier präsentieren wir eine RNAi FütterungMethode punkten Körpergröße Phänotyp. Körpergröße in C. elegans primär durch die TGF-β reguliert wird - wie Ligand DBL-1, so dass dieser Assay geeignet ist zur Identifizierung von TGF-β Signalkomponenten 7. Wir verwendeten verschiedene Stämme, darunter zwei RNAi überempfindlich Stämme, die RNAi Fütterungsversuche wiederholen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass rrf-3-Stamm gab uns die besten erwarteten RNAi Phänotyp. Die Methode ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und leicht zu quantifizieren. Darüber hinaus minimiert unser Protokoll die Verwendung von Spezialgeräten, so ist es für kleinere Laboratorien oder jenen an überwiegend Bachelor-Institutionen.

In unserer Forschung konzentrieren wir uns auf die Körpergröße der Regulierung durch die DBL-1/TGF-β Weg. Der Verlust der Funktion der DBL-1-Weg führt zu geringe Körpergröße, einschließlich einer kürzeren Körper Länge im Vergleich mit Wildtyp-Tieren 7,10,11. So Bildschirme für C. elegans Körpergröße Mutanten, imstande sind, TGF-β-Signalisierung Komponenten und Modifikatoren. DBL-1-Signalisierung wird durch eine konservierte TGF-β Signalübertragungswegs, die Zelloberflächen-Rezeptoren und intrazellulä...

Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße Phänotyp<em&gt; C. elegans</em&gt;. Dieses Verfahren könnte für eine großtechnische Bildschirm verwendet werden, um potenzielle genetische Komponenten von Interesse, wie sie beispielsweise in der Körpergröße Regulierung durch DBL-1/TGF-β Signalgebung beteiligt sind.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Die durch doppelsträngige RNA vermittelte Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um die Expression von Zielgenen zu reduzieren (Knockdown)1-3. Sie wurde in vielen Modellsystemen angewandt ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die das Wachstum von C. elegans und die Körperlänge regulieren. Mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) zur Inaktivierung von Kandidatengenen werden zunächst Platten mit Bakterien vorbereitet, die doppelsträngige RNA exprimieren, die gegen die Gene von Interesse gerichtet ist. Hermaphroditen im vierten Larvenstadium werden auf die RNAi-Platten übertragen.Sobald sie das Stadium des jungen Erwachsenen erreichen, werden sie auf neue RNAi-Platten transferiert, um Eier abzulegen. Nach mehreren Stunden werden sie entfernt, wodurch synchronisierte Populationen von Embryonen entstehen. Im gewünschten Entwicklungsstadium werden die Nachkommen gesammelt und auf Objektträger aufgebracht.Schließlich werden mikroskopische Aufnahmen der Würmer angefertigt. Die Analyse der Bilder zeigt Veränderungen der Körperlänge infolge der Geninaktivierung. Obwohl diese Methode zur Identifizierung von Regulatoren des TGF-beta-Signalwegs verwendet werden kann, ist sie ebenso auf andere Signalwege anwendbar, die die postembryonale Entwicklung bei *C. elegans* steuern, wie beispielsweise den Insulin-Signalweg.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem

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Neurexine und Neuroligine sind Membran-Neuron Haftung Proteine, die wichtige Rollen in synaptic Differenzierung und die Übertragung durchzuführen. Neuroligin defizienten Mutanten...

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNAi ist ein mächtiges genetisches Werkzeug, das C. elegans-Forschern zur Verfügung steht. In diesem Video wird eine Methode vorgestellt, mit der mehr Würmer mit RNAi behandelt werden können als mit der Plattenfütterung unter Verwendung von Flüssigkulturbedingungen.

RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

Während dsRNA Fütterung in C. elegans ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Genfunktionen, aktuellen Protokolle für große Bildschirme Fütterung führen zu variablen Zuschlags Effizienz zu beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Protokoll für die Durchführung groß angelegte RNAi Fütterung Bildschirme, die in hochwirksame und reproduzierbare Zuschlags der Genexpression resultiert.

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

C. elegans hat als neues genetisches Modell zur Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen entstanden. Hier sind wir zu C infizieren beschreiben ein Protokoll elegans mit Salmonella typhimurium in Verbindung mit dem Doppelstrang-RNAi-Interferenz-Technik, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen.

Ein Protokoll zum Infect<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Mit<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie eine Protein nuklearen Translokation unter Hitzestress nachverfolgen mithilfe eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein als Marker und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Das DAPI Färbeprotokoll rückt und bewahrt die GFP und Protein subzelluläre Lokalisation Signale.

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die RNAi-Feeding-Strategie zur Identifizierung von Genen, die das Körperwachstum bei C. elegans regulieren. Diese Methode ermöglicht großangelegte genetische Screens zur Aufklärung von Wachstumsregulationsmechanismen.

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