Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, neuronale Rezeptoren zu visualisieren, wie sie in kultivierte primäre Mausneuronen in die Plasmamembran eingefügt werden. Zu diesem Zweck werden Maus-GL aus der Großhirnrinde von embryonalen oder neonatalen Mäusen gewonnen und auf semipermeablen, mit Kollagen beschichteten Kultureinsätzen gezüchtet. Die Gliakulturen werden über primären embryonalen Hippocampus-Neuronen auf Deckgläsern aufgehängt.

Nach siebentägiger Konditionierung werden die Neuronen mit einem superekliptikalen Fluor-markierten Dopamin-D-Zwei-Rezeptor transfiziert. Der markierte Rezeptor lokalisiert an intrazellulären Vesikel, bleibt aber in der sauren Umgebung der Vesikel nicht fluoreszierend. Wenn das Vesikel jedoch mit der Plasmamembran verschmilzt, wird das Florin dem neutralen pH-Wert der extrazellulären Umgebung ausgesetzt und fluoresziert hell, was eine Detektion durch Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ermöglicht.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Membranproteintransports zu beantworten, indem sie es uns ermöglicht, den Transport von Membranproteinen zu visualisieren, die mit Fluor markiert werden können, wie z. B. Glutamatrezeptoren und gpro-gekoppelte Rezeptoren. Um das Verfahren heute gemeinsam mit mir zu demonstrieren, werden wir trocken züchten und, und wir ein, zwei andere Mitglieder unserer Forschungsgruppe Am Tag vor der Präparierung werden T 75 Kolben mit Kollagenlösung aufstellen, die Kolben aufrichten und über Nacht trocknen lassen. Am Tag der Gliakultur erwärmen Sie das Gliamedium nach der Euthanasation mindestens 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und präparieren Sie die Großhirnrinde von embryonalen oder neugeborenen Mäusen unter einem Präpariermikroskop.

Legen Sie die entnommenen Kortexe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das mit Eis, Kälte, künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit oder einem Liquor gefüllt ist. Entfernen Sie als Nächstes alle bis auf zwei Milliliter des A-Liquors und fügen Sie 100 Mikroliter Pepanlösung und 20 Mikroliter 1%DNAs hinzu. Legen Sie den Schlauch in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und lassen Sie das Gewebe 20 Minuten lang verdauen.

Nach der Verdauung waschen Sie das Gehirngewebe sorgfältig, indem Sie die Propanlösung vorsichtig entfernen und 10 Milliliter vorwarmes Gliamedium hinzufügen. Dann darauf achten, dass das Gewebe nicht gestört wird. Entfernen Sie so viel Gliamedium wie möglich.

Geben Sie zwei Milliliter frisches Gliamedium hinzu und verwenden Sie ein feuerpoliertes Glas an der Pipette vorbei, bis das Gewebe nicht mehr sichtbar ist. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, sobald das Gewebe vollständig dissoziiert ist. Fügen Sie weitere acht Milliliter frisches Gliamedium hinzu und pipettieren Sie die Suspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb.

Sammeln Sie den Durchfluss in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Die dissoziierten Zellen von zwei bis drei Embryonen werden in einen mit Kollagen beschichteten T 75-Kolben überführt und über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator in einem Gewebekultur-Inkubator kultiviert, um das Medium zu aspirieren. Spülen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS.

Geben Sie dann 10 bis 15 Milliliter frisches Gliamedium in jeden Kolben. Inkubieren Sie die Kulturen 10 bis 12 Tage lang und wechseln Sie das Medium alle drei bis vier Tage. Sobald sie zusammenfließen, spülen Sie die Gliazellen mit PBS.

Geben Sie dann fünf Millimeter 0,05%-Trips in den Kolben und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius ablösen. Nach der kurzen Inkubation wird Gliamedium hinzugefügt und eine Pipette hinzugefügt, um das GL vom Boden des Kolbens zu lösen. Die Zellen werden in zwei neue, mit Kollagen beschichtete T 75-Kolben aufgeteilt.

Sobald diese den Konfluenz erreicht haben, anisieren Tryps wie zuvor und säen den Inhalt jedes Kolbens in sechs Vertiefungsplatten mit kollagenbeschichteten Kultureinsätzen. Über zwei Milliliter Gliamediumkultur werden die Zellen für ein bis sieben Tage gelegt. Diese Gliakultur-Inserts werden verwendet, um die neuronalen Kulturen zu konditionieren.

Geben Sie vier Milliliter Beschichtungsmedium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit gereinigten, polylysinbeschichteten Deckgläsern und stellen Sie die Platte über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Dieser Schritt erhöht die Wahrscheinlichkeit eines neuronalen Überlebens, höchstwahrscheinlich durch Entfernung von restlichem Polylysin am nächsten Tag. Entfernen Sie das Beschichtungsmedium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter frische Beschichtung.

Medium, das 2 % des Mediums enthält. Beiblatt B 27 für die Kultur von Hippocampus-Neuronen Unter einem Präpariermikroskop werden die Hippo-Campi aus dem Hirngewebe von vier embryonalen Mäusen E 15 bis 18 präpariert. Legen Sie die Nilpferd-Campi in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem Dissektionspuffer

Als nächstes wird das Striatum aus dem Hirngewebe von drei E 15 bis 18 embryonalen Mäusen präpariert und in ein separates konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem Dissektionspuffer gegeben. Verdauen Sie das Gewebe wie zuvor mit Pepan. Dann mit einem Hämozytometer.

Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in jeder neuronalen Suspension und jedem Samen. Jeweils mit 0,4 mal 10 Zellen abdecken und über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator kultivieren. Um die Gliakultureinsätze für die Konditionierung der neuronalen Kulturen vorzubereiten, aspirieren Sie das Medium aus den Gliakultureinsätzen und der Platte und ersetzen Sie sie jeweils durch zwei Milliliter frische Beschichtung.

