Name: Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Lernen Sie eine quantitative FRET-Analyse zur Bestimmung von SENP1-Protease-Kinetiken mit pre-SUMO1-Substraten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Messung kinetischer Parameter für biochemische Forschung.

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Wir sind sehr dankbar, dass Victor GJ Rodgers für wertvolle Ratschläge. Wir danken allen Mitgliedern der Liao-Gruppe für sehr enge gemeinsame Arbeit und für die Hilfe bei dieser Studie. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (Grant AI076504 JL) unterstützt.

Ein. Plasmidkonstrukte <ol><li> Amplifizieren die offenen Leseraster der Gene mittels PCR und Klonierung der PCR-Produkte in PCRII-TOPO-Vektor. </li><li> Bestätigen der Produkte durch Sequenzierung und Klonen der cDNA CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet und katalytische Domäne in das SENP1 pET28 (b) Vektor mit einer N-terminalen Hexahistidin-Tag. </li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Transformieren Escherichia coli-Zellen des Stammes BL21 (DE3) mit pET28 (b) Vektoren, codierend CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet und die katalytischen Domänen von SENP1. </li><li> Angewachsen die transformierten Bakterien in 2xYT Medium für 3 Stunden bei 37 ° C (unter Schütteln bei 250 rpm), um eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht. </li><li> Fügen Sie 100 uM Isopropyl-β-D-(IPTG) (Endkonzentration), um die Proteinexpression zu induzieren und schütteln für 16 Stunden bei 25 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Ernten die Bakterien durch centrifugation bei 10.000 rpm bei 4 ° C für 5 min und resuspendiert ihnen in einem Puffer aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl und 5 mM Imidazol. </li><li> Beschallen die Zellen für 10 Minuten in 5-sec Intervallen bei einer Leistungseinstellung von 25 W mit MiSonics 4000 Sonicator und sammeln sie durch Zentrifugation bei 35.000 × g bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Einrichten der Säule mit 500 ml Ni-NTA-Kügelchen für 1 l-Kultur und Transfer des Überstandes in die Säule. </li><li> Waschen des Harzes mit einem Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl und 10 mM Imidazol zweimal. </li><li> Eluieren Protein mit Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl und 500 mM Imidazol und Dialyse in einen Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl und 1 mM Dithiothreitol (DTT) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Die Konzentrationen der gereinigten Proteine ​​durch das Bradford-Assay. Alternatives Verfahren zur Protein-Konzentration Messungen SDS-PAGE-Gelelektrophorese werden und dann mit Coomassie-Blau gefärbt, gefolgt mit bildgebendenquantitativ. </li></ol> 3. Quantitative FRET Spectrum Analysis <ol><li> Die allgemeine Strategie für den Test wurde am FRET Signalisierung (Abbildung 1). Die FRET-Paar wurde CyPet und YPet, an den N-und C-Termini tagged jeweils von Pre-SUMO1. SENP1 spaltet das Fusionsprotein CyPet-(pre-SUMO1)-YPet am Gly-Gly Seite auf SUMO1 der C-Terminus und somit löst die SUMO Schwanz mit YPet. Die FRET-Signal gestört wird, was zu einem Anstieg der Emission aus CyPet und eine dramatische Abnahme der YPet die Emission bei der CyPet Anregungswellenlänge. </li><li> Der absolute FRET-induzierte YPet die Emission CyPet direkte Emission und YPet direkte Emission (Abbildung: wenn es durch Licht mit einer Wellenlänge von 414 nm, die gesamte Fluoreszenzemission CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bei 530 nm angeregt werden aus drei Quellen abgeleitet werden 2). </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> wo FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; ist die gesamte Fluoreszenz-Emission bei 530 nm, wenn sie bei 414 nm