Name: Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie die genetische Modifikation von Epithelzellen in embryonalen Maus-Speicheldrüsen mittels adenoviralen Vektoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Verzweigungsmorphogenese ohne transgene Tiere.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Deirdre Nelson für hilfreiche Kommentare und für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DE019244, DE019197 und DE021841 um ML, F32DE02098001 um SJS und C06 RR015464 der University at Albany, SUNY finanziert.

Das Protokoll enthält vier wesentliche Schritte, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Adenovirus Konstruktion und viralen Reinigung sollte vor der Organraub zur Verwendung in der genetischen Transduktion seziert epithelialen Rudimente durchgeführt werden. Alle Standard-BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen sollten bei der Arbeit mit Adenoviren werden. Ein. Maus Embryonale submandibularis (SMG) Ernte und Mikrodissektion <ol><li> Einschläfern timed-schwangeren weiblichen Mäusen (Auszuchtstamm CD-1-oder ICR) mit CO 2 Narkose, durch Genickbruch und Ernte Saiten Maus-Embryonen am embryonalen Tag 13 (E13, 3-5 Epithelknospen) folgenden Verfahren durch den institutionellen IACUC zugelassen, gefolgt Ausschuss. Der Tag der vaginalen Plug Entdeckung wird als E0 bezeichnet. Speicheldrüsen können auch geerntet und auf dem E12 Bühne kultiviert werden, wenn es eine einzige primäre Knospe und Stiel mit Klüften gerade erst anfangenzu initiieren. SMGs vor diesem Zeitpunkt erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen als die hier angegebenen. </li><li> Übertragen Embryos Strings in sterile 10 cm Zellkulturschalen mit 25 ml DMEM / Ham &#39;s F12 Medium (F12) fehlen Phenolrot (Life Technologies) und ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Pen-Strep gefüllt, Life Technologies). </li><li> Mit einem sterilen Skalpell (# 11 Klingen) und Pinzette (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), entfernen Sie die Embryonen aus den Säcken in einem separaten 10 cm Schale mit 25 ml DMEM/F12 + Pen-Strep. </li><li> Sever die Embryos Köpfe mit einer abgewinkelten kurz unterhalb des Unterkiefers. </li><li> Isolieren Sie die unteren Kiefer aus den Köpfen unter einem Stereomikroskop Seziermikroskop mit einem Durchlicht Basis (Nikon SMZ645 oder gleichwertig) mit einem Schnitt unterhalb des Oberkiefers. Legen Sie die Gewebe auf der Oberseite eine zusätzliche Stück Glas anstatt direkt auf dem Glas Bestandteil des Mikroskops. </li><li> Sammeln Sie die unteren Kiefer in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in einem sterilen 35 mm Gewebekulturschale. </li><li> Platzieren eines Unterkiefers Scheibe auf dem Präpariermikroskop Stufe, so dass die Zunge auf der Unterseite der Scheibe ist, aber in Richtung der 12:00-Uhr-Position zeigt. </li><li> Mit einer Seite von zwei gekreuzten Pinzette in einem scissoring Bewegung, entfernen und entsorgen Sie die untere 1/3 rd des Unterkiefers Scheibe. </li><li> Drehen der Scheibe um 90 ° nach rechts (wenn rechtshändige) und, unter Verwendung eines scissoring Schnitt mit der Zange, schneiden den oberen Teil des Unterkiefers Scheibe (ohne Schneiden der Zunge) zur Hälfte in die Scheibe. </li><li> Ziehen Sie die überschüssige Gewebe entfernt und entfernen Sie die Maschinenpistolen unter aussetzen. Es wird eine an jeder Seite in der Nähe der Basis der Zunge liegen. </li><li> Mit einem Paar Pinzette halten das Gewebe durch die Zunge, verwenden Sie die anderen Pinzette, um die SMG necken weg von der Zunge. Wiederholen Sie dies für die anderen Drüse. </li><li> Sammeln Sie die mikrodissezierten Speicheldrüsen