Name: In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Lernen Sie die in-vitro-Synthese von nativem, fibrösem Long-Spacing- und segmentalem Long-Spacing-Kollagen aus Kollagenmonomeren. Diese reproduzierbaren Methoden ermöglichen die Strukturcharakterisierung mit Rasterkraftmikroskopie.

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Wir möchten uns bei allen die vielen vergangenen Diplomanden, Doktoranden und Post-Doktoranden, die ihre Zeit und Mühe dazu beigetragen haben, die Studie von Kollagen Fibrogenese in unserem Labor danken. The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada hat sich kontinuierlich Finanzierung für unsere Kollagen Studien.

HINWEIS: Das Wasser in all den verwendeten Protokollen einen spezifischen Widerstand&gt; 18 MΩ.cm. Ein. Nativen Kollagenfibrillen <ol><li> Kombinieren 6 l Wasser, 20 ul 200 mM Na 2 HPO 4 auf pH 7 mit HCl und 10 ul 400 mM KCl in einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen. </li><li> Add 4 ul Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Platzieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Reaktionsgemisch in einem Heizblock, die auf 37 vorgewärmt ° C und lassen für 3 bis 4 Stunden. An diesem Punkt sollte die Lösung leicht trüb und enthalten im Wesentlichen nativen Kollagenfibrillen. </li></ol> 2. Faserigen Lange Spacing Collagen <ol><li> Dialysieren 1 ml Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) unter Verwendung von 12 bis 14 kDa MWCO Membran gegen 400 ml Wasser, wobei das Wasser viermal über einen Zeitraum von 24 h bei Raumtemperatur. Die dialysierte collagen Monomer, das nicht verwendet wird sofort bei 4 ° C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. </li><li> Kombinieren Sie 20 ul Wasser, 20 ul von 3 mg / ml α1-saures Glykoprotein in Wasser und 20 ul dialysierten Kollagen Monomer in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Verlassen das Mikrozentrifugenröhrchen enthaltend die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 30 min. An diesem Punkt sollte die Lösung trüb und enthalten überwiegend FLS Kollagenfibrillen. </li></ol> 3. Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen <ol><li> Kombinieren Sie 67 ul Wasser, 60 ul 100 mM Glycin-HCl-Puffer bei pH 3,3 und 40 ul 10 mg / ml ATP in Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen. </li><li> Hinzufügen 33 ul Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Verlassen das Mikrozentrifugenröhrchen enthaltend die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden. An diesem Punkt wird die Lösung noch klar erscheinen, sollte aberenthalten meist SLS Kollagen. </li></ol> 4. AFM Charakterisierung <ol><li> Spaltung der Oberfläche eines Stücks von Glimmer, der an einem Substrat durch AFM Abdecken der Glimmeroberfläche mit einem Stück Klebeband und dann Ablösen es weg. Überprüfen Sie das Band dann zu bestätigen, dass eine ganze Schicht von Glimmer gespalten wurde, um Unregelmäßigkeiten auf der Oberfläche zu reduzieren und sicherzustellen, dass die alte Probe entfernt wird, wenn der Glimmer wiederverwendet wird. </li><li> Übernehmen 20 ul der Kollagenfibrillen Lösung der frisch gespaltenen Glimmer-Substrat. Lassen Sie für 5 min. </li><li> Vorsichtig abwaschen Lösung von Kollagenfibrillen mit Wasser. Es ist ratsam, das Wasser nicht direkt auf das Zentrum des Glimmersubstrat aber am Rand anzuwenden und, damit es über die Probe zu fließen. </li><li> Trocknen Sie die Oberfläche unter einem leichten Stickstoffstrom. Es ist ratsam, den Strom am Rand und nicht in der Mitte des Glimmers Substrat zu richten. </li><li> Unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung,die einheimischen und FLS Kollagen Proben sollten zeigen, Klumpen von Fibrillen. SLS Kollagen wird nicht sichtbar sein. </li><li> Die einzigartigen Eigenschaften der drei verschiedenen Kollagen-Strukturen werden durch AFM beobachtet werden. Generell haben wir Bild nativen Kollagenfibrillen mit einem AFM in Wackelkontakt Modus unter Verwendung von Silizium AFM-Sonden, während FLS und SLS Kollagenfibrillen wir in der Regel Bild mit einem AFM im Kontaktmodus mit Siliziumnitrid AFM-Sonden. Wir machen das wegen der