angeregt, FRET FL ist die absolute FRET-Signals, FL ist CyPet (cont) die direkte Emission CyPet wenn sie bei 414 nm angeregt, und FL YPet (cont) ist die YPet direkte Emission, wenn bei 414 nm angeregt. Der Index der (cont) steht für den Beitrag. <ol start="3"><li> Die direkte Emission von CyPet bei 530 nm war proportional zu seiner Emission bei 475 nm, wenn sie bei 414 nm mit einem konstanten Verhältnis von α angeregt. CyPet-SUMO1 wurde bei Konzentrationen von 50, 100, 200, 500 und 750 nM hergestellt und 1 mM und die Emissionen bei 475 und 530 nm wurden nach Anregung bei 414 nm zur α (Abbildung 3-1) zu bestimmen. </li><li> Die direkte Emission von YPet bei 530 nm bei Anregung bei 414 nm war proportional zu seiner Emission bei 530 nm, wenn bei 475 nm mit einem konstanten Verhältnis von β angeregt. YPet bei Konzentrationen von 50, 100, 200, 500, 750 A hergestelltnd 1000 nm, und die Emission bei 530 nm wurde gemessen, wenn die Proben durch Wellenlängen von 414 und 475 nm angeregt wurden β (Abb. 3-2) zu bestimmen. </li><li> Wenn CyPet-(pre-SUMO1)-YPet durch SENP1 verdaut wurde, die Spaltung CyPet-SUMO1 und die SUMO1 Schwanz mit YPet veröffentlicht. Wenn die Verbindung bei 414 nm angeregt wurde, wurde die Fluoreszenz-Emission bei 530 nm (FL &#39;530/414) verringert, aber trotzdem in drei Teile unterteilt werden: </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> wo FL &#39;530/414 die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 nm ist nach der Verdauung, wenn bei 414 nm angeregt, FL&#39; FRET ist die verbleibende absolute FRET-Signals ist FL &#39;CyPet (475/414) die CyPet Emission bei 475 nm nach der Verdauung, wenn Anregung bei 414 nm (hier die CyPet Emission ist aus zwei Teilen: unverdaute CyPet-(pre-SUMO1)-YPet und verdauten CyPet-SUMO1) und FL YPet(530/475) ist die Emission YPet wenn bei 475 nm angeregt, die konstant ob CyPet-(pre-SUMO1)-YPet verdaut wird oder nicht. <ol start="6"><li> Nach Verdauung durch SENP1, FRET die verbleibende Emission (FL &#39;FRET) ist: </li></ol><img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> wobei C die Gesamtkonzentration der CyPet-(pre-SUMO1)-YPet und x die Konzentration der verdauten CyPet-(pre-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Durch die Kombination aller Elemente ist die nachgewiesene Fluoreszenz-Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm (FL &#39;530/414): </li></ol><img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET-basierten Protease-Assay für Enzyme Kinetische Studie <ol><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wurde mit der katalytischen Domäne von SENP1 bei 37 ° C in einem Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% inkubiert (v /v) Tween-20 und 1 mM DTT bis zu einem Gesamtvolumen von 80 ml und übertragen in 384-Well-Platte. </li><li> Durchläufe wurden durch Messung der Fluoreszenz-Emission bei 475 und 530 nm nach einer Anregung bei 414 nm in einem Multiwell-Plattenleser Fluoreszenz für 5 min mit 15-sec Intervallen durchgeführt. </li><li> Die Reaktionsgeschwindigkeit (v) wurde mit der Änderung in der Menge an Substrat (S) als korreliert: </li></ol><img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> Die Konzentration des Produkts exponentiell von 0 als [S] 0 (original Substratkonzentration) bei t = 0: </li></ol><img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Wenn t = 0, ist die ursprüngliche Geschwindigkeit (V 0): </li></ol><img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> Die concentration des SENP1 wurde fixiert, und die Konzentration des CyPet-(pre-SUMO1)-YPet wurde aus 100-mal mehr als die Konzentration des Enzyms, das durch Michaelis-Menten-Gleichung erforderlich ist erhöht. </li><li> All der fluoreszierenden Lesungen wurden von der quantitative FRET-Analyse-Methode analysiert und dargestellt in