in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in eine neue sterile 35 mm Gewebe-Kulturschale. Hinweis: Die größeren submandibularis (3-5 Epithelknospen) zusammen mit dem angeschlossenen kleineren sublingualis (1 Knospe) kultiviert werden können intakt durch Überspringen zu Schritt 4 und Durchführen der Schritte 4,1, 4,3 und 4,4, wie zuvor beschrieben 2,8. </li></ol> 2. SMG Epithelial Rudiment Separation <ol><li> Platz 5 (oder mehr) Speicheldrüsen in einen Glasboden, Durchmesser 50 mm Mikrotiter Schale (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) mit 200 ul balanced salt Hank-Lösung (HBSS fehlt Ca + + oder Mg + +, Life Technologies) mit 0,4% (v / v) Dispase (Life Technologies, cat. Nr. 17105-041) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze vorsichtig absaugen das Dispase-Lösung, ohne die Drüsen. Sofort im 200 ul DMEM/F12 Medium mit 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, mit einer 0,22 um Filter vorsterilisierten), um die Dispase neutralisieren. </li> &lt;li&gt; Unter einem Binokular mit einer Pinzette mit feinen Spitzen (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), sanft trennen den gelösten Mesenchym aus der ganzen SMG Epithelknospen und Kanäle, wobei darauf zu verlassen, das Epithel intakt . </li><li> Pre-wet eine sterile 200 ul Pipettenspitze mit DMEM/F12-BSA Medien und vorsichtig pipettieren Sie die Epithelzellen Rudimente in eine neue 50 mm Durchmesser Mikrowell Schale mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Verwenden Sie ein hochwertiges 200 ul Pipettenspitze mit einem glatten Rand. </li><li> In der Schale, die Mesenchym Stücke enthält, verwerfen alle nicht-mesenchymale Gewebe einschließlich der sublingualen Drüsen und alle freistehenden submandibularis Knospen. </li></ol> 3. Adenoviralen Infektion Epithelial Rudiments <ol><li> Make 200 ul Virusinfektion Medien durch Verdünnen des Adenovirus von Interesse in DMEM/F12 + Pen-Strep und in ein Mikrozentrifugenröhrchen, so dass der Titer der resultierenden Lösung 1x10 8 -10 9 PFUs ist. Dieoptimale Titer für verschiedene Viren erforderlich kann variieren. Es ist wichtig, Cäsiumchlorid (CsCl)-gereinigte virale Zubereitungen zur optimalen Aufnahme Effizienz zu verwenden. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus der Schüssel mit den fünf epithelialen Rudimente. Schnelles Hinzufügen von 200 ul der Infektion Medien, halten die Rudimente nassen zu allen Zeiten. Die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit dem Virus und Entsorgung kontaminierter Pipettenspitzen. Desinfizieren Sie alle Virus-kontaminierten Oberflächen mit 10% Bleichlösung. </li><li> Verschieben Sie die Epithelzellen Rudimente weit voneinander entfernt mit einer Pinzette, um sie nicht zusammenkleben und ihnen zu ermöglichen, um die Unterseite der Platte zu begleichen. Inkubieren Rudimente in viralen Medien für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während der Inkubation, trennen Sie die Ansätze, wenn sie nahe beieinander bewegen. Übermäßige rocking oder Bewegung ermöglicht die Drüsen zu verklumpen. </li><li> Nach der Inkubation, entfernen die viralen-haltigen Medien und entsorgen entsprechend, kümmert sich nicht um die r störenudiments. Fügen Sie 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Wiederholen Sie diesen wash mindestens zwei weitere Male und ersetzen mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep Medien. Diese Waschmittel sind kritisch für alle Viren, die nicht stark mit den Epithelien befestigt zu entfernen und um die Infektion der Mesenchym verhindern. </li><li> Inkubieren epithelialen Rudimente mit 200 ml DMEM/F12, enthaltend 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) für 20 min. Wir finden, dass