Zeit und Kosten Überlegungen. Silicon AFM-Sonden sind in der Regel schärfer als Siliziumnitrid AFM-Sonden, die sie besonders nützlich für die Abbildung der schmaler Streifen der nativen Kollagenfibrillen zu machen. Jedoch sind Silicium AFM Sonden viel anfälliger gegenüber Verschmutzungen durch Kollagenproben als Siliziumnitrid AFM Sonden und müssen häufig ersetzt. Deshalb behalten wir uns die Verwendung von Silizium AFM-Sonden vor allem für bildgebende nativen Kollagenfibrillen, wo Auflösung eine größere Notwendigkeit und wir arbeiten in Wackelkontakt Modus prolong ihrer Lebenszeit der Nützlichkeit. </li></ol> Wir empfehlen zunächst eine 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan, wenigstens ein paar Collagen Konstrukte zeigen sollte. Von dort weiter vergrößern zu scannen Größen von 10 x 10 um 2 und dann 2 × 2 um 2, um die Streifenbildung Periodizität von nativen und FLS Collagen oder die feineren Merkmale einer SLS Kollagen zu beobachten. Es ist auch eine gute Idee, mindestens zwei weitere Regionen auf der Kollagenprobe überprüfen, um sicherzustellen, dass die anfänglichen Scans repräsentativ sind.

<ol><li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li>
<li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li>
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<li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li>
<li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+segment-long-spacing+crystallites%3A+their+role+in+collagen+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li>
<li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O+prokollagene+kohzi%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li>
<li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Gereinigtes Kollagen Monomer bei niedrigem pH und Temperatur stabil ist und die Bildung von nativen Kollagenfibrillen im Wesentlichen um die Erhöhung des pH und der Temperatur des Kollagen Monomerlösung. Verfahren für die Wiederherstellung der banded Kollagenfibrillen aus Monomeren sind seit mehr als 50 Jahren. Das Verfahren, das unserem Labor in unserem ersten Studien mit Kollagen verwendet 15 Jahren 7 auf Verfahren beruhte zusammengefasst von Chapman und Mitarbeiter in 1986 10. Die Bedingungen für Kollagen Fibrillenbildung in dieser früheren Arbeit waren 0,18 mg / ml Kollagen Monomer in Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4)-Puffer bei 34 ° C. Der Nachteil dieser und anderer Verfahren, die wir versucht haben, ist, dass es immer ungebändert Fibrillen neben den gewünschten banded Fibrillen gebildet. Unsere neuen Bedingungen ~ 0,3 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Phosphat und 100 mM KCl bei pH 7 bei 37 ° C für 3-4 Stunden gelassen. Das VerfahDure hierin beschriebenen unterscheidet sich in jeder Hinsicht aus dem früheren Verfahren zur Herstellung von nativen Kollagenfibrillen. Aber am deutlichsten, haben wir die Ionenstärke durch Anheben der Pufferkonzentration und der Zugabe von 100 mM KCl verdoppelt. Die Erhöhung der Ionenstärke Ergebnisse in konsistenter Bildung ausschließlich banderoliert Kollagenfibrillen. In unserer Erfahrung war das einzige Mal, dass dieses Verfahren nicht systemeigenen Typ Kollagen produziert, wenn das Kollagen Monomerlösung vorbei war der vom Hersteller empfohlenen Zeitpunkt der Verwendung. Wenn dies auftritt, ist das, was im Bereich von weniger Fibrillen, die alle zu vielen Fibrillen noch beobachtet werden aber vorwiegend ungebändert ungebändert beobachtet. Beachten Sie, dass abgelaufene Kollagen Monomer kann oft noch erfolgreich eingesetzt werden, um native Kollagen zu machen, aber wenn es scheitert, neues Kollagen Monomer sollte auf jeden Fall gekauft werden. FLS wurde zuerst von Highberger et al. 17 in Kollagenzubereitungen gutgeschrieben Orekhovich et al. 18. Weitere Studien führten Highberger und Schmitt zu schließen, dass es α1-Säure-Glykoprotein, das die Bildung von FLS 12 fördert war. Wir konnten später das Verfahren für die FLS Kollagen durch die Kombination von kommerziell erhältlichen Kollagen Monomer und α1-saures Glykoprotein bei niedrigem pH und langsam so dass der pH-Wert durch Dialyse der