Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Dieses Video zeigt einen neuartigen einstufigen Bund-Assay für die quantitative Analyse der Protease-Kinetik. Die allgemeine Strategie für den folgenden Assay basiert auf der Analyse von Bundsignalen. Hier sind das Bundpaar, Cype und Ype an den N- und C-Termini von pre sumo one im intakten Substrat befestigt und Cype und Ype sind in unmittelbarer Nähe eingeschlossen.

Wenn dieses Molekül bei 414 Nanometern angeregt wird, liegt der Großteil des Emissionssignals bei 530 Nanometern. Wenn jedoch eine PROTEASE mit SENP one hinzugefügt wird, wird das Substrat am Gly-Glyk in Sumo one C Terminus gespalten, der CIPA und wpa trennt. Wenn es nun bei 414 Nanometern angeregt wird, liegt der Großteil des gesehenen Emissionssignals bei 475 Nanometern.

Um die Kinetik dieser Reaktion zu beurteilen, werden alle 15 Sekunden über einen Zeitraum von fünf Minuten die Fluoreszenzemissionen bestimmt. Die Analyse der resultierenden Fluoreszenzdaten zeigt die Geschwindigkeit, mit der das Cype Pre Sumo One Ype-Substrat von der SENP One-Protease verdaut wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber vorhandener Masse, wie z.B. einem Fettassay unter Verwendung von Fluoreszenzpeptidsubstraten oder radimetrischer Analyse oder westlichem Blut, besteht darin, dass diese Technik den kinetischen Echtzeitparameter in einem einzigen Schritt bestimmen kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von proteinhaltigen Krankheiten wie Krebs und Stoffwechselerkrankungen. Da diese Technik präzise und hohe Durchsatz-Assays für verschiedene Profis und deren Inhibitorentdeckung und die Charakterisierung des demonstrativen Krankheitsverfahrens liefern kann, wird ein ENUA-Doktorand aus meinem Labor sein, der die erste Person war, die diese Methode und dieses Verfahren entwickelt hat. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die offenen Leserahmen der Cype ype pre sumo one, der mature sumo one und der SENP one katalytischen Domäne durch PCR amplifizieren.

Klonen Sie die resultierenden Produkte in einen PCR-Zwei-Topo-Vektor. Bestätigen Sie als Nächstes, dass die Sequenzen der Gene durch Sequenzierung korrekt sind. Klonen Sie dann die CD NA-Codierung CYPE pre sumo one ype cype sumo, one ype und die katalytische Domäne von SENP one in den PET 28 B-Vektor mit einem N-terminalen Polyhis-Tag.

Nachdem die Gene in den Vektor kloniert wurden, transformieren Sie sie durch Elektroporation in Esia coli, BBL 21 DE three. Nachdem Sie die transformierten Bakterien auf festem Medium plattiert haben, wählen Sie einzelne Kolonien aus und kultivieren Sie sie über Nacht. Als nächstes werden zwei Literkolben mit zwei XYT-Medien mit den transformierten Bakterien im Verhältnis eins zu 100 beimpft.

Inkubieren Sie die Kulturen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 250 U/min, um eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern zu erreichen. Um die Proteinexpression zu induzieren, fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolar hinzu und schütteln Sie es 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius bei 200 U/min. Übertragen Sie anschließend die Bakterien in 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen.

Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten geerntet. Nach dem Schleudern den Überstand verwerfen und die Bakterienzellen in einem Lysepuffer aus Tris-HCL-Natriumchlorid resuspendieren und die Kulturen in 50 Milliliter überführen. Zentrifugenröhrchen beschallen die Zellen dann 10 Minuten lang im Fünf-Sekunden-Takt mit einer Amplitude von 70, um die Bakterienzellen aufzubrechen.

Um die Fusionsproteine von den Zelltrümmern zu trennen, zentrifugieren Sie die Röhrchen dann bei 35.000 RCF bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Richten Sie während des Schleuderns eine 10-Milliliter-BioRad-Säule mit 500 Mikrolitern Nickel-NTI-Kügelchen für jeden Liter kultivierter Zellen ein. Lassen Sie die Lösung nach dem Schleudern aus der Säule tropfen.

Den Überstand in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Gießen Sie die überstehende Lösung in die Säule. Sobald der gesamte Überstand in das Harz eingedrungen ist, waschen Sie die Säule zweimal mit 10 Millilitern eines Trishydrochlorid-Natriumchlorids und geben Sie Aolpuffer ab.