GraphPad Prism V Software, um die Michaelis-Menten-Gleichung passen. Die nichtlineare Regression kann auch mit Hilfe von mehr gemeinsamen Software-Pakete wie Tabellenkalkulations-Programmen (z. B. Microsoft Excel) durchgeführt werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Reifung der Pre-SUMO1 durch SENP1 kann durch Überwachen der Änderungen des Fluoreszenzsignals bei 475 und 530 nm während des Verfahrens bestimmt werden. Das Ergebnis zeigte, dass die Geschwindigkeit des Vor-SUMO1 Verdauung durch SENP1 in einem Substrat-dosisabhängigen Weise (Abbildung 4). Dies legt nahe, dass die katalytische Domäne von SENP1 zeigt ausgezeichnete Aktivität zur pre-SUMO1 der Reifung. Die anfängliche Reaktiontion Geschwindigkeiten wurden durch die obige Analyse mit verschiedenen Substratkonzentrationen (Tabelle 1) berechnet. Der k cat / K M-Verhältnis wird im Allgemeinen verwendet, um die Effizienz verschiedener Enzyme mit einem Substrat oder einem bestimmten Enzyms mit verschiedenen Substraten zu vergleichen. K M und V max aus der Michaelis-Menten-Gleichung durch Auftragen der verschiedenen Anfangsgeschwindigkeiten, entsprechend erhalten werden zu den verschiedenen Konzentrationen von CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Abbildung 5) k cat wurde als erhalten.: <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> Gemäß der obigen Analyse betrug die berechnete K M 0,21 ± 0,04 pM, war der k cat 6,90 ± 0,28 s -1, und die k cat / K M betrug (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Abbildung 1. Graph der FRET-basierten Protease Assay für SENP die pre-sumos Reifung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Abbildung 2. Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Signal in Form von Beiträgen durch den Donor, Akzeptor und FRET. Dissektion der Emissionsspektren CyPet-(pre-SUMO1)-YPet unter Anregung bei 414 nm. FL CyPet (530/414) wird CyPet die Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm, FRET FL ist die FRET-induzierte YPet Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm und FL YPet (530/414) YPet die Emission bei 530 nm unter Anregung von 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Berechnung der Richtung Emissionsfaktor α und β. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantitative Analyse von CyPet-(pre-SUMO1)-YPet durch unterschiedliche Übersetzungsverhältnisse der katalytischen Domäne von SENP1 verdaut. Reaktionen wurden innerhalb der ersten 5 min verfolgt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Abbildung 5. Michaelis-Menten grafische Analyse der CyPet-(pre-SUMO1)-YPet die Verdauung durch SENP1. Daten wurden aufgetragen und mittels GraphPad Prism V und nichtlineare Regression. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (uM) </td><td> V 0 (uM / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Anfangsgeschwindigkeiten Bestimmung der pre-SUMO1 die Reifung durch SENP1. In jeder Substratkonzentration, wurden vier Proben verwendet werden, um die Verdauung zu messen. Die Standardabweichung kam aus den Variationen dieser vier Proben. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (uM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / k M (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kinetische Parameter der Pre-SUMO1 die Reifung durch SENP1 durch quantitative FRET-Analysen. Die Standardabweichung kam aus den vier Proben in jeder Substratkonzentration.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