Mischung gegen Wasser für 24 Stunden 11 steigen replizieren. Wir präsentieren nun eine Modifikation dieses Verfahrens durch Dialysieren des Collagens gegen Wasser Monomer ersten und einfach die Kombination mit α1-Säureglycoprotein in Wasser zu FLS Kollagen bilden. Die Bedingungen für FLS Kollagen beschriebenen Anordnung sind hier viel weniger zeitaufwändig. Das Kollagen Monomer muss noch pre-dialysierte gegen Wasser, aber es kann in Substanz durchgeführt werden und dann bei 4 ° C stabil, bis sie verwendet wird. Dieses neue Verfahren liefert überwiegend FLS banded Kollagenfibrillen. Aus unserer Erfahrung, α1-Säure-GlykoproteinProtein mit einem niedrigeren kombinierten Protein-und Wassergehalt und durch Folgerung höheren Zuckergehalt, ist entscheidend für die erfolgreiche Herstellung FLS Fibrillen. Wir in der Regel mit dem Hersteller zu überprüfen, dass die α1-saures Glykoprotein viel nutzen wir ein kombiniertes% Protein und Wasser von 82 oder weniger hat. Und wie bei dem Verfahren für native Kollagen-Synthese, Kollagen Monomer, die zu alt ist, kann auch zum Ausfall an FLS Kollagen produzieren führen. Außerdem ist die Reinheit des Wassers für die Dialyse verwendet kritischen in diesem Verfahren. Beispielsweise Kollagens Dialyse von Monomer selbst gegen ~ 8 MΩ.cm anstatt&gt; 18 MΩ.cm Wasser ergibt eine Kollagenlösung, die nicht bilden wird FLS Kollagen. Von den drei Kollagenfibrille Typen ist die am einfachsten zu machen SLS Kollagen. Die früheste Vorbereitung der SLS wurde von Schmitt und Mitarbeiter 15 beschrieben. Wir veröffentlichten eine Anpassung des Verfahrens vor 12 Jahren für die Herstellung SLS Kollagen mit handelsüblichen collagen 14. Die Prozedur einfach brachte die Kombination von 2 mg / ml ATP und 0,5 mg / ml Kollagen Monomer in 0,05% (v / v) Essigsäure bei pH 3,5, und Verlassen der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht. Nach unserer Erfahrung ist der kritische Aspekt SLS Anordnung, die kontrolliert werden müssen der pH der Reaktionslösung. SLS in mehr basischen Bedingungen (pH ~ 3.6-3.9) Ergebnisse in aggregierter Klumpen von Kristalliten zusammengesetzt. Mehr sauren Bedingungen (pH ~ 2,9-3,2) Ergebnisse in dünner, getrennt Kristallite als diejenigen unter den idealen Bedingungen von pH 3,3-3,5 montiert. Reaction pHs außerhalb dieses Bereichs (&lt;2,8 und&gt; 4) ergeben keine beliebige SLS Kollagen. In der Vergangenheit eingestellt wir den pH der Reaktionsmischung durch Zugabe von Essigsäure. Um das Verfahren noch weiter zu vereinfachen, in diesem Manuskript haben wir eine Glycin-HCl-Puffer, um den pH-Wert zu kontrollieren. Die drei verschiedenen Kollagen-Strukturen aus den Protokollen oben beschrieben gebildet haben Charakteristisch Funktionen, die nur durch Instrumente, die Nanometer-Auflösung erkennen. Native und FLS Kollagen durch Streifenbildung Periodizitäten von ~ 67 nm und ~ 270 nm aus. Die längste Dimension der SLS Kollagen ist nur ~ 360 nm. Wir haben speziell, wie wir eine AFM verwenden, um die drei verschiedenen Kollagen-Strukturen charakterisieren, beschrieben. Allerdings sollte ein AFM Betriebssystem in Kontakt oder Wackelkontakt Modus mit einem AFM-Sonde mit &lt;10 nm Radius auch in der Lage sein Bild diese Kollagen-Strukturen. Zusätzlich kann Elektronenmikroskop und wurde zur Charakterisierung dieser Kollagentypen Strukturen 19. Der große Vorteil dieser Verfahren ist, dass sie überwiegend die gewünschte Kollagen zu bauen. Die einzige andere Form von Kollagen, das in diesen Reaktionen gefunden wird, ist das Ausgangsmonomer, die oft im Hintergrund sichtbar der AFM-Bilder. Im Falle von nativem Kollagen und FLS, können sie leicht vom größten Teil des unrea getrennt werdenCTED Monomer durch wiederholte Zentrifugation und Waschen des entstehenden nativen oder FLS Kollagen Pellet mit Wasser. Wir haben eine einfache und sichere Verfahren für die native, FLS und SLS Kollagen mit Hilfe modernster, kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien vorgestellt. Das Kollagen Monomers in all diesen Verfahren verwendet wird, ist kommerziell in gereinigter Form. α1-saures Glykoprotein und ATP sind auch beide im Handel erhältlich.