diese kurze Inkubation in Matrigel die Regression von vorhandenen Klüften minimiert während der anfänglichen Züchtungsperiode, aber dieser Schritt kann entfallen, wenn die Exposition gegenüber Matrigel nicht erwünscht verzichtet werden. </li></ol> 4. Ex vivo Kultur rekombinierte SMGs <ol><li> Legen Sie jedes Rudiment, ein zu einer Zeit, mit einem Pre-wet 200 ul Pipettenspitze auf einem gekerbten (klein geschnitten) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch Membranfilter (Whatman) schwimmt über 200 ul von Kulturmedien ( 5 Rudimente / Filter) in einem Glasboden-Mikrotiterplatte. Die Kulturmedienist: DMEM/F12 + Pen-Strep die 50 ug / ml Transferrin und 150 ug / ml Ascorbinsäure, wie zuvor 2,8 beschrieben. Transferrin ist bekannt, dass das Überleben zu stimulieren und Verzweigung Morphogenese der Speicheldrüse und andere Organe Explantate 9. Zusatz von Ascorbinsäure wurde gezeigt, stimulieren SMG Verzweigung. 10. Es ist bekannt, dass als Cofaktor in vielen Hydroxylierungsreaktionen von Stoffwechselwegen (wie Prolin Hydroxylierung während Kollagen Faserbildung 11) wirken und stimuliert auch Fibronectin und Laminin Produktion in anderen Organexplantaten 12. </li><li> Entfernen Sie so viel Medien auf der Oberseite des Filters wie möglich nach Zugabe jeder Epithelzellen Rudiment. Too much media auf der Oberseite des Filters kann der Filter zu sinken, während weniger Medien macht Platzierung der Rudimente und Mesenchym viel einfacher. Excess Medien können entweder mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette, um die Medien zwischen den Spitzen greifen entfernt werden. </li><li> Ort Mesenchym Stücke stammen from drei vor vier Drüsen auf der Oberseite und / oder um jeden epithelialen Rudiment. Nehmen Sie etwaige zusätzliche Medien, die rund um die Drüsen auf die Bewegung des Mesenchym weg von den Grundlagen zu vermeiden. Mesenchym stammt aus mehr Drüsen ist nicht förderlich, aber weniger kann sich nachteilig auf epithelialen Rudiment Wachstum. </li><li> Inkubieren rekombinierten SMGs in einem befeuchteten Inkubator (95% Luft / 5% CO 2) bei 37 ° C für 48 -72 h, wie gewünscht. </li><li> Erwerben Hellfeld und / oder fluoreszierende Bilder von Live-Drüsen bei 0 h (falls gewünscht), 2 Stunden nach Rekombination und alle 24 Stunden danach auf einer invertierten, aufrecht, oder Stereo-Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera mit einem 4x oder 5x Vergrößerung Ziel ausgestattet erfassen die gesamte rekombinierten Drüse in einem einzelnen Frame Ansicht. Bilder der Speicheldrüse zeigen die besten Kontrast entweder mit dem Hellfeld Einstellung oder die entsprechende Phase Ring platziert einen Teil des Weges in den Strahlengang (das ist nicht voll automatisierte Mikroskope möglich). Standard Phasenkontrast keinet notwendig, da die Drüse ist dick und schafft Kontrast. </li><li> An den gewünschten Zeitpunkten, können rekombinierte SMGs für 20 Minuten mit Fixiermittel Lösung von 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS, enthaltend 5% (w / v) Saccharose (besser zu erhalten internen zellulären Struktur, indem die Zellen in gemacht festgesetzt ein isosmotische Zustand). Anders als 4% PFA, 2% PFA wird bewahren eine signifikante Menge des GFP-Signals, wenn das Fixiermittel vollständig nach der Fixierung entfernt wird. Drüsen können für bis zu speichernden 1 Woche in 1X PBS im Dunkeln bei 4 ° C bis whole mount Immunzytochemie und konfokale Bildgebung durchgeführt, wie zuvor berichtet 3,6,13-15. Idealerweise sollte Immunzytochemie und Bildgebung bald nach Fixierung durchgeführt werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Drüsen kann auch in RIPA-Puffer für SDS-PAGE durch Western-Blotting-Analyse verfolgt, lysiert werden. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die ex vivo epitheliale-mesenchymale Rekombination Technik wurde erstmals für submandibular Speicheldrüsen im Jahr 1981 16 veröffentlicht. Bei diesem Protokoll, wir auf die ursprüngliche Methode erweitern, unter Verwendung adenoviraler Infektion Epithelzelle Genexpression im Kontext eines rekombinierten Drüse manipulieren. Wir zeigen, dass ein Prozentsatz der Epithelzellen mit dem Adenovirus infiziert sind, während der Prozentsatz an Zellen, die infiziert sind, hängt von den Eigenschaften des viralen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium ohne Phenolrot </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin und Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X Lager </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Frieren Sie den einmaligen Gebrauch Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraction V, niedrige Endotoxin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Sollte hohe Titer (1x10 10 pfu / ml) betragen. CsCl gereinigten Viren sind wirksamer als säulengereinigt Viren in diesem Assay. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Verdünnt auf 2% in PBS mit 5% Sucrose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Hergestellt aus 10X Lager </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenol Red </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 Medien. Frieren Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure (Vitamin C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 media.Freeze Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Liste der Reagenzien für SMG Rekombination Protokoll erforderlich. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm sterile Plastikschalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> Stereo Binokular mit Durchlichtbasis </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Jede Stereo Präpariermikroskop können verwendet, das eine Durchlichtbasis werden. </td></tr><tr><td> 35 mm-Gewebekulturschalen </td><td> Falke </td><td> 353001 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> 50 mm Durchmesser Mikrowell Gerichten </td><td> MatTek Konzern </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membranfilter </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm Durchmesser, 0,1 mm Porengröße </td></tr><tr><td> Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Jede Fluoreszenzmikroskop (aufrecht, inverted oder Stereo Präpariermikroskop) kann zum GFP-Expression bei geringer Vergrößerung überwachen mit angeschlossenem digitalen Kamera werden. </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokale Mikroskopie ist notwendig, um detaillierte Zellstrukturen zu sehen. Jede Konfokalmikroskop können verwendet werden. </td></tr><tr><td> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen, Stamm CD-1-oder ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryonen werden am Tag 13 (mit Tag der Plug Entdeckung als Tag 0 bezeichnet) geerntet. </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellgriff # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen inox-Legierung, 0,05 X 0,02 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal für die Ernte Drüsen aus Embryonen </td></tr><tr><td&gt; Dumont Nr. 5 Zangen dumostar Legierung, 0,05 X 0,01 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Feine Spitzen zum Entfernen von Mesenchym aus Epithel erforderlich. Wolframnadeln können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Ausrüstung in SMG Rekombination Protokoll verwendet. </td></tr></tbody></table>

genetic modification und rekombination von speicheldrüsen organkulturen

