Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, poidverwandte neuronale Proteine aus kultivierten Neuronen mit einem einfachen und anpassungsfähigen biochemischen Assay zu isolieren und nachzuweisen. Dies wird durch Extraktion und Immobilisierung des Zielproteins in Gegenwart von Ethyl oder NEM erreicht, um die Blockierung aller freien Thiolgruppen sicherzustellen. Der zweite Schritt besteht darin, das immobilisierte Zielprotein mit Hydroxylmittel oder Schinken zu behandeln, um die Thioesterbindung zwischen dem palmierten Cysteinrest und dem Palmitatmolekül zu spalten.

Dadurch wird die Gruppe im Palmat-Cystin-Stil frei und steht im dritten Schritt für die Beschriftung zur Verfügung. Das immobilisierte Zielprotein wird mit Biotin B-M-C-C-A-dateispezifisches Molekül inkubiert, das mit Biotin markiert ist, dieses Biotin elisiert und markiert die Thile-Gruppe, die ursprünglich pyl war. Der letzte Schritt besteht darin, den Pationsgrad des Zielproteins durch SDS-Seite und Western Blotting für Strp Aden zu bestimmen.

Letztendlich wird der IP A BE-Assay verwendet, um den Gehalt des Lipidpalmitats nachzuweisen, das reversibel an ein neuronales Zielprotein gebunden ist, und kann auch subtile Veränderungen in Zielproteinen nachweisen. Sättigungsstufen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Nachweis von Proteinen, der Handflächenverstümmelung mittels metabolischer Markierung mit dem Merkmal A Palmat besteht darin, dass der Acylbiotin-Austauschassay empfindlicher und weniger zeitaufwändig ist.

Der A BE-Assay ermöglicht auch eine quantitativere Abschätzung der Handflächenverstümmelung und eignet sich optimal zum Nachweis kleiner Veränderungen im Ausmaß der Handflächenverstümmelung. Obwohl diese Methode Einblicke in die Identifizierung von palmierten Proteinen und kultivierten Hippocampus-Neuronen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie primäre neuronale Kulturen aus anderen Gehirnregionen, heterologe Zelllinien und sogar Primärgewebe angewendet werden. Um mit der Extraktion des Zielproteins aus kultivierten primären Hippocampus-Neuronen zu beginnen, bereiten Sie den Lysepuffer und die NEM-Lösung vor, wie in dem schriftlichen Verfahren zu diesem Video beschrieben.

Kombinieren Sie anschließend den Lysepuffer und die NEM-Lösung, indem Sie 0,5 Milliliter zweimolare NEM-Lösung in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Geben Sie 20 Milliliter Lysepuffer darüber. Fügen Sie immer zuerst die NEM-Ethanollösung und dann den Lysepuffer hinzu, um die beiden in einem vier Grad Celsius kalten Raum richtig zu mischen, legen Sie die Mischung schnell auf eine Wippplattform, um sie fünf Minuten lang vollständig zu mischen.

Entfernen Sie kultivierte primäre Hippocampus-Neuronen der Ratte aus dem Inkubator Anweisungen zum Kulturen. Die Neuronen sind im Text zu finden, nachdem die kultivierten Neuronen auf Eis gelegt wurden. Entfernen Sie vorsichtig das Mobilfunkmedium.

Waschen Sie die Neuronen zweimal vorsichtig mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter Lysepuffer plus 50 millimolare NEM in die erste Vertiefung der Hippocampus-Neuronen und kratzen Sie die Zellen mit einem Einweg-Zellheber ab. Sammeln Sie das Zelllysat und entladen Sie das Lysat in die nächste Vertiefung dieser Gruppe.

Kratzen Sie die Zellen innerhalb der zweiten Vertiefung mit dem Zellheber ab. Sammeln Sie und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit einer dritten Vertiefung. Um das Lysat weiter zu konzentrieren, sammeln Sie das Zelllysat in einem vorgekühlten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie 100 Mikroliter Lysepuffer plus 50 millimolare NEM in die erste Vertiefung und wiederholen Sie den Schweißabstreifvorgang, um das verbleibende Zelllysat aufzufangen. Geben Sie das gesamte Zelllysat fünf- bis sechsmal durch eine 26 1/2 Gauge-Spritze, um die mechanische Lyse zu unterstützen. Achten Sie darauf, keine Blasen in die Lösung zu blasen.

