In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, zu zeigen, wie Kollagenmonomer verwendet werden kann, um reproduzierbar drei verschiedene Arten von Kollagenstrukturen höherer Ordnung herzustellen. Natives Kollagen wird hergestellt, indem der pH-Wert der Lösung von Kollagenmonomer, faserigen langen Abständen, erhöht wird. Kollagen wird durch die Kombination von Kollagenmonomer mit Alpha-Ein-Säure-Glykoprotein und segmentalen langen Abständen hergestellt.

Kollagen wird durch Mischen von Kollagenmonomer mit einem TP hergestellt. Letztendlich wird die Rasterkraftmikroskopie verwendet, um die drei verschiedenen Arten von Kollagenstrukturen zu charakterisieren, die gebildet werden. Der Hauptvorteil dieser Protokolle gegenüber zuvor veröffentlichten Verfahren besteht darin, dass sie einfacher und sehr reproduzierbar bei der Bildung der gewünschten Kollagenstrukturen sind. Diese Protokolle wurden in den letzten 10 Jahren in unserem Labor entwickelt, wobei eine zuverlässige kommerzielle Quelle für Kollagenmonomer als Ausgangsmaterial genutzt wurde, das zeigt, dass das Verfahren Calvin Chang, ein Doktorand aus meinem Labor, sein wird, um native Kollagenfasern mit klarer 67-Nanometer-DB-Bandierung herzustellen.

Beginnen Sie damit, einen Heizblock auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen. Bereiten Sie anschließend die Pufferlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Mikrolitern einer Kollagenmonomerlösung von drei Milligramm pro Milliliter vor und mischen Sie sie gut. Die resultierende Lösung sollte klar und farblos sein.

Lege die Mischung für drei bis vier Stunden auf den 37 Grad Celsius warmen Heizblock, um die nativen Kollagenfibrillen zu bilden. Die endgültige Lösung sollte leicht trüb sein und hauptsächlich native Kollagenfibrillen enthalten, um faseriges Kollagen mit langem Abstand herzustellen. Erster Platz, ein Milliliter einer Kollagenmonomerlösung von drei Milligramm pro Milliliter in eine Cutoff-Membran mit einem Molekulargewicht von 12 bis 14 Kilodalton.

Dialysieren Sie anschließend gegen 400 Milliliter Wasser und wechseln Sie das Wasser viermal über einen Zeitraum von 24 Stunden. Kombinieren Sie anschließend 20 Mikroliter des dialysierten Kollagenmonomers mit 20 Mikrolitern ultrareinem Wasser und 20 Mikrolitern von drei Milligramm pro Milliliter. Alpha-Ein-Säure-Glykoprotein in Wasser zusammen in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen.

Lassen Sie das faserige Kollagen mit Lungenabstand über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur zusammenwachsen. Während dieser Zeit wechselt die Lösung von klar zu trüb und bildet kranke psychisch lange Abstände. Kollagen. Bereiten Sie zunächst den sauren Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor.

Geben Sie 40 Mikroliter à 10 Milligramm pro Milliliter, ein TP in Wasser zur Pufferlösung und mischen Sie. Nun, zum Schluss fügen Sie 33 Mikroliter einer drei Milligramm pro Milliliter Kollagenmonomerlösung hinzu, die in 0,01 ist. Normale Salzsäure und mischen, um zu kombinieren.

Lassen Sie das segmentale Kollagen mit langem Abstand über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur zusammenwachsen. Die endgültige Lösung wird in diesem Präparat klar sein, im Gegensatz zu den beiden anderen beschriebenen Formen von Kollagen. Um eine saubere, ebene Oberfläche für die Rasterkraftmikroskopie oder ein FM zu erhalten, kleben Sie ein Stück Klebeband auf ein A FM-Substrat aus MICA und ziehen Sie mindestens eine Schicht ab.

Überprüfen Sie das Klebeband, um zu bestätigen, dass eine gesamte Schicht entfernt wurde. Sobald eine geeignete Oberfläche erhalten ist, tragen Sie 20 Mikroliter der Kollagen-FI-Lösung auf das Glimmersubstrat auf und lassen Sie es fünf Minuten einwirken. Spülen Sie nach fünf Minuten überschüssige Fibrillen weg, indem Sie Wasser an den Rand des MICA-Substrats geben und es 10 bis 15 Sekunden lang über die Probe fließen lassen.