Um zu eluieren. Das Protein fügt 500 Mikroliter des gleichen Puffers hinzu, diesmal mit 500 Millimolar Ol. Sammeln Sie den Durchfluss in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Als nächstes wird die Lösung mit einem molekularen Cutoff von 10 Kilodalton in einen Dialyseschlauch überführt und die Probe über Nacht in einem Liter Puffer dialysiert, der 20 millimolare Tris, HCL 50, millimolares Natriumchlorid und ein millimolares DTT bei vier Grad Celsius enthält. Nach der Dialyse werden die gereinigten Proteine in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Konzentrationen der gereinigten Proteine mit dem Bradford-Assay bestimmt. Als nächstes werden die gereinigten Proteine verwendet, um die Geschwindigkeit zu bewerten, mit der Pre Sumo One von SENP one gespalten wird, wobei ein quantitativer Fret-Assay verwendet wird.

In Mikrozentrifugenröhrchen werden 60 Milliliter Spet Sumo one und YA in Konzentrationen von 5100, 200, 500, 750 und 1000 ano molar hergestellt. Diese Kontrollproben werden verwendet, um das konstante Verhältnis der direkten Emission von Cype und YA im selben Puffer zu charakterisieren. Bereiten Sie Cype pre sumo one y PET in 12 Konzentrationen von 0,03 Mikromolar bis 0,9 Mikromolar und einer 0,3 Nanomolar Verdünnung der katalytischen Domäne von SENP one vor.

Richten Sie den Fluoreszenz-Multiwell-Platten-Reader so ein, dass er die Fluoreszenzemission bei 475 und 530 Nanometern nach einer Anregung bei 414 Nanometern und die Emission bei 530 Nanometern nach einer Anregung bei 475 Nanometern im 32. Intervall für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius misst. Um eine Autofluoreszenz der Platte zu erhalten, legen Sie eine leere 384-Well-Platte in das Fluorimeter und nehmen Sie die Messungen vor. Sobald die Autofluoreszenz der Platte bestimmt wurde, passen Sie die Einstellungen des Fluorimeters so an, dass für Cype Sumo eine Anregung 414 Nanometer beträgt und Messungen bei 475 Nanometern und 530 Nanometern für ype Anregung 414 Nanometer und 475 Nanometer und Messungen bei 530 Nanometern durchgeführt werden.

Geben Sie als Nächstes 75 Mikroliter Cype Sumo ein Jahr oder Cype Sumo ein Jahr in die entsprechenden Vertiefungen der 384-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung, wie in diesem Diagramm gezeigt. Geben Sie dann fünf Mikroliter des vorbereiteten SENP, einen in jede Vertiefung, wodurch das endgültige Volumen sofort auf 80 Mikroliter ankommt, setzen Sie die Platte in das Fluorimeter und beginnen Sie mit den Fluoreszenzmessungen nach dem Lauf. Analysieren Sie die Fluoreszenzmesswerte mit der quantitativen Bundanalysemethode, die im nächsten Abschnitt vorgestellt wird.

Die Grundidee dieser Technologie besteht darin, das absolute Bedrohungssignal mit dem Aufschluss zu korrelieren. Möchten Sie das absolute Bedrohungssignal erhalten? Wir müssen die direkten Beiträge des Donors und des Akzeptors von der gesamten Fluoreszenzemission bei den Emissionswellenlängen der Akzeptoren ausschließen.

Die direkten Beiträge des Spenders und des Akzeptors werden aus den Korrelationskoeffizientenfaktoren arfa und dem Beta des Spenders bzw. der Akzeptoren berechnet. In diesem Abschnitt des Videos wird detailliert beschrieben, wie die Berechnungen durchgeführt werden. Um die Kinetik des Substrataufschlusses mit SENP one zu analysieren, verwenden Sie die GraphPad Prism five Software. Öffnen Sie zunächst die exportierte txt-Datei in Excel, nachdem Sie die Hintergrundfluoreszenz der Platte subtrahiert haben.

Die aufgeschlossene Substratkonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wird durch PrepU-Formulierungen berechnet, wenn sie durch Licht mit einer Wellenlänge von 414 Nanometern angeregt wird, kann die Gesamtfluoreszenzemission von spet pre sumo one ype bei 530 Nanometern aus drei Quellen abgeleitet werden, den absoluten bundinduzierten Y-Pets, Emission, Cype, Direktemission und WPE-Direktemission. In dieser Gleichung ist FL fünf 30 Schrägstrich vier 14 die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern. Bei Anregung bei 414 Nanometern ist FL fret das absolute Bundsignal.