Mutieren Sie das Zelllysat nach der Zentrifugation mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie das geklärte Zelllysat in einem neuen, vorgekühlten 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie das demonstrierte Ernteprotokoll für alle Zellgruppen.

Messen Sie die Proteinkonzentration in allen Lysatproben mit dem BCA-Assay. Gemäß den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren Sie das Volumen aller Lysatproben aus Zellgruppen so, dass es genau das gleiche Protein mit einem empfohlenen Minimum von 500 Mikrogramm enthält.

Füllen Sie alle Proben mit Lysepuffer plus 50 Millimolar NEM auf 500 Mikroliter Gesamtvolumen auf. Geben Sie anschließend ein bis fünf Mikrogramm Primärantikörper, der gegen das Zielprotein gerichtet ist, zu jeder Lysatprobe. Mutieren Sie den Antikörper und lysieren Sie gemischte Proben über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Sie ein Zielprotein ausfällen und immobilisieren.

Bereiten Sie eine 50%ige Aufschlämmung mit Protein A oder Protein G beschichteten SRO-Geschwindigkeiten vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Als letzten Schritt wird jeder Antikörperlysatprobe ein gleiches Volumen von 50 % Aufschlämmung zugesetzt und mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mutiert. Bei der Durchführung von ael sind der richtige pH-Wert und die richtige Temperatur aller Puffer und Reagenzien sowie deren Frische entscheidend.

Um ein erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Beginnen Sie die Teilung des Schinkens mit der Vorbereitung einer Reihe von Röhrchen mit Lysepuffer unterschiedlicher pH-Werte. Der pH-Wert ist für diese Schritte sehr wichtig und sollte immer angepasst werden.

Bereiten Sie mit einem pH-Messgerät pro Probe zwei Milliliter Lysepuffer pH 7,2 und 0,5 Milliliter stringenten Puffer vor, der in Lysepuffer hergestellt wurde. Bereiten Sie außerdem 0,5 Milliliter Lysepuffer plus 10 Millimolar NEM pro Probe vor. Fügen Sie allen Lysepuffern PMSF- und Proteasehemmer-Tabletten hinzu.

Hydroxylmittel oder Schinken wird verwendet, um die Thioesterbindung zwischen dem palmierten Cystein und der Palmitatfettsäure zu spalten. Dies ist wichtig, um die palmierte Cystein-Stilgruppe freizugeben und für die Markierung mit Biotin verfügbar zu machen. Das Weglassen der Schinkenspaltung kann daher als sinnvolle Negativkontrolle dienen.

Bereiten Sie nach der Inkubation des Antikörpers mit dem Zelllysat zusätzliche 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor, die als Minusschinkenkontrolle gekennzeichnet sind. Zentrifugieren Sie dann mit den Kügelchen alle Probenkügelchen vorsichtig bei 0,5 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius, wobei die Röhrchen auf Eis gestellt werden. Entfernen Sie den Überstand und die Wiederbelebung, suspendieren Sie die Kügelchen in 600 Mikrolitern Lysepuffer plus 10 Millimolar NEM.

Nach dem Suspendieren aller Probenkügelchen durch die Resus werden sofort 200 Mikroliter der Lysatkügelchenaufschlämmung der Proben gesammelt und in das Minusröhrchen der Probe auf Eis abgegeben, wobei 400 Mikroliter der Lysatperlenaufschlämmung jeder Probe im Röhrchen für die Plus-Schinken-Probe verbleiben. Dies soll dem begrenzten Abbau des Zielproteins durch die Schinkenbehandlung Rechnung tragen. Ein Drittel der Kügelchen wird für die Minus-Schinken-Behandlung und die restlichen zwei Drittel für die Plus-Schinken-Behandlung verwendet.