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching Morphogenese tritt während der Entwicklung vieler Organe und die embryonale Maus submandibularis (SMG) ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der Verzweigung Morphogenese. In der sich entwickelnden SMG beinhaltet dieses Verfahren iterativen Schritten von epithelialen Knospe und Kanal Formation, um letztendlich Anlass zu einem komplexen verzweigtes Netzwerk von Acini und Leitungen, die zu erzeugen und zu modifizieren / transportieren den Speichel bzw. in die Mundhöhle 1 dienen - 3. Das Epithel-assoziierten Basalmembran und Aspekte der mesenchymalen Abteil, einschließlich der Mesenchymzellen, Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix, die von diesen Zellen produziert werden, sind für die Verzweigungsmechanismus, obwohl, wie die zellulären und molekularen Ereignisse koordiniert bleibt kaum verstanden 4 . Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die epithelialen Morphogenese unser Verständnis von Entwicklungsstörungen Mechanismen und bietet einen Einblick in mögliche Regenerationtive Medizin Ansätze. Solche Studien wurden aufgrund des Mangels an effektiven Methoden zur genetischen Manipulation der Speicheldrüse Epithel behindert. Derzeit stellt adenovirale Transduktion die effektivste Methode für die Ausrichtung Epithelzellen in der Erwachsenenbildung Drüsen in vivo 5. Doch in embryonalen Explantate behindert dichten Mesenchym und die Basalmembran umgibt die Epithelzellen viralen Zugang zu den Epithelzellen. Wenn die Mesenchym entfernt wird, kann das Epithel transfiziert mit Adenoviren werden, und wieder aufgenommen werden kann epithelialen Rudimente Verzweigungsmittel Morphogenese in Gegenwart von Matrigel oder Laminin-111 6,7. Mesenchym-free epithelialen Rudiment Wachstum erfordert auch zusätzliche Nahrungsergänzung mit löslichen Wachstumsfaktoren und nicht vollständig rekapitulieren Verzweigung Morphogenese, wie es in intakten Drüsen 8 auftritt. Hier beschreiben wir eine Technik, die adenovirale Transduktion von Epithelzellen und Kultur der transfizierten e erleichtertpithelium mit zugehörigen Mesenchym. Nach Mikrodissektion der embryonalen Maschinenpistolen, Entfernung des Mesenchym und Virusinfektion des Epithels mit einem GFP-haltigen Adenovirus zeigen wir, dass das Epithel sich spontan rekombiniert mit nichtinfizierten Mesenchym rekapituliert intakten SMG glandulären Strukturen und Verzweigungsmittel Morphogenese. Die gentechnisch veränderten epithelialen Zell-Population kann leicht überwacht werden unter Verwendung von Standard Fluoreszenzmikroskopie Methoden, wenn Fluoreszenz-markierten adenovirale Konstrukte verwendet werden. Das Gewebe Rekombination hier beschriebene Verfahren ist derzeit das wirksamste und zugänglich Verfahren zur Transfektion von epithelialen Zellen mit einem Wildtyp-oder mutierten Vektor innerhalb eines komplexen 3D Gewebekonstrukt, das keine Erzeugung transgener Tiere.

Die Strömung der großen experimentellen Schritte ist in 1 skizziert. Ein Beispiel eines intakten SMG, einem isolierten Epithelzellen Rudiment, und seine entsprechende Mesenchym sind in Abbildung 2 gezeigt. Hellfeld Bilder von rekombinierten Maschinenpistolen, die zu unterziehen Verzweigungsmittel Morphogenese bei kultivierten ex vivo für die angegebenen Zeiten, in Abbildung 3 dargestellt fort. Rekombinierte Drüsen für 48 hr exprimieren epitheli...

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierten embryonalen Maus submandibularis (SMGs) mit viralen Gentransfer beschrieben. Diese Methode nutzt die angeborene Fähigkeit der SMG Epithel und Mesenchym spontan nach der Trennung und Infektion von Epithelzellen Rudimente mit adenoviralen Vektoren rekombinieren.