Geben Sie kein Wasser direkt in den Probenbereich. Trocknen Sie dann die Oberfläche mit einem sanften Strom von Stickstoffgas von einer Kante des Substrats. Achten Sie darauf, den Strahl nicht auf die Mitte der Probe zu richten.

Überprüfen Sie die Probe unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung, dem nativen und faserigen langen Abstand. Kollagenproben zeigen Klumpen von Fibro, während das segmentale Kollagen mit langen Abständen nicht sichtbar ist. Die einzigartigen Eigenschaften der verschiedenen Kollagene lassen sich am besten beobachten.

Führen Sie mit einem A FM einen ersten Scan von 100 x 100 Mikrometern im Quadrat durch und zoomen Sie dann auf Scangrößen von 10 x 10 Mikrometern im Quadrat und schließlich auf zwei x zwei Mikrometer im Quadrat. Zur Beobachtung der Periodizität der Streifenbildung von nativen und fibrösen Lungenabständen. Kollagen waren die feineren Merkmale des segmentalen Lungenabstandskollagens.

Für native Kollagenfis führen Sie das Rasterkraftmikroskop im intermittierenden Kontaktmodus mit einer Silikon-A-FM-Sonde für faserige lange Abstände und segmentale lange Abstände. Kollagen fis betreiben das Rasterkraftmikroskop im Kontaktmodus und verwenden Siliziumnitrit- und FM-Sonden für beste Ergebnisse. Überprüfen Sie mindestens zwei weitere Regionen auf der Kollagenprobe, um sicherzustellen, dass die ersten Scans repräsentativ sind.

Die hohe räumliche Auflösung eines FM ist ideal, um die verschiedenen Kollagenpräparate, die in diesem Video beschrieben werden, zu charakterisieren. Es unterscheidet leicht zwischen nativen Kollagenfasern, faserigem Kollagen mit langem Abstand und segmentalem Kollagen mit langen Abständen. Optische Mikroskopietechniken wie die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen die FIS, sind aber nicht in der Lage, die Merkmale im Nanometerbereich zu zeigen, die die drei Arten von Kollagen unterscheiden, die in diesen Methoden hergestellt werden. In einer typischen Probe zeigt ein zufälliger Scan von 100 x 100 Mikrometern im Quadrat mit einem FM mindestens einige Fibrillen, die fünf bis 50 Mikrometer lang sind, einzeln getrennt.

Kollagen-Fis können in diesem Stadium leicht identifiziert werden, ein Heranzoomen auf eine Scangröße von 10 Mikrometern zeigt, dass alle Fis banderoliert sind. Um die Periodizität der Streifenbildung genau zu messen, ist es am besten, in eine Scangröße von zwei mal zwei Mikrometern zu zoomen. Beim Vergrößern einer quadratischen Scangröße von 10 x 10 Mikrometern wird deutlich, dass alle Fibrillen gebändert sind.

Um die Periodizität der Streifenbildung genau zu messen, ist es am besten, in eine Scangröße von zwei mal zwei Mikrometern zu zoomen. Die Banding-Periode verlängert sich, wenn das Kollagen nach dem Kollagenverfahren mit langen Abständen hergestellt wird, wodurch 270 Nanometer Wiederholungen entlang der Faserlänge erzeugt werden. In einer typischen Stichprobe zeigt ein zufälliger Scan von 100 x 100 Mikrometern im Quadrat mit einem FM mindestens ein paar Fibrillen.

Die Periodizität der Streifenbildung kann durch Heranzoomen in einen 10 x 10 Mikrometer großen Quadratscan gesehen werden und ist mit einem zwei mal zwei Mikrometer großen Quadratscan leicht messbar. Schließlich bildet das segmentale Kollagen mit langem Abstand gar keine Fasern, sondern einzelne Segmente. In einer typischen Stichprobe zeigt ein zufälliger Scan von 100 x 100 Mikrometern im Quadrat mit einem FM viele einzelne Punkte.

Ein näherer Scan von 10 x 10 Mikrometern im Quadrat zeigt mehrere SLS-Kristallite und ein Scan von zwei mal zwei Mikrometern im Quadrat zeigt die feinere Struktur eines SLS-Kristalllichts. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einheitliche reife native FLS- und SLS-Kollagenkonstrukte aus kommerziell erhältlichem Kollagenmonomer herstellen können. Kollagen ist ein biokompatibles Material, das als Substrat oder als Gerüst für das Wachstum von Zellen und Geweben nützlich ist.

Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, mit den gewünschten Kollagenstrukturen für diese und andere Anwendungen zu beginnen.