Geben Sie weitere 300 Mikroliter Lysepuffer plus 10 Millimolar NEM in die Minusschinkenprobe. Pipettieren Sie weitere 100 Mikroliter in die Plus-Schinkenprobe, so dass sich in jeder Probe insgesamt 500 Mikroliter befinden. Die Röhrchen werden 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann die Minusschinken- und Plusschinkenproben wie im schriftlichen Verfahren beschrieben gewaschen, nachdem die Probe bei 0,5 Millilitern pro Probe mit Lysepuffer pH 7,2 auf alle Minusschinkenproben

0,5 Milliliter Schinkenpuffer pro Probe zu allen plus Schinkenproben hinzufügen. Anschließend mutieren Sie alle Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nicht länger als eine Stunde nach der Schinkenbehandlung einnehmen.

Acylbiotinaustausch durch Biotin-BMCC-Markierung durchführen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben. Sobald die BMCC-Markierung von Biotin abgeschlossen ist, waschen Sie die Proben vorsichtig, wie im Text beschrieben. Entfernen Sie den Überstand der Endwäsche und belassen Sie die pelletierten Kügelchen in einer Aufschlämmung mit dem restlichen Puffer am Boden des Rohrs.

Tauchen Sie eine Pipette mit einer Spitze mit kleinem Durchmesser durch die Aufschlämmung in den Boden des Röhrchens und sammeln Sie schnell den restlichen Puffer auf. Achten Sie darauf, keine Perlen aufzunehmen. Geben Sie 40 bis 50 Mikroliter von zwei x Probenpuffer plus fünf millimolare DTT zu jeder Probe.

gegebenenfalls. Wirbeln Sie die Kügelchen vor, um sich vollständig mit dem Probenpuffer zu vermischen, und zentrifugieren Sie sofort mit hoher Geschwindigkeit, um alle Kügelchen in einem Pellet zu sammeln, das in Probenpuffer getaucht ist. Nach dem Kochen der Proben und dem erneuten Zentrifugieren wird das gesamte Volumen des entweichenden Proteins im Überstand jeder Probe in eine einzelne Spur innerhalb eines Polyacrylamid-Gels gegeben, das für Western Blotting geeignet ist.

Organisieren Sie auf der SDB-Seite alle Proben so, dass die Minusschinkensteuerung elu und die Plusham-Steuerung elu für eine einzelne Probe unmittelbar nebeneinander ausgeführt werden. Während der SDS-Seite auf die SDS-Seite, die auf die A-P-V-D-F- oder NITROCELLULOSE-Membran übertragen wird, beginnen Sie mit dem Western Blotting mit Waschen und Blockieren, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, bereiten Sie eine Antikörperlösung von TBST plus 0,3 % BSA vor und fügen Sie den Streptavidin HRP-Antikörper hinzu, der zu einem Milligramm pro Milliliter in destilliertem Wasser rekonstituiert wurde. Waschen Sie die Membran einmal 10 Minuten lang in TBST.

Dann inkubieren Sie die Membran in STREPTAVIDIN-Antikörperlösung auf einer Wippplattform entweder eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Membran dreimal in TBST für 10 Minuten auf einer Schaukelplattform. Um das Pationssignal zu detektieren, exponieren Sie die HRP-Lumineszenz mit einem Chemilumineszenz-Substratkit, um die Pationsniveaus auf die Menge des interessierenden Proteins zu normalisieren, die immunpräzipitiert wurde.

Sie die Membran mit Western Blott Stripping Buffer für fünf bis 10 Minuten auf einer Wippplattform bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Western-Blotting-Schritte mit dem primären Antikörper gegen das Protein von Interesse, das ursprünglich für die Immunpräzipitation verwendet wurde. Quantifizieren Sie die Pation des interessierenden Proteins mit Hilfe einer Bildanalysesoftware und normalisieren Sie die Pationsniveaus auf die Menge des immunpräzipitierten Proteins.