Kollagen ist eine Klasse von Proteinen, die eine strukturelle tripelhelicale Struktur aus drei Polypeptidketten gebildet haben. Diese Tripelhelix Monomere weiterhin versammeln sich in einer hierarchischen Weise schrittweise größere Strukturen zu bilden. Es gibt mindestens 28 genetisch verschiedenen Kollagentypen, die 1 identifiziert wurden. Kombiniert sind Kollagene bis 30% des gesamten Proteins bei Tieren gefunden, mit Typ I die vorherrschende Form Bilanzierung von bis zu 90% aller Kollagen-Proteine ​​2. Kollagen Typ I als fibrillous Strukturen in der Haut, Bänder, Sehnen und Knochen gefunden. Rasterkraftmikroskop (AFM) und elektronenmikroskopische (EM)-Bilder des Typs I nativen Kollagenfasern zeigen typischerweise Streifenbildung mit einer charakteristischen Periode von ~ 67 nm 3-5 (oft auch als D-Banding bezeichnet). Typ I Kollagen-Monomer eine Dreifachhelix Heterotrimer, bestehend aus zwei identischen α1 (I)-Ketten und ein α2 (I)-Kette, die jeweils mehr als a isttausend Aminosäuren lang. Es ist lang und dünn mit Abmessungen von 300 nm in der Länge und 1,4 nm im Durchmesser. Typ-I-Kollagen-Monomer kann leicht durch den Abbau natürlich geformten Strukturen höherer Ordnung 6 erhalten werden. Wir 7 und viele andere 8-10 haben gezeigt, dass diese löslichen Monomerbausteine ​​kann dann verwendet werden, um D-banded Fibrillen in vitro (Abb. 1) zu rekonstruieren. Neben nativen Kollagenfibrillen sind zwei andere höherer Ordnung Kollagenstrukturen gefunden, in vitro zu bilden unter Verwendung der gleichen Monomer-Baustein. Die beiden Strukturen sind faserige langen Abstand (FLS) und segmentale langen Abstand (SLS) Kollagen (Abbildung 1). FLS Kollagen ein fibrillous Konstrukt wie native Kollagen, wird aber von einer größeren Periodizität als Streifenbildung native Kollagen 11. In vitro dadurch bildet, wenn der FLS Kollagen Kollagen Monomer mit α1-Säure-Glykoprotein kombiniert wird <sup&gt; 12. FLS Kollagen wurde in vivo als auch beobachtet, wenn auch selten 13. SLS Kollagen als Kristallite bezeichnet, weil die Monomere in Register sind wie in einem Kristallgitter 14 ausgerichtet. SLS Kollagen bildet, wenn das Collagen Monomer mit Adenosintriphosphat (ATP) 15 kombiniert wird. Natürlich vorkommende SLS Kollagen in dem Kulturmedium von Fibroblasten beobachtet, nicht aber in extrahierten Gewebeproben, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Größe und der Mangel von unterscheidbaren topographische Merkmale 16. Das Ziel dieses Manuskriptes ist es, detaillierte Verfahren für die nativen Kollagenfibrillen sowie FLS und SLS Kollagen, dass auch unerfahrene Forscher reproduzieren können präsentieren. Verwendung von kommerziell erhältlichen erweiterten Ausgangsmaterialien, haben wir versucht, die Protokolle so einfach wie möglich zu machen und dennoch haben sie zuverlässig arbeiten. Wir beschreiben, wie eine AFM verwenden, um die verschiedenen Collagen-Struktur zu charakterisierens, die gemacht werden. Diese Arbeit wird sich positiv auf Forscher, die ein oder mehrere dieser höheren Ordnung Kollagen-Strukturen zu untersuchen und / oder nutzen sie als Vorstufen in anderen Anwendungen nutzen möchten, aber derzeit fehlt das Know-how oder einfach nicht wollen mit Gewebeproben zu arbeiten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Typ I Kollagen-Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) </td><td> Inamed Erweiterte Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lot 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lot 