FRET-Technologie verwendet wurde, um die Pre-SUMO1 SENP1 Reifung von 9 studieren. GFP-YFP wurde als FRET-Paar und ratiometrische Analyse, die das Verhältnis von Akzeptor zu Donor Emissionen verwendet, wurde verwendet, um die kinetischen Eigenschaften charakterisieren. Es besteht jedoch keine Berücksichtigung von Donor und Akzeptor Eigenfluoreszenz im herkömmlichen ratiometrische FRET-Analyse. Das Verhältnis nicht direkt mit der Menge an verdauten Substrat korrelieren. Hier bericht...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Research Products Corp Internationa.l </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie plus (Bradford) Assay Regent </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-Well-Platte (Glasboden) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 Plattenlesegerät </td><td> Molecular Device </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (förster resonance energy transfer) analyse für senp1 protease kinetics bestimmung

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslationale Modifikationen von Proteinen mit Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnliche Proteine ​​(UBLs) werden häufig verwendet, um dynamisch zu regulieren Protein-Aktivität und haben diverse Rollen in vielen biologischen Prozessen. Beispielsweise SUMO kovalent modifiziert eine große Anzahl oder Proteine ​​mit wichtige Rollen bei vielen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklus-Regulation, Zellüberleben und Tod, DNA-Schädigung Antwort und Stress-Response 1-5. SENP, wie SUMO-spezifische Protease, um Funktionen wie einer Endopeptidase bei der Reifung von SUMO Vorstufen oder als Isopeptidase SUMO von der Zielproteine ​​zu entfernen und Aktualisiere die SUMOylierung Zyklus 1,3,6,7. Die katalytische Effizienz oder Spezifität eines Enzyms wird am besten durch das Verhältnis der kinetischen Konstanten, k cat / K M gekennzeichnet. In mehreren Untersuchungen haben die kinetischen Parameter von SUMO-SENP paarweise durch verschiedene Verfahren, einschließlich Polyacrylamid Gel-basierten Western-Blot bestimmt worden ist, radIOActive-markiertes Substrat, eine fluoreszierende Verbindung oder Protein markierte Substrat 8-13. Doch die Polyacrylamid-Gel-Techniken, die die &quot;native&quot; Proteine ​​verwendet, aber aufwendig und technisch anspruchsvoll sind, haben die nicht leicht eignen sich für detaillierte quantitative Analyse. Das erhaltene k cat / K M aus Untersuchungen unter Verwendung Tetrapeptiden oder Proteine ​​mit einem ACC-(7-Amino-4-carbamoylmetylcoumarin) oder AMC (7-Amino-4-methylcumarin) Fluorophor waren entweder bis zu zwei Größenordnungen niedriger als die natürlichen Substrate oder kann nicht eine deutliche Differenzierung der iso-und Endopeptidase Aktivitäten SENPs. Kürzlich FRET-Protease-Tests wurden verwendet, um die Enzyme deubiquitinating (DUBs) oder SENPs mit der FRET-Paar von Cyan Fluorescent Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) 9,10,14,15 studieren. Das Verhältnis von Akzeptor-Emission um Donoremission wurde als quantitative Parameter verwendet für Signal-Monitor für Protease ac FRETtivität Entschlossenheit. Allerdings ignoriert diese Methode Signal Kreuzkontaminationen bei der Akzeptor und Donor Emissionswellenlängen von Donor-und Akzeptor Eigenfluoreszenz und war somit nicht korrekt. Wir entwickelten einen neuartigen hochempfindliche quantitative und FRET-Protease Assay zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Pre-SUMO1 SENP1 Reifung durch. Gentechnisch FRET-Paar und CyPet YPet mit deutlich verbesserten Wirkungsgrad und FRET Fluoreszenzquantenausbeute, wurden verwendet, um die CyPet-(pre-SUMO1)-YPet Substrat 16 zu erzeugen. Wir differenziert und quantifiziert absolute Fluoreszenz-Signale von der Donor-und Akzeptor beigetragen und FRET an den Akzeptor und Emissionswellenlängen sind. Der Wert von k cat / K M wurde als (3,2 ± 0,55) erhalten x10 7 M -1 s -1 von SENP1 Richtung Pre-SUMO1, die in Übereinstimmung mit den allgemeinen enzymatischen kinetischen Parameter ist. Daher ist diese Methode gültig und kann verwendet werden, einsa allgemeinen Ansatz auf andere Proteasen sowie charakterisieren.