Der I-P-A-B-E-Assay weist spezifisch die Pation von Cystinresten entlang von Substratproteinen nach und kann zum Nachweis der Pation von immunpräzipitierten neuronalen Proteinen verwendet werden. Behandlung des immunpräzipitierten neuronalen Proteins mit Schinkenspalten, wobei die Thioesterbindung zwischen Palmitat und Sixtin-Thal-Gruppe einen spezifischen Einbau von Biotin BMCC in die neu verfügbare Dateigruppe ermöglicht, die anschließend mittels Western Blot nachgewiesen werden kann. Der Wegfall der Schinkenspaltung verhindert den Einbau von Biotin BMCC und dient als Negativkontrolle für die spezifische poid Biotin-Hochstimmung der Plus-Schinkenprobe.

Daher sollte die Minus-Schinken-Kontrolle immer neben der Plus-Schinken-Probe für das Western-Blotting auf der SDS-Seite durchgeführt werden. In einem optimierten Experiment kann das Pationssignal des neuronalen Proteins delta Catenin leicht nachgewiesen werden, indem Biotin BMCC in einer Konzentration von einem Mikromolar unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert mit HRP, gegen parallele Minus- und Plusschinkenproben geplottet wurde. Das spezifische Pationssignal für delta Kain erscheint bei seiner vorhergesagten Größe von 160 Kilodalton nur in der Plus-Hand-Stichprobe.

Die Spezifität dieses Signals wurde durch eine erneute Untersuchung auf delta CATENIN mit dem spezifischen Antikörper bestätigt, der ursprünglich zur Immunpräzipitation verwendet wurde, was zu einem Signal in beiden Schinkenbehandlungen bei der gleichen vorhergesagten Größe führte. Die Optimierung des I-P-A-B-E-Assays führt zu einem Western-Blotting-Profil einer Minus-Schinken-Probe, das leicht von der Plus-Schinken-Probe unterscheidbar ist und ein minimales bis kein Pationssignal aufweist. Die Konzentration von Biotin BMCC, die zur Markierung von PALMATED CYSTINEN verwendet wird, erfordert eine sorgfältige Optimierung, und wenn eine übersättigende Konzentration von Biotin BMCC während der A BE-Chemieschritte verwendet wird, werden übermäßige Hintergrund- und unspezifische Signale sichtbar sein.

Die resultierenden gestrippten Avid-in-Western-Blob-Profile unter den Minus- und Plus-Schinkenproben für Delta-Catin- und Palmenverstümmelung erscheinen ähnlich, wenn sie mit vier mikromolaren Biotin-BMCC mit zusätzlichen Hintergrundsignalen in unterschiedlichen Größen behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass unangemessenes Biotin aufgetreten ist. Da Hydroxylamin ein starkes Reduktionsmittel ist, das zu einem begrenzten Abbau des Zielproteins führt, ist es notwendig, die Menge an immunpräzipitiertem Protein, die für Minus- und Plus-Schinkenproben verwendet wird, zu normalisieren. Die Normalisierung erfordert die Verwendung der doppelten Menge an immobilisiertem Zielprotein in der Plus- gegenüber der Minus-Schinkenprobe, was zu nicht unterscheidbaren Western-Blotting-Profilen für das Zielprotein führt, wie sie für Delta-Catenin gezeigt werden.

Wenn jedoch die Menge des immobilisierten Zielproteins zwischen Minus- und Plus-Schinkenproben nicht normalisiert wird, kann das resultierende Western-Blot-Signal für das Zielprotein in der Plus-Schinkenprobe verloren gehen, wie für Delta-Catenin gezeigt, wenn bei beiden Schinkenbehandlungen gleiche Proteinmengen verwendet wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das von Ihnen gewählte neuronale Protein aus kultivierten Hippocampus-Neuronen extrahieren können. Verwenden Sie eine BE-Chemie, um in kürzester Zeit zu erkennen, ob es sich um ein Substrat für die Handflächenverstümmelung handelt, und um dieses Protokoll für die Verwendung in anderen Zelllinien und Geweben anpassen zu können.