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Research Biochemicals International </td><td> A-141 </td><td> Lot FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-saures Glykoprotein aus Rinderplasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lot 051K7440 (89,8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71,2%) Lot 063K7495 (71,9%) Lot 117K7535 (75,9%) (Protein + Wassergehalt) </td></tr><tr><td> a1-Säure glycoprotein aus menschlichem Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lot 128H7606 (70,9%) Lot 049K7565V (68%) (Protein + Wassergehalt) </td></tr><tr><td> Glimmer </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanowelt </td><td> NHC </td><td> Silicon AFM-Sonde, die wir für Wackelkontakt-Modus </td></tr><tr><td> Veeco Nanoprobe Tipps </td><td> Veeco (Jetzt Bruker AFM-Sonden) </td><td> NP-S </td><td> Siliziumnitrid AFM-Sonde, die wir für Kontakt-Modus </td></tr></tbody></table>

in vitro synthese von native, fibröse lange abstände und segmentberichterstattung lange spacing collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Kollagenfibrillen sind in der extrazellulären Matrix von tierischem Gewebe, um strukturelle Gerüst und mechanische Festigkeit zu verleihen. Diese nativen Kollagenfibrillen eine charakteristische Periodizität von Streifenbildung ~ 67 nm und sind in vivo durch die hierarchische Anordnung von Typ I-Kollagen-Monomeren, die 300 nm in der Länge und 1,4 nm im Durchmesser sind, gebildet. In vitro durch Variieren der Bedingungen, denen das Monomer-Bausteine ​​ausgesetzt sind, können einzigartige Strukturen mit einer Länge skaliert auf bis zu 50 Mikrometer gebaut, darunter nicht nur native Fibrillen, sondern auch faserige langen Abstand und segmentale langen Abstand Kollagen. Hier präsentieren wir Verfahren zur Bildung der drei verschiedene Kollagen-Strukturen von einem gemeinsamen Handel erhältlich Kollagen Monomer. Mit den Protokollen, dass wir und andere haben in der Vergangenheit veröffentlichten diese drei Typen machen in der Regel Mischungen von Strukturen führen. Insbesondere waren ungebänderte Fibrillen allgemein found Bei der nativen Kollagens und native Fibrillen waren oft vor, wenn was faserigen langen Abstand Kollagen. Diese neuen Verfahren haben den Vorteil, die gewünschte Kollagenfibrille Aktivität fast ausschließlich. Die Bildung der gewünschten Strukturen durch Abbilden unter Verwendung eines Rasterkraftmikroskops verifiziert.

Nativen Kollagens Die Reaktionsmischung von ~ 0,3 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Phosphat und 100 mM KCl bei pH 7 bei 37 ° C für 3-4 Stunden werden eine Lösung enthaltend natives Typ Kollagenfibrillen mit klaren ~ 67 nm D-Streifenbildung zu ergeben, ohne ungebänderte Fibrillen. Unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung kann Klumpen von mehreren Fibrillen normalerweise auf dem Glimmer-Substrat gesehen werden, vor allem, wenn sie von Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)-Mikroskopie (Abbildung 2) angesehen. In einer typischen Probe, eine zufällige 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan von AFM wird in der Regel zeigen, wenigstens ein paar Fibrillen, 5-50 Mikrometer lang sind (Abb. 3a-c). Individuelle, getrennt Kollagenfibrillen sich zum jetzigen Zeitpunkt identifiziert werden. Mit einem 512 × 512 Pixel 2 image Scan Zoomen in einer 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scangröße zeigt, dass alle Fibrillen beringt werden (Abb. 3d-f </strong&gt;). Um genau zu messen die Streifenbildung