Eine neuartige Methode, die quantitative Analyse von FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Signale für das Studium Enzymkinetik beschrieben.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; Und<em&gt; K<sub&gt; Cat</sub</em&gt; Wurden zur Hydrolyse der katalytischen Domäne des SENP1 (SUMO / Sentrin spezifische Protease 1) vor SUMO1 (Small Ubiquitin-ähnlicher Modifikator) erhalten. Die allgemeinen Grundsätze dieses quantitative-FRET-basierten Protease kinetische Untersuchung auf andere Proteasen angewendet werden.

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Reversible posttranslationale Modifikationen von Proteinen mit Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnlichen Proteinen (Ubls) werden in weitem Umfang eingesetzt, um Proteine dynamisch zu regulieren ...

Dieses Video demonstriert einen neuartigen einstufigen FRET-Assay zur quantitativen Analyse der Proteasekinetik. Die allgemeine Strategie des folgenden Assays basiert auf der FRET-Signalanalyse. Dabei sind das FRET-Paar CYPe und YPe an den N- und C-Termini von Pre-SUMO1 im intakten Substrat angebracht, wodurch CYPe und YPe räumlich nahe beieinander liegen.Wenn dieses Molekül bei 414 Nanometern angeregt wird, liegt der Großteil des Emissionssignals bei 530 Nanometern. Wenn jedoch die SENP1-Protease hinzugefügt wird, wird das Substrat an der Gly-Gly-Stelle am C-Terminus von SUMO1 gespalten, wodurch CIPA und WPA getrennt werden. Wenn es nun bei 414 Nanometern angeregt wird, liegt der Großteil des beobachteten Emissionssignals bei 475 Nanometern.Um die Kinetik dieser Reaktion zu bewerten, werden alle 15 Sekunden über einen Zeitraum von fünf Minuten Fluoreszenzemissionen bestimmt. Die Analyse der resultierenden Fluoreszenzdaten zeigt die Geschwindigkeit auf, mit der das Cype Pre SUMO One Ype-Substrat durch die SENP One-Protease abgebaut wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einem Massen-Fett-Assay unter Verwendung eines fluoreszierenden Peptid-Substrats, einer radio­metrischen Analyse oder einer Western Blot-Analyse besteht darin, dass mit dieser Technik die kinetischen Echtzeitparameter in einem einzigen Arbeitsschritt in einem Echtzeit-Assay bestimmt werden können.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie und Diagnose von Erkrankungen, die durch Proteine verursacht werden, wie beispielsweise Krebserkrankungen und Stoffwechselerkrankungen. Da diese Technik präzise Hochdurchsatz-Analysen für verschiedene Proteine ermöglicht und die Entdeckung von deren Inhibitoren sowie die Charakterisierung krankhafter Vorgänge unterstützt, wird der demonstrative Krankheitsverlauf von ENUA, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt, der die erste Person war, die diese Methode und dieses Verfahren entwickelte. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die offenen Leserahmen von Cype ype pre sumo one, mature sumo one und der katalytischen Domäne von SENP one mittels PCR amplifizieren.Klonieren Sie die resultierenden Produkte in einen PCR-Topo-Vektor. Bestätigen Sie anschließend durch Sequenzierung, dass die Gensequenzen korrekt sind. Klonieren Sie dann die cDNA, die CYPE, Pre-Sumo1, YPE-CYPE-Sumo1, YPE und die katalytische Domäne von SENP1 kodiert, in den PET-28B-Vektor mit einem N-terminalen Polyhis-Tag.Nachdem die Gene in den Vektor kloniert wurden, transformieren Sie diese mittels Elektroporation in Esia coli, BBL 21 DE drei. Nach dem Aufbringen der transformierten Bakterien auf festem Medium wählen Sie einzelne Kolonien aus und kultivieren diese über Nacht. Anschließend impfen Sie Zwei-Liter-Kolben mit zwei XYT-Medium mit den transformierten