Medium Am nächsten Tag legen Sie die Deckgläser mit den Neuronen in jede Vertiefung der Schale unter die Gliakultureinsätze. Inkubieren Sie alle drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches, vorgewärmtes Medium, das B 27 enthält, bis es für die Transfektion und bildgebende Experimente bereit ist.

Neuronen werden am siebten Tag transfiziert und am achten Tag der Kultur abgebildet. Eine konsistente neuronale Kultur ist der Schlüssel zu erfolgreichen Live-Imaging-Experimenten. Diese Abbildung zeigt Maus-Hippocampus-Neuronen, die mit diesem Protokoll von 11 Tagen in vitro bis 18 Tagen in vitro kultiviert wurden.

Aus den Bildern geht hervor, dass die Neuronen umfangreiche Prozesse entwickelt haben und dass die dendritischen Fortsätze dicht mit dendritischen Dornen bedeckt sind. Hinweise darauf, dass diese Neuronen in Kultur für jede neuronale Kultur gesund sind. Kombinierte zwei Mikroliter Lipektomie im Jahr 2001 Mikrogramm DNA und kodierte den Dopamin-D-Zwei-Rezeptor, der mit Super-Ekliptikum Florin markiert ist.

Mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation wird ein Milliliter des Mediums von unten und ein Milliliter von der Innenseite jedes Gliakultureinsatzes in dasselbe konische Röhrchen überführt. Geben Sie dann das gleiche Volumen des Futtermediums mit B 27 in das eingesparte Medium und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Dieses Medium wird für die neuronale Kultur nach der Transfektion nach der 20-minütigen mittleren DNA-Inkubation mit Lippeneffekt für einen Moment verwendet. Entfernen Sie die Gliakultureinsätze von den Sechs-Well-Platten. Fügen Sie die 200-Mikroliter-Lipektomie-DNA-Mischung zu jedem Deckglas mit Neuronen hinzu.

Vermeiden Sie die Bildung von Blasen unter der Membran der Kultur. Setzen Sie die Gliakultureinsätze wieder ein und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Gliaeinsätze wieder und aspirieren Sie die Transfektionslösung aus jeder Vertiefung, fügen Sie dann die zwei Milliliter Medium hinzu, die zuvor in den Neuronen gespeichert wurden, und ersetzen Sie die Gliakultureinsätze.

Entfernen Sie abschließend das Gliamedium von jedem Einsatz und fügen Sie jeder Kultur zwei Milliliter des gespeicherten Mediums hinzu. Die Zellen für weitere 24 bis 72 Stunden, um die Expression der transfizierten CD NA zu ermöglichen. Das TIRF-Bildgebungssystem, das in diesem Video verwendet wird, ist ein speziell aufgebauter Aufbau mit einem 100-Milliwatt-Cyan-Laser zur Anregung und einer elektronenmultiplizierenden ladungsgekoppelten Gerätekamera für einen Detektor 30 Minuten vor Beginn der Bildgebung, der einen Liquor in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmt. Schalten Sie außerdem den Laser, die Kamera und den Heizeinsatz ein und platzieren Sie den Heizeinsatz auf dem Mikroskoptisch.

Legen Sie ein Deckglas mit transfizierten Neuronen in eine Live-Imaging-Kammer und fügen Sie schnell vorgewärmten A-Liquor hinzu. Platzieren Sie die Kammer auf dem Heizeinsatz auf dem Mikroskoptisch im Epi-Fluoreszenz-Bildgebungsmodus und identifizieren Sie die transfizierten Neuronen. Im TIRF-Bildgebungsmodus bleichen Sie dann die Neuronen eine Minute lang photoblondieren, um bereits vorhandene Fluorfluoreszenz auf der Plasmamembran zu eliminieren.

Stellen Sie als Nächstes die Verstärkungseinstellung des Elektronenvervielfachers an der E-M-C-C-D-Kamera auf Maximum und beginnen Sie eine Minute lang mit der Aufnahme von Bildern bei 10 Hertz. Jede Aufzeichnung enthält 600 Bilder, sobald die gesamte Bildgebung abgeschlossen ist. Analysieren Sie die Daten mit Bild J, um die Membraninsertion des Dopamin-D-Zwei-Rezeptors zu bestimmen.

Ein mittelstacheliges Neuron der Maus wurde mit Super-Ekliptik transfiziert. Florin markierte Dopamin D mit zwei Rezeptoren PDR D zwei Live-TIRF-Bildgebung wurde dann durchgeführt, bei der 600 Bilder mit einer Rate von einem Bild alle 100 Millisekunden aufgenommen wurden. Dieses Bild zeigt die maximale Intensitätsprojektion der Zeitrafferaufnahme: Die weiße Pfeilspitze zeigt an, wo einzelne Vesikel, die den pH-Wert DD zwei enthalten, mit der Plasmamembran verschmolzen sind.

Dieses Bild zeigt die YT-Projektion mit maximaler Intensität, bei der der XYT-Stapel um 90 Grad um die Y-Achse gedreht wird und das maximale Pixel auf jeder X-Achsenlinie auf ein einzelnes Pixel der Y-Achse projiziert wird. Um Informationen über den zeitlichen Ablauf der Insertion zu erhalten, zeigen diese Daten, dass diese Methode erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Regulation der Plasmamembraninsertion von Rezeptoren in kultivierten Mausneuronen nach ihrer Entwicklung zu untersuchen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet des neuronalen Rezeptortransports, um die Regulation anderer Rezeptoren, Kanäle und Transporter der Neurono-Plasmamembran zu erforschen.