FL Spet Con ist die Spet Direktstrahlung. Bei Anregung bei 414 Nanometern und FL ist Ype Con die Ype-Direktemission. Bei Anregung bei 414 Nanometern ist die direkte Emission von spet bei 530 Nanometern proportional zu seiner Emission bei 475 Nanometern.

Bei Anregung bei 414 Nanometern mit einem konstanten Verhältnis von alpha ist die direkte Emission von YA bei 530 Nanometern unter Anregung bei 414 Nanometern proportional zu seiner Emission bei 530 Nanometern. Bei Anregung bei 475 Nanometern mit einem konstanten Beta-Verhältnis von spet pre sumo wird one ype von SENP one verdaut und bei 414 Nanometern angeregt. Die Fluoreszenzmission bei 530 Nanometern ist verringert, kann aber immer noch wie hier in drei Teile unterteilt werden.

FL Prime five 30 slash four 14 ist die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern nach dem Aufschluss. Bei Anregung bei 414 ist FL Primbund das verbleibende absolute Bundsignal und FL Prime SPET 4 75 Slash Four 14 die Spet-Emission bei 475 Nanometern nach dem Aufschluss, wenn sie bei 414 Nanometern angeregt wird. Die Emission erfolgt aus zwei Teilen unverdautem Cype, Pre Sumo, einem Ype und verdautem Cype Sumo einem.

Ein FL Y PET five 30 slash 4 75 ist die ype-Emission, wenn sie bei 475 Nanometern angeregt wird, die konstant ist, unabhängig davon, ob cype pre sumo one ype nach der Verdauung durch SENP one verdaut wird oder nicht, die verbleibende Bundemission wird in dieser Gleichung gezeigt, wobei C die Gesamtkonzentration von cype ist. Pre sumo one ype, und X ist die Konzentration von verdautem Cype. Vor dem Sumo-YA.By Kombinieren aller Elemente wird die detektierte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern unter Anregung von 414 Nanometern durch diese Gleichung für den bundbasierten Protease-Assay für die enzymkinetische Untersuchung gezeigt, die Reaktionsgeschwindigkeit korreliert mit der Änderung der Substratmenge, da die Produktkonzentration exponentiell von Null ansteigt.

Wenn T gleich Null ist, wie hier zu sehen, gibt S unter Null die ursprüngliche Substratkonzentration an, wenn T gleich Null ist. Die ursprüngliche Geschwindigkeit ist die Reifung des Pre Sumo. Eine von SENP.

Eine kann bestimmt werden, indem man die Veränderungen des Fluoreszenzsignals bei 475 und 530 Nanometern während des Prozesses überwacht. Wie hier gezeigt, war die Geschwindigkeit der Reifung von pre sumo one substratdosisabhängig, was darauf hindeutet, dass die katalytische Domäne von SENP one eine ausgezeichnete Aktivität für die Reifung von presum O one zeigt. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten wurden unter Verwendung der gleichen Analyse mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen berechnet.

Das KCAT-zu-KM-Verhältnis wird im Allgemeinen verwendet, um die Wirkungsgrade verschiedener Enzyme mit einem Substrat oder eines bestimmten Enzyms mit unterschiedlichen Substraten zu vergleichen. KM und Vmax können aus der McKayla-Zementin-Gleichung erhalten werden, indem die verschiedenen Anfangsgeschwindigkeiten, die den unterschiedlichen Cyp-Konzentrationen entsprechen, aufgetragen werden. Pre sumo one YA kcat wurde mit dieser Gleichung erhalten.

Nach der obigen Analyse betrug der berechnete KM 0,21 plus oder minus 0,4 Mikromolaren. Der kcat betrug 6,90 plus oder minus 0,28 pro Sekunde und das kcat km-Verhältnis betrug 3,2 plus oder minus 0,55 mal 10 zum Siebtel pro Molar. Zweitens, Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Proteaseverbindung als Parameter mit einem neuartigen quantitativen Fettassay in einer einstufigen Messung in Echtzeit nach diesem Verfahren bestimmen können.

Andere Methoden, wie z.B. eine Produkthemmung oder die Charakterisierung von Inhibitoren, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie real scheinbares KM oder Inhibitor K zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteine, um die genaue Genetik, das Verständnis der beteiligten Proteine, physiologische und den pathologischen Prozess in optischen Sensoren zu erforschen. Sofortige Diagnose und Wirkstoffforschung.