Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neuronale Rezeptoren während ihres Einbaus in die Plasmamembran in primären Mausneuronen in Kultur sichtbar zu machen. Dazu werden Maus-GL aus der Großhirnrinde embryonaler oder neugeborener Mäuse gewonnen und auf semipermeablen, kollagenbeschichteten Kulturscheiben kultiviert. Die Gliazellkulturen werden über primären embryonalen Hippocampus-Neuronen auf Deckgläsern angeordnet.

Anschließend werden die Neuronen nach sieben Tagen der Differenzierung mit einem super-euklitischen Fluoreszenzmarkierten Dopamin-D2-Rezeptor transfiziert. Der markierte Rezeptor lokalisiert sich in intrazellulären Vesikeln, bleibt jedoch aufgrund des sauren Milieus innerhalb der Vesikel nicht fluoreszent. Wenn das Vesikel jedoch mit der Plasmamembran fusioniert, wird der Fluoreszenzfarbstoff der neutralen pH-Umgebung des extrazellulären Raums ausgesetzt und fluoresziert intensiv, wodurch eine Detektion mittels Total-Internal-Reflection-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht wird.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich des Membranproteintargetings beantworten, indem der Transport beliebiger Membranproteine sichtbar gemacht werden kann, die mit Fluor markiert werden können, wie beispielsweise Glutamatrezeptoren und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Die Demonstration des Verfahrens führe ich heute gemeinsam mit Breeding Dry und, und wir, zwei weiteren Mitgliedern unserer Forschungsgruppe durch. Am Tag vor dem Präparationsverfahren T-75-Flaschen mit Kollagenlösung beschichten, die Flaschen aufrecht stellen und über Nacht austrocknen lassen. Am Tag der Gliazellkultur das Glialmedium mindestens 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad erwärmen; nach der Tötung die zerebralen Kortizes von embryonalen oder neonatalen Mäusen unter einem Präparationsmikroskop dissezieren.

Legen Sie die entnommenen Kortizes in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das mit Eis und kalter, künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit oder A CSF gefüllt ist. Entfernen Sie anschließend die gesamte A CSF bis auf zwei Milliliter und geben Sie 100 Mikroliter Pepan-Lösung und 20 Mikroliter 1 % DNase I hinzu. Stellen Sie das Gefäß in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und lassen Sie das Gewebe 20 Minuten lang verdauen.

Nach der Verdauung das Gehirngewebe vorsichtig waschen, indem man die Propanlösung sorgfältig entfernt und 10 Milliliter vorgewärmtes Glialmedium hinzugibt. Dabei darauf achten, das Gewebe nicht zu stören. So viel wie möglich vom Glialmedium entfernen.

Gebe zwei Milliliter frisches Glia-Medium hinzu und pipettiere mit einer flammenglätteten Glas-Pasteur-Pipette, bis das Gewebe nicht mehr sichtbar ist. Vermeide das Bilden von Blasen, sobald das Gewebe vollständig dissoziiert ist. Gib weitere acht Milliliter frisches Glia-Medium hinzu und pipettiere die Suspension durch einen 70 µm Zellfilter.

Sammlen Sie das Durchflussvolumen in einem 50-Milliliter-Konischgefäß. Überführen Sie die dissoziierten Zellen von zwei bis drei Embryonen in einen kollagenbeschichteten T-75-Flasche und kultivieren Sie diese über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator. Am nächsten Tag aspirationsieren Sie das Medium. Spülen Sie die Zellen einmal mit 10 Milliliter PBS ab.

Gegeben Sie dann 10 bis 15 Milliliter frisches Gliazell-Medium pro Flasche hinzu. Inkubieren Sie die Kulturen 10 bis 12 Tage lang und wechseln Sie das Medium alle drei bis vier Tage. Spülen Sie die Gliazellen nach Erreichen der Konfluenz mit PBS.

