In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, zu zeigen, wie Kollagenmonomere reproduzierbar zur Herstellung dreier verschiedener Arten von Kollagenstrukturen höherer Ordnung verwendet werden können. Natürliches Kollagen wird durch Erhöhung des pH-Werts der Kollagenmonomerlösung hergestellt, faseriges Langabstandskollagen wird durch Kombination von Kollagenmonomer mit Alpha-1-Säureglykoprotein und segmentalem Langabstand gebildet.

Kollagen wird hergestellt, indem Kollagen-Monomer mit einem TP gemischt wird. Letztendlich kommt die Rasterkraftmikroskopie zum Einsatz, um die drei verschiedenen Arten von gebildeten Kollagenstrukturen zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Protokolle gegenüber früher veröffentlichten Verfahren liegt darin, dass sie einfacher sind und die gewünschten Kollagenstrukturen sehr reproduzierbar bilden. Diese Protokolle wurden in unserem Labor in den letzten 10 Jahren entwickelt und nutzen eine zuverlässige kommerzielle Quelle von Kollagen-Monomer als Ausgangsmaterial. Den Ablauf demonstrieren wird Calvin Chang, ein Doktorand aus meinem Labor, um native Kollagenfasern mit klarer 67 Nanometer DB-Banding zu erzeugen.

Beginnen Sie damit, einen Wärmesammler auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen. Bereiten Sie anschließend die Pufferlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit vier Mikrolitern einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Kollagenmonomerlösung vor und mischen Sie sie gut. Die resultierende Lösung sollte klar und farblos sein.

Stellen Sie die Mischung drei bis vier Stunden lang auf einen auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Wärmesammler, um native Kollagenfibrillen zu bilden. Die endgültige Lösung sollte leicht trüb sein und hauptsächlich native Kollagenfibrillen enthalten, um faseriges Kollagen mit großer Abstandsstruktur herzustellen. Geben Sie zunächst ein Milliliter einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung aus Kollagenmonomeren in eine Membran mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 12 bis 14 Kilodalton.

Als Nächstes gegen 400 Milliliter Wasser dialysieren, wobei das Wasser innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden viermal gewechselt wird. Danach 20 Mikroliter des dialysierten Kollagenmonomers mit 20 Mikrolitern ultrareinem Wasser und 20 Mikrolitern von drei Milligramm pro Milliliter Alpha-1-Säureglykoprotein in Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammengeben und mischen.

Lassen Sie das faserige Lungenkollagen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten ausbilden. Während dieser Zeit wechselt die Lösung von klar zu trüb und bildet so genanntes „sick mental long spacing“-Kollagen. Bereiten Sie zunächst den sauren Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor.

Fügen Sie 40 µL einer 10 mg/mL TP-Lösung in Wasser zur Pufferlösung hinzu und mischen Sie gut. Geben Sie abschließend 33 µL einer 3 mg/mL Kollagen-Monomer-Lösung in 0,01 normaler Salzsäure hinzu und mischen Sie, um die Lösungen zu vereinigen.

Lassen Sie das segmentale langgestreckte Kollagen über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur assemblieren. Die endgültige Lösung wird bei dieser Herstellung klar sein, im Gegensatz zu den beiden anderen beschriebenen Kollagenformen. Um eine saubere, ebene Oberfläche für die Rasterkraftmikroskopie oder eine FM zu erhalten, befestigen Sie ein Stück Klebeband an einem FM-Substrat aus Glimmer und ziehen mindestens eine Schicht ab.

Überprüfen Sie das Klebeband, um die vollständige Entfernung einer Schicht zu bestätigen. Sobald eine geeignete Oberfläche vorliegt, geben Sie 20 Mikroliter der Kollagen-FI-Lösung auf das Glimmer-Substrat und lassen Sie diese fünf Minuten lang einwirken. Nach fünf Minuten spülen Sie überschüssige Fibrillen ab, indem Sie Wasser an den Rand des MICA-Substrats geben und es 10 bis 15 Sekunden lang über die Probe fließen lassen.

Fügen Sie kein Wasser direkt auf die Probenfläche hinzu. Anschließend trocknen Sie die Oberfläche, indem Sie vorsichtig einen Strom von Stickstoffgas von einer Kante des Substrats aus anlegen, wobei Sie darauf achten, den Gasstrom nicht auf die Mitte der Probe zu richten.