Bakterien im Verhältnis eins zu 100 an.Inkubieren Sie die Kulturen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 250 U/min, um eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern zu erreichen. Um die Proteinsynthese zu induzieren, geben Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 100 µM hinzu und schütteln 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius mit 200 U/min. Danach überführen Sie die Bakterien in Zentrifugenflaschen mit einem Fassungsvermögen von 250 Millilitern.Anschließend die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten gewinnen. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und die bakteriellen Zellen in einem Puffer zur Zelllyse aus Tris-HCl, Natriumchlorid und Ole resuspendieren und die Kulturen in 50 Milliliter überführen. Zentrifugenröhrchen verwenden, dann die Zellen bei einer Amplitude von 70 für 10 Minuten in Intervallen von fünf Sekunden beschallen, um die bakteriellen Zellen aufzubrechen.Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 35.000 RCF bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, um die Fusionsproteine von den Zelltrümmern zu trennen. Während des Zentrifugierens bereiten Sie eine 10-Milliliter-BioRad-Säule mit 500 Mikroliter Nickel-NTI-Kügelchen pro Liter kultivierter Zellen vor. Lassen Sie die Lösung nach dem Zentrifugieren durch die Säule tropfen.Überführen Sie das Überstand in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Gießen Sie die Überstandlösung in die Säule. Sobald der gesamte Überstand in das Harz eingetreten ist, waschen Sie die Säule zweimal mit je 10 Milliliter Tris-Hydrochlorid-Natriumchlorid und emittieren Sie einen Aole-Puffer.Zur Elution das Protein mit 500 Mikrolitern desselben Puffers versetzen, der diesmal 500 Millimolar Ole enthält. Das Durchflussvolumen in einem Mikrozentrifugenröhrchen sammeln.Als Nächstes wird die Lösung in Dialyse-Schläuche mit einer molekularen Grenze von 10 Kilodalton überführt und die Probe über Nacht in einem Liter Puffer dialysiert, der 20 Millimolar Tris, 50 Millimolar HCl, Natriumchlorid und 1 Millimolar DTT bei vier Grad Celsius enthält. Nach der Dialyse werden die gereinigten Proteine in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und deren Konzentrationen mittels Bradford-Assay bestimmt. Anschließend werden die gereinigten Proteine verwendet, um die Geschwindigkeit, mit der Prä-Sumo1 durch SENP1 gespalten wird, mittels eines quantitativen FRET-Assays zu untersuchen.In Mikrozentrifugenröhrchen bereiten Sie 60 Milliliter Spet Sumo eins und YA in Konzentrationen von 5100, 200 500, 750 und 1000 Anomolar vor. Diese Kontrollproben werden verwendet, um das konstante Verhältnis der direkten Emission von Cype und YA im selben Puffer zu charakterisieren. Bereiten Sie Cype Pre Sumo eins y PET in 12 Konzentrationen im Bereich von 0,03 Mikromolar bis 0,9 Mikromolar sowie eine 0,3-Nanomolar-Verdünnung der katalytischen Domäne von SENP eins vor.Richten Sie den Fluoreszenz-Mehrfachplatten-Reader so ein, dass er die fluoreszierende Emission bei 475 und 530 Nanometern nach einer Anregung bei 414 Nanometern sowie die Emission bei 530 Nanometern nach einer Anregung bei 475 Nanometern in Intervallen von 32 Sekunden über zwei Minuten bei 37 Grad Celsius misst. Um die Autofluoreszenz der Platte zu erhalten, stellen Sie eine leere 384-Loch-Platte in das Fluorimeter und nehmen Sie die Messungen vor. Sobald die Autofluoreszenz der Platte bestimmt wurde, passen Sie die Einstellungen des Fluorimeters so an, dass für Cype Sumo eine Anregung bei 414 Nanometern erfolgt und Messungen bei 475 und 530 Nanometern vorgenommen