Periodizität, ist es am besten in einer 2 × 2 um 2 Scangröße (Abb. 3g-i) zu vergrößern. Banderoliermaschine Periodizität kann einfach durch Messen und Mitteln der Längsabstand zwischen mehreren Gipfeln oder Tälern bestimmt werden. Alternativ, wenn der AFM-Software ermöglicht, eine eindimensionale Fourier entlang einer Längsquerschnitt transformieren können ebenfalls verwendet werden. Abbildung 4 zeigt ein AFM Höhenbilddaten einer Fibrillen und einer entsprechenden Längsschnitt. FLS Kollagen Die Reaktionsmischung von 1 mg / ml μ1-Säure-Glykoprotein und ~ 1 mg / ml Kollagen Monomer in Wasser bei Raumtemperatur 30 min belassen erbringt eine Lösung von FLS Kollagenfibrillen. Klumpen von Fibrillen, ähnlich wie im Falle von nativem Kollagen beobachtet, kann leicht auf dem Glimmer Substrat werden unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher m gesehenagnification. In einer typischen Probe, wird ein zufälliger 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan durch AFM zeigen in der Regel mindestens ein paar Fibrillen. Mit einem 512 × 512 Pixel 2 image Scangröße kann die Streifenbildung Periodizität durch Zoomen in einer 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scan (Abbildung 5a) oder genauer mit einem 2 × 2 um 2 Scan (Abbildung 5b). 5c gemessen werden zeigt einen Längsschnitt eines FLS Fibrillen. SLS Kollagen Das Reaktionsgemisch von 2 mg / ml ATP und ~ 0,5 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Glycin-HCl-Puffer bei pH 3,3 bei Raumtemperatur 2 Stunden gelassen erbringt eine Lösung von SLS Kollagen. Typischerweise wird SLS Kristallite nicht unter einem optischen Mikroskop sichtbar. Ein AFM ist erforderlich, um die Anwesenheit von SLS Kristallite bestätigen. In einer typischen Probe, wird ein zufälliger 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan durch AFM zeigen in der Regel vieleDots. Zoomen in einen 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scan wird in der Regel zeigen mehrere SLS Kristallite (Abb. 6a). Und ein 2 × 2 um 2 Scan (6b) zeigt die feinere Struktur eines SLS Kristallitgröße. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die drei strukturell unterschiedlichen Formen von Kollagenfibrillen, die in vitro aus Kollagen Monomer gebildet werden können. AFM-Bilder darstellen Kollagen Monomer und die drei höherwertigen Kollagenstrukturen alle auf derselben Größenskala (2 × 2 um 2). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Abbildung 2. Digitales Bild bei ~ 200-facher Vergrößerung durch optische Mikroskopie von DIC nativen Kollagenfibrillen auf Glimmer (a) unberührt und (b) Schwellenwertvergleich und t geschärfteo markieren Sie die Fibrillen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Abbildung 3. AFM-Aufnahmen von nativen Kollagenfibrillen auf Glimmer. Wackelkontakt mode AFM Amplituden Bilder angezeigt werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Abbildung 4. (A) 0,5 × 1 um 2 intermittierenden Kontaktmodus AFM Höhenbild (vertikale Skala = 100 nm) und (b) Längsquerschnitt eines nativen Kollagenfibrillen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Abbildung 5. AFM-Aufnahmen von FLS Kollagenfibrillen auf Glimmer. (A) 10 × 10 &amp;mgr; m 2 contact mode AFM Ablenkung Bild, (b) 2 × 2 um 2 contact mode AFM Ablenkung Bild und (c) Längs-Querschnitt eines FLS Kollagenfibrille. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Abbildung 6. AFM-Aufnahmen von SLS Kollagen auf Glimmer. Wackelkontakt mode AFM Amplituden Bilder angezeigt werden.