Anschießend fünf Milliliter 0,05 %iger Trypsin-Lösung zum Kolben hinzufügen und die Zellen fünf Minuten bei 37 Grad Celsius ablösen lassen. Nach der kurzen Inkubation neuronales Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig auf- und abpipettieren, um die GL-Zellen vom Boden des Kolbens zu lösen. Die Zellen auf zwei neue, mit Kollagen beschichtete T-75-Kolben aufteilen.

Wenn diese Konfluenz erreicht haben, werden sie wie zuvor mit Trypsin behandelt und der Inhalt jedes Kolbens in sechswellige Platten mit kollagenbeschichteten Kulturscheiben ausgesät. Die Zellen werden über zwei Milliliter Glialmediumkultur platziert und für ein bis sieben Tage kultiviert. Diese Glialkultur-Scheiben dienen zur Konditionierung der neuronalen Kulturen.

Gebe vier Milliliter Plattiermedium in jede Vertiefung einer sechslochigen Platte, die gereinigte, mit Polylysin beschichtete Deckgläser enthält, und stelle die Platte über Nacht in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Dieser Schritt erhöht wahrscheinlich die Überlebenswahrscheinlichkeit der Neuronen, indem am folgenden Tag überschüssiges Polylysin entfernt wird. Entferne das Plattiermedium und ersetze es durch zwei Milliliter frisches Plattiermedium.

Medium, das 2 % des Mediums enthält. Ergänzung B27 zur Kultur von hippocampalen Neuronen. Unter einem Stereomikroskop die Hippocampi aus dem Gehirngewebe von vier embryonalen Mäusen im Alter von E15 bis E18 isolieren. Die Hippocampi in ein 15-Milliliter-Konischgefäß mit eiskaltem Dissektionspuffer geben.

Als Nächstes wird der Striatum aus dem Gehirngewebe von drei embryonalen Mäusen im Alter von E 15 bis 18 isoliert und in ein separates kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem Puffer für die Gewebeisolation gegeben. Das Gewebe wird wie zuvor mit Pepanase digeriert. Anschließend mithilfe eines Hämozytometers.

Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in jeder neuronalen Suspension und säen Sie. Jede Deckplatte mit 0,4 × 10⁶ Zellen und kultivieren Sie sie über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C. Um die gliale Kulturinserts zur Konditionierung der neuronalen Kulturen vorzubereiten, aspirieren Sie das Medium aus den glialen Kulturinserts und dem Probenträger und ersetzen Sie es jeweils durch zwei Milliliter frisches Aufbrutschmedium.

Medium am nächsten Tag die Deckgläser mit den Neuronen in jede Vertiefung der Schale unterhalb der Gliazell-Kultur-Inlays platzieren. Die Inkubation bei 37 Grad Celsius fortsetzen und alle drei bis vier Tage die Hälfte des Mediums durch frisches, vorgewärmtes Fütterungsmedium, das B 27 enthält, ersetzen, bis sie für Transfektion und Bildgebungsexperimente bereit sind.

Die Neuronen werden am siebten Tag transfiziert und am achten Tag der Kultur abgebildet. Eine konsistente neuronale Kultur ist der Schlüssel für erfolgreiche Live-Bildgebungsexperimente. Diese Abbildung zeigt maushippocampale Neuronen, die gemäß diesem Protokoll von 11 bis 18 Tagen in vitro kultiviert wurden.

Aus den Bildern ist ersichtlich, dass die Neurone umfangreiche Fortsätze entwickelt haben und dass die dendritischen Fortsätze dicht mit dendritischen Dornen besiedelt sind. Hinweise darauf, dass diese Neurone in jeder neuronalen Kultur gesund sind. Kombinieren Sie zwei Mikroliter Lipofektamin mit 2001 Mikrogramm DNA und kodieren den Dopamin-D2-Rezeptor, markiert mit Super-ecliptischem Florin.

Mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation jeweils ein Milliliter Medium von unterhalb und ein Milliliter von innerhalb jedes glialen Kultur-Inserts entnehmen und in denselben kegelförmigen Reagenzglas überführen. Anschließend das gleiche Volumen an Fütterungsmedium mit B 27 zum aufbewahrten Medium geben und bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Dieses Medium wird nach der 20-minütigen Lipofektionswirkung und der kurzzeitigen DNA-Inkubation für die neuronale Kultur nach der Transfektion verwendet. Entfernen Sie die Kulturscheiben mit Gliazellen aus den Sechskammerschalen. Geben Sie die 200 µL große Lipofektions-DNA-Mischung auf jeden Deckglaser mit Neuronen.

Vermeiden Sie die Bildung von Blasen unter der Membran der Kultur. Ersetzen Sie die Gliazell-Kulturinserts und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Gliazell-Inserts erneut, saugen Sie die Transfektionslösung aus jedem Well ab und geben Sie dann die zuvor aufbewahrten zwei Milliliter Medium zu den Neuronen hinzu. Setzen Sie anschließend die Gliazell-Kulturinserts wieder ein.

Entfernen Sie abschließend das gliale Medium von jedem Insert und geben Sie zwei Milliliter des aufbewahrten Mediums zu jeder Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 bis 72 Stunden, um die Expression der transfizierten CD NA zu ermöglichen. Das in diesem Video verwendete TIRF-Abbildungs-System ist eine speziell angefertigte Anlage mit einem 100-Milliwatt-Cyanlaser zur Anregung und einer elektronenvervielfachenden CCD-Kamera als Detektor. Erwärmen Sie ACSF 30 Minuten vor Beginn der Bildaufnahme in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie außerdem den Laser, die Kamera und den Heizeinsatz ein und platzieren Sie den Heizeinsatz auf dem Mikroskop-Objekttisch.

Legen Sie einen Deckgläser mit transfizierten Neuronen in eine Live-Bildgebungskammer und geben Sie schnell vorgewärmtes A-CSF hinzu. Stellen Sie die Kammer auf den Heizeinsatz des Mikroskopstages unter epifluoreszierender Bildgebungsmode, identifizieren Sie die transfizierten Neuronen. Wechseln Sie dann in den TIRF-Bildgebungsmode und bleichen Sie die Neuronen eine Minute lang aus, um jegliche vorhandene Fluoreszenz von Fluoreszenzfarbstoffen auf der Plasmamembran zu eliminieren.

Als Nächstes stellen Sie die Verstärkungseinstellung des Elektronenmultiplikators an der E-M-C-C-D-Kamera auf Maximum ein und nehmen eine Minute lang Bilder mit 10 Hertz auf. Jede Aufnahme enthält nach Abschluss aller Bildaufnahmen 600 Bilder. Analysieren Sie die Daten mit Image J, um die Membraneinlagerung des Dopamin-D2-Rezeptors zu bestimmen.

Ein mittelgroßes, stark verzweigtes Neuron der Maus wurde mit Super-ecliptic-PH-Fluoreszenzprotein und fluoreszenzmarkiertem Dopamin-D2-Rezeptor (DAR-D2) transfiziert. Anschließend wurde eine Live-TIRF-Aufnahme durchgeführt, bei der 600 Bilder mit einer Aufnahmerate von einem Bild alle 100 Millisekunden aufgenommen wurden. Dieses Bild zeigt die Projektion der maximalen Intensität der Zeitrafferaufnahme, wobei die weißen Pfeilspitzen die Stellen anzeigen, an denen einzelne Vesikel, die pH-DD2 enthalten, mit der Plasmamembran fusioniert sind.

Diese Aufnahme zeigt die YT-Maximalintensitätsprojektion, bei der der XYT-Stack um 90 Grad um die Y-Achse gedreht wird und das maximale Pixel auf jeder X-Achsenlinie auf ein einzelnes Pixel der Y-Achse projiziert wird. Um Informationen über den zeitlichen Verlauf der Einlagerung zu erhalten, zeigen diese Daten, dass diese Methode erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Regulation der Einlagerung von Rezeptoren in die Plasmamembran kultivierter Mausneuronen nach ihrer Entwicklung zu untersuchen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des neuronalen Rezeptortransports, um die Regulationen anderer neuronaler Plasmamembranrezeptoren, Kanäle und Transporter zu erforschen.