werden, während für ype die Anregung bei 414 und 475 Nanometern erfolgt und Messungen bei 530 Nanometern durchgeführt werden.Fügen Sie anschließend 75 Mikroliter cype Sumo one ype oder cype sumo one ype in die entsprechenden Vertiefungen der 384-Well-Platte in dreifacher Ausführung wie in diesem Diagramm dargestellt hinzu. Geben Sie dann jeweils fünf Mikroliter des vorbereiteten SENP one zu jeder Vertiefung, wodurch das Endvolumen 80 Mikroliter beträgt. Stellen Sie die Platte unverzüglich in das Fluorimeter und beginnen Sie mit den Fluoreszenzmessungen gemäß dem Durchlauf. Analysieren Sie die Fluoreszenzdaten mithilfe der quantitativen FRET-Analysemethode, die im nächsten Abschnitt gezeigt wird.Die grundlegende Idee dieser Technologie besteht darin, das absolute Donor-Signal mit der Verdauung zu korrelieren. Um das absolute Donor-Signal zu erhalten, müssen wir die direkten Beiträge von Donor und Akzeptor von der gesamten Fluoreszenzemission bei den Emissionswellenlängen des Akzeptors ausschließen.Die direkten Beiträge des Donors und des Akzeptors werden jeweils anhand der Korrelationskoeffizienten-Faktoren alpha und beta des Donors und der Akzeptoren berechnet. In diesem Abschnitt des Videos wird detailliert beschrieben, wie die Berechnungen durchgeführt werden. Um die Kinetik der Substratverdauung durch SENP1 zu analysieren, verwenden Sie die Software GraphPad Prism 5. Öffnen Sie zunächst die exportierte TXT-Datei in Excel, nachdem Sie die Hintergrundfluoreszenz der Platte subtrahiert haben.Die Konzentration des verdauten Substrats zu verschiedenen Zeitpunkten wird anhand von PrepU-Formulierungen berechnet, wenn diese mit Licht der Wellenlänge 414 Nanometer angeregt werden. Die gesamte Fluoreszenzemission von spet pre sumo one ype bei 530 Nanometern kann aus drei Quellen stammen: der absoluten, durch FRET induzierten Y pets-Emission, der cype-Direktemission und der wpe-Direktemission. In dieser Gleichung steht FL fünf 30 Schrägstrich vier 14 für die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern, wenn bei 414 Nanometern angeregt wird, und FL fret steht für das absolute FRET-Signal.FL Spet Con ist die direkte Emission von Spet. Bei Anregung bei 414 Nanometern und FL Ype Con ist die direkte Emission von Ype. Bei Anregung bei 414 Nanometern ist die direkte Emission von Spet bei 530 Nanometern proportional zu seiner Emission bei 475 Nanometern.Wenn bei 414 Nanometern mit einem konstanten Verhältnis von Alpha angeregt wird, ist die direkte Emission von YA bei 530 Nanometern unter Anregung bei 414 Nanometern proportional zu seiner Emission bei 530 Nanometern. Wenn bei 475 Nanometern mit einem konstanten Verhältnis von Beta angeregt wird, nachdem spet pre sumo one ype durch SENP one verdaut wurde und bei 414 Nanometern angeregt wird, nimmt die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern ab, kann jedoch weiterhin wie hier in drei Teile unterteilt werden.FL Prime fünf 30 Schrägstrich vier 14 ist die gesamte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern nach der Verdauung. Bei Anregung bei 414 ist FL Prime FRET das verbleibende absolute FRET-Signal und FL Prime SPET 4 75 Schrägstrich vier 14 ist die SPET-Emission bei 475 Nanometern nach der Verdauung bei Anregung bei 414 Nanometern. Die Emission stammt aus zwei Teilen: unverdautem Cype, Pre-Sumo, einem Ype, und verdautem Cype Sumo eins.Ein FL Y PET fünf 30 Schrägstrich 4 75 ist die YPE-Emission bei Anregung bei 475 Nanometern, die konstant bleibt, unabhängig davon, ob CYPE Pre-SUMO1 YPE nach der Spaltung durch SENP1 gespalten wurde oder nicht. Die verbleibende FRET-Emission wird durch diese Gleichung