Einfache und reproduzierbare Verfahren werden für die Herstellung drei strukturell unterschiedliche Kollagen Baugruppen aus einer gemeinsamen kommerziell erhältlichen Typ I-Kollagen-Monomer beschrieben. Systemeigenen Typ, können faserige langen Abstand oder segmentale langen Abstand Kollagen durch Variation der Bedingungen, denen die 300 nm lang und 1,4 nm Durchmesser Monomer-Baustein ausgesetzt gebaut werden.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Kollagenfibrillen sind in der extrazellulären Matrix von tierischem Gewebe vorhanden, um ein strukturelles Gerüst und mechanische Festigkeit zu gewährleisten. Diese nativen ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, zu zeigen, wie Kollagenmonomere reproduzierbar zur Herstellung dreier verschiedener Arten von Kollagenstrukturen höherer Ordnung verwendet werden können. Natürliches Kollagen wird durch Erhöhung des pH-Werts der Kollagenmonomerlösung hergestellt, faseriges Langabstandskollagen wird durch Kombination von Kollagenmonomer mit Alpha-1-Säureglykoprotein und segmentalem Langabstand gebildet.Kollagen wird hergestellt, indem Kollagen-Monomer mit einem TP gemischt wird. Letztendlich kommt die Rasterkraftmikroskopie zum Einsatz, um die drei verschiedenen Arten von gebildeten Kollagenstrukturen zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Protokolle gegenüber früher veröffentlichten Verfahren liegt darin, dass sie einfacher sind und die gewünschten Kollagenstrukturen sehr reproduzierbar bilden. Diese Protokolle wurden in unserem Labor in den letzten 10 Jahren entwickelt und nutzen eine zuverlässige kommerzielle Quelle von Kollagen-Monomer als Ausgangsmaterial. Den Ablauf demonstrieren wird Calvin Chang, ein Doktorand aus meinem Labor, um native Kollagenfasern mit klarer 67 Nanometer DB-Banding zu erzeugen.Beginnen Sie damit, einen Wärmesammler auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen. Bereiten Sie anschließend die Pufferlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit vier Mikrolitern einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Kollagenmonomerlösung vor und mischen Sie sie gut. Die resultierende Lösung sollte klar und farblos sein.Stellen Sie die Mischung drei bis vier Stunden lang auf einen auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Wärmesammler, um native Kollagenfibrillen zu bilden. Die endgültige Lösung sollte leicht trüb sein und hauptsächlich native Kollagenfibrillen enthalten, um faseriges Kollagen mit großer Abstandsstruktur herzustellen. Geben Sie zunächst ein Milliliter einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung aus Kollagenmonomeren in eine Membran mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 12 bis 14 Kilodalton.Als Nächstes gegen 400 Milliliter Wasser dialysieren, wobei das Wasser innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden viermal gewechselt wird. Danach 20 Mikroliter des dialysierten Kollagenmonomers mit 20 Mikrolitern ultrareinem Wasser und 20 Mikrolitern von drei Milligramm pro Milliliter Alpha-1-Säureglykoprotein in Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammengeben und mischen.Lassen Sie das faserige Lungenkollagen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten ausbilden. Während dieser Zeit wechselt die Lösung von klar zu trüb und bildet so genanntes „sick mental long spacing“-Kollagen. Bereiten Sie zunächst den sauren Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor.Fügen Sie 40 µL einer 10 mg/mL TP-Lösung in Wasser zur Pufferlösung hinzu und mischen Sie gut. Geben Sie abschließend 33 µL einer 3 mg/mL Kollagen-Monomer-Lösung in 0,01 normaler Salzsäure hinzu und mischen Sie, um die Lösungen zu vereinigen.Lassen Sie das segmentale langgestreckte Kollagen über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur assemblieren. Die endgültige Lösung wird bei dieser Herstellung klar sein, im Gegensatz zu den beiden anderen beschriebenen Kollagenformen. Um eine saubere, ebene Oberfläche für die Rasterkraftmikroskopie oder eine FM zu erhalten, befestigen Sie ein Stück Klebeband an einem FM-Substrat aus Glimmer und ziehen mindestens eine Schicht ab.