Überprüfen Sie die Probe unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung auf die native und faserige Langabstandstruktur. Kollagenproben zeigen Klumpen von Fibrillen, während das segmentale Langabstands-Kollagen nicht sichtbar ist. Die einzigartigen Merkmale der verschiedenen Kollagene lassen sich am besten beobachten.

Unter Verwendung eines AFM eine anfängliche quadratische Scanfläche von 100 mal 100 Mikrometer durchführen und anschließend auf Scanflächen von 10 mal 10 Mikrometer quadratisch vergrößern und schließlich auf zwei mal zwei Mikrometer quadratisch. Um die Bandperiodizität der nativen und faserigen Lungenabstände zu beobachten. Kollagen waren die feineren Merkmale des segmentalen Kollagenabstands im Lungengewebe.

Verwenden Sie für natives Kollagen die Atomkraftmikroskopie im intermittierenden Kontaktmodus mit einer Silizium-a-FM-Sonde zur Analyse der faserigen Langabstände und segmentalen Langabstände. Führen Sie die Atomkraftmikroskopie von Kollagen im Kontaktmodus durch und verwenden Sie zur Erzielung bester Ergebnisse Siliziumnitrit-a-FM-Sonden. Überprüfen Sie mindestens zwei weitere Bereiche der Kollagenprobe, um sicherzustellen, dass die anfänglichen Aufnahmen repräsentativ sind.

Die hohe räumliche Auflösung eines KM ist ideal, um die verschiedenen in diesem Video beschriebenen Kollagenpräparationen zu charakterisieren. Es unterscheidet mühelos natives Kollagen, faseriges Kollagen mit großem Abstand und segmentales Kollagen mit großem Abstand. Optische Mikroskopietechniken wie die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie zeigen die Fasern, können jedoch die nanometerskaligen Merkmale nicht darstellen, die die drei in diesen Methoden präparierten Kollagentypen unterscheiden. In einer typischen Probe zeigt ein zufälliger 100 mal 100 Mikrometer großer Scan mittels KM mindestens einige einzelne, getrennte Fibrillen, die fünf bis 50 Mikrometer lang sind.

Kollagenfasern können in diesem Stadium leicht identifiziert werden. Bei einer Vergrößerung mit einer Scan-Größe von 10 Mikrometer im Quadrat ist ersichtlich, dass alle Fasern gestreift sind. Um die Periodizität der Streifen genau messen zu können, ist es am besten, auf eine Scan-Größe von zwei mal zwei Mikrometer im Quadrat heranzuzoomen. Bei einer Vergrößerung auf eine Scan-Größe von 10 mal 10 Mikrometer im Quadrat zeigt sich, dass alle Fibrillen gestreift sind.

Um die Bandperiodizität genau messen zu können, ist es am besten, auf ein zwei mal zwei Mikrometer großes Scan-Feld zu vergrößern. Die Bandperiodizität nimmt zu, wenn das Kollagen gemäß der Langabstands-Kollagen-Methode präpariert wird, wodurch sich 270 Nanometer lange Wiederholungen entlang der Faserlänge ergeben. In einer typischen Probe zeigt ein 100 mal 100 Mikrometer großes zufällig gewähltes Scan-Feld mittels eines LM mindestens einige Fibrillen.

Die Bandabstandsperiodizität ist durch Heranzoomen auf eine 10 mal 10 Mikrometer große quadratische Aufnahme sichtbar und leicht mit einer 2 mal 2 Mikrometer großen quadratischen Aufnahme messbar. Schließlich bildet das segmentale langperiodische Kollagen überhaupt keine Fasern, sondern einzelne Segmente. In einer typischen Probe zeigt eine zufällige 100 mal 100 Mikrometer große quadratische Aufnahme mittels Kraftmikroskopie viele einzelne Punkte.

Ein detaillierterer 10 mal 10 Mikrometer großer Quadratscan zeigt mehrere SLS-Kristallite, und ein 2 mal 2 Mikrometer großer Quadratscan zeigt die feinere Struktur eines SLS-Kristalllichts. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einheitliche, ausgereifte native FLS- und SLS-Kollagenkonstrukte aus im Handel erhältlichem Kollagenmonomer herstellt. Kollagen ist ein biokompatibles Material, das als Substrat oder Gerüst zum Kultivieren von Zellen und Geweben nützlich ist.

Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, mit geeigneten Kollagenstrukturen für diese und andere Anwendungen zu beginnen.