dargestellt, wobei C die Gesamtkonzentration von CYPE Pre-SUMO1 YPE und X die Konzentration des gespaltenen CYPE Pre-SUMO1 YA ist. Durch Kombination aller Elemente ergibt sich die detektierte Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern unter Anregung bei 414 Nanometern gemäß dieser Gleichung für den FRET-basierten Protease-Assay zur enzymkinetischen Untersuchung, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit mit der Änderung der Substratmenge korreliert, während die Produktkonzentration exponentiell von null anwächst.Wenn T gleich null ist, wie hier gezeigt, gibt S₀ die ursprüngliche Substratkonzentration bei T gleich null an. Die anfängliche Geschwindigkeit ist die Umwandlung von Prä-Sumo durch SENP.Man kann dies bestimmen, indem man die Änderungen des Fluoreszenzsignals bei 475 und 530 Nanometern während des Prozesses überwacht. Wie hier gezeigt, war die Geschwindigkeit der Reifung von Prä-Sumo1 substratabhängig, was darauf hindeutet, dass die katalytische Domäne von SENP1 eine hervorragende Aktivität für die Reifung von Prä-Sumo1 aufweist. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mithilfe derselben Analyse bei verschiedenen Substratkonzentrationen berechnet.Das Verhältnis von KCAT zu KM wird allgemein verwendet, um die Effizienzen verschiedener Enzyme mit einem Substrat oder eines bestimmten Enzyms mit verschiedenen Substraten zu vergleichen. KM und Vmax können aus der McKayla-Cementin-Gleichung erhalten werden, indem die verschiedenen Anfangsgeschwindigkeiten, die den unterschiedlichen Konzentrationen von cype entsprechen, aufgetragen werden. Unter Annahme eines YA-kcat-Werts wurde dieser mithilfe der Gleichung ermittelt.Entsprechend der obigen Analyse betrug das berechnete KM 0,21 ± 0,4 µM. Der kcat-Wert lag bei 6,90 ± 0,28 s⁻¹ und das kcat/KM-Verhältnis bei 3,2 ± 0,55 × 10⁷ M⁻¹s⁻¹. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die kinetischen Parameter einer Protease mithilfe eines neuartigen, quantitativen Fettsäure-Assays in einer einzigen, echtzeitnahen Messung bestimmt.Eine andere Methode, wie beispielsweise die Produktinhibierung oder die Charakterisierung von Inhibitoren, kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie beispielsweise den tatsächlichen, scheinbaren KM-Wert oder die Inhibitorkonstante K. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Proteine den Weg, um eine präzise Genetik sowie das Verständnis der an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligten Proteine in optischen Sensoren zu erforschen. Unmittelbare Diagnose und Arzneimittelforschung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video beschreibt den zeitaufgelösten Förster-Resonanzenergietransfer oder TR-FRET-Assay zur Bestimmung der endogenen Proteinphosphorylierung mit Hilfe von Donor- und Akzeptorfluorophoren, die auf Antikörpern markiert sind, die für ein Testprotein spezifisch sind. Diese Technik wurde entwickelt, um die Phosphorylierung von Testproteinen in Zelllysaten zu messen.

Zeitaufgelöster Forster-Resonanz-Energietransfer zur Überwachung der Proteinphosphorylierung in Zellen

Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.

Überwachung der NeutrophilenElastase- und Cathepsin-G-Aktivität in menschlichen Sputumproben

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Lernen Sie eine quantitative FRET-Analyse zur Bestimmung von SENP1-Protease-Kinetiken mit pre-SUMO1-Substraten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Messung kinetischer Parameter für biochemische Forschung.

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

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