Überprüfen Sie das Klebeband, um die vollständige Entfernung einer Schicht zu bestätigen. Sobald eine geeignete Oberfläche vorliegt, geben Sie 20 Mikroliter der Kollagen-FI-Lösung auf das Glimmer-Substrat und lassen Sie diese fünf Minuten lang einwirken. Nach fünf Minuten spülen Sie überschüssige Fibrillen ab, indem Sie Wasser an den Rand des MICA-Substrats geben und es 10 bis 15 Sekunden lang über die Probe fließen lassen.Fügen Sie kein Wasser direkt auf die Probenfläche hinzu. Anschließend trocknen Sie die Oberfläche, indem Sie vorsichtig einen Strom von Stickstoffgas von einer Kante des Substrats aus anlegen, wobei Sie darauf achten, den Gasstrom nicht auf die Mitte der Probe zu richten.Überprüfen Sie die Probe unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergr&ouml;&szlig;erung auf die native und faserige Langabstandstruktur. Kollagenproben zeigen Klumpen von Fibrillen, w&auml;hrend das segmentale Langabstands-Kollagen nicht sichtbar ist. Die einzigartigen Merkmale der verschiedenen Kollagene lassen sich am besten beobachten.Unter Verwendung eines AFM eine anfängliche quadratische Scanfläche von 100 mal 100 Mikrometer durchführen und anschließend auf Scanflächen von 10 mal 10 Mikrometer quadratisch vergrößern und schließlich auf zwei mal zwei Mikrometer quadratisch. Um die Bandperiodizität der nativen und faserigen Lungenabstände zu beobachten. Kollagen waren die feineren Merkmale des segmentalen Kollagenabstands im Lungengewebe.Verwenden Sie für natives Kollagen die Atomkraftmikroskopie im intermittierenden Kontaktmodus mit einer Silizium-a-FM-Sonde zur Analyse der faserigen Langabstände und segmentalen Langabstände. Führen Sie die Atomkraftmikroskopie von Kollagen im Kontaktmodus durch und verwenden Sie zur Erzielung bester Ergebnisse Siliziumnitrit-a-FM-Sonden. Überprüfen Sie mindestens zwei weitere Bereiche der Kollagenprobe, um sicherzustellen, dass die anfänglichen Aufnahmen repräsentativ sind.Die hohe räumliche Auflösung eines KM ist ideal, um die verschiedenen in diesem Video beschriebenen Kollagenpräparationen zu charakterisieren. Es unterscheidet mühelos natives Kollagen, faseriges Kollagen mit großem Abstand und segmentales Kollagen mit großem Abstand. Optische Mikroskopietechniken wie die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie zeigen die Fasern, können jedoch die nanometerskaligen Merkmale nicht darstellen, die die drei in diesen Methoden präparierten Kollagentypen unterscheiden. In einer typischen Probe zeigt ein zufälliger 100 mal 100 Mikrometer großer Scan mittels KM mindestens einige einzelne, getrennte Fibrillen, die fünf bis 50 Mikrometer lang sind.Kollagenfasern können in diesem Stadium leicht identifiziert werden. Bei einer Vergrößerung mit einer Scan-Größe von 10 Mikrometer im Quadrat ist ersichtlich, dass alle Fasern gestreift sind. Um die Periodizität der Streifen genau messen zu können, ist es am besten, auf eine Scan-Größe von zwei mal zwei Mikrometer im Quadrat heranzuzoomen. Bei einer Vergrößerung auf eine Scan-Größe von 10 mal 10 Mikrometer im Quadrat zeigt sich, dass alle Fibrillen gestreift sind.Um die Bandperiodizität genau messen zu können, ist es am besten, auf ein zwei mal zwei Mikrometer großes Scan-Feld zu vergrößern. Die Bandperiodizität nimmt zu, wenn das Kollagen gemäß der Langabstands-Kollagen-Methode präpariert wird, wodurch sich 270 Nanometer lange Wiederholungen entlang der Faserlänge ergeben. In einer typischen Probe zeigt ein 100 mal 100 Mikrometer großes zufällig gewähltes Scan-Feld mittels eines LM mindestens einige Fibrillen.Die Bandabstandsperiodizität ist durch Heranzoomen auf eine 10 mal 10 Mikrometer große quadratische Aufnahme sichtbar und leicht mit einer 2 mal 2 Mikrometer großen quadratischen Aufnahme messbar. Schließlich bildet das segmentale langperiodische Kollagen überhaupt keine Fasern, sondern einzelne Segmente. In einer typischen Probe zeigt eine zufällige 100 mal 100 Mikrometer große quadratische Aufnahme mittels Kraftmikroskopie viele einzelne Punkte.Ein detaillierterer 10 mal 10 Mikrometer großer Quadratscan zeigt mehrere SLS-Kristallite, und ein 2 mal 2 Mikrometer großer Quadratscan zeigt die feinere Struktur eines SLS-Kristalllichts. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einheitliche, ausgereifte native FLS- und SLS-Kollagenkonstrukte aus im Handel erhältlichem Kollagenmonomer herstellt. Kollagen ist ein biokompatibles Material, das als Substrat oder Gerüst zum Kultivieren von Zellen und Geweben nützlich ist.Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, mit geeigneten Kollagenstrukturen für diese und andere Anwendungen zu beginnen.

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