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Expression eines gewünschten Proteins im Epithel der embryonalen submandibulären Speicheldrüse der Maus mit Hilfe adenoviraler Konstrukte zu verändern. Dies wird erreicht, indem die Embryonen am 13. Embryonaltag entnommen und die submandibulären Speicheldrüsen präpariert werden. Als nächstes werden die epithelialen Rudimente vom umgebenden Mesenchym getrennt und in virushaltiger Kultur getränkt.Medien Nach dem Waschen wird das Rudiment in Matrigel-haltigen Medien inkubiert, und wir kombinierten mit drei der Mesenchyme für ex vivo Kultivierungsänderungen in den Zielproteinspiegeln und ihre Wirkung auf die verzweigte Morphogenese können mittels Immunchemie und Standardmikroskopie oder westlicher Blutanalyse analysiert werden. Diese Technik ermöglicht es uns, nur ein Gewebekompartiment in einem komplexen Organ genetisch zu modifizieren und Veränderungen in einem wieder zusammengesetzten ganzen Organ zu überwachen, ohne einen transgenen Organismus zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die Expression eines Wildtyps oder eines dominanten negativen Proteins innerhalb des Epithelkompartiments ermöglicht.Nach den üblichen Verfahren werden zunächst 13 Embryonen in 10-Zentimeter-Schalen mit 25 Millilitern Medium geerntet. Nehmen Sie dann mit einer Pinzette die Embryonen aus ihren Säcken und übertragen Sie die Embryonen in eine 10-Zentimeter-Schale mit 25 Millilitern D-M-E-M-F 12 mit Stiftstrep unter einem Stereoskop mit Durchlichtsockel, positionieren Sie den Embryo auf einem sauberen Stück Glas. Trennen Sie nun die Köpfe des Embryos mit einem abgewinkelten Schnitt knapp unterhalb des Unterkiefers oder Unterkiefers und isolieren Sie die unteren Mandibeln mit einem Schnitt unterhalb des Oberkiefers.Anschließend werden die unteren Mandibeln in drei Milliliter D-M-E-M-F 12 mit Stiftstrep in eine 35 Millimeter große Gewebekulturschale überführt. Lege nun einen Unterkiefer wieder auf die Glasplatte auf dem Tisch und positioniere ihn so, dass die Zunge das Glas berührt und in Richtung 12-Uhr-Position zeigt. Entfernen Sie mit einer Seite von zwei gekreuzten Pinzetten in einer Scherenbewegung das untere Drittel des Unterkiefers und entsorgen Sie es.Drehen Sie dann den Unterkiefer um 90 Grad in Richtung Ihrer dominanten Hand und schneiden Sie mit einer Scherenbewegung durch den oberen Teil des Unterkiefers. Schälen Sie nun das überschüssige Gewebe ab und legen Sie die SMGs unter dem Gewebe frei. Auf jeder Seite befindet sich eine in der Nähe der Basis der Zunge auf jeder Seite.Benutze eine Pinzette, um das Gewebe neben der Zunge festzuhalten, und das andere Paar, um die SMG von der Zunge wegzuziehen. Zu diesem Zeitpunkt können die größere SMG und die angrenzende sublinguale Drüse intakt mit dem umgebenden Mesenchym kultiviert werden. Andernfalls fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort.Beginnen Sie damit, mindestens fünf Speicheldrüsenpflanzen in eine 50-Millimeter-Mikrotiterschale mit Glasboden mit 200 Mikrolitern HBSS plus Diss-Paste zu geben. Inkubieren Sie die Drüsen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend die Diss-Pastenlösung mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig ausziehen, ohne die Drüsen sofort zu stören.Fügen Sie 200 Mikroliter D-M-E-M-F 12 Medium mit BSA hinzu Um die Dispa zu neutralisieren, verwenden Sie eine Pinzette Nummer fünf mit feinen Spitzen, um das gelockerte Mesenchymgewebe mit der sublingualen Drüse vorsichtig von den epithelialen Knospen und Gängen der größeren Unterkieferdrüse zu trennen. Achten Sie darauf, das Epithel so intakt wie möglich zu lassen. Wählen Sie als Nächstes eine hochwertige 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit einem glatten Rand an der Spitze aus D-M-E-M-F 12 BSA-Medien aus.Pipettieren Sie dann die mechyfreien Epithelrudimente vorsichtig in eine neue Mikrotiterschale mit einem Durchmesser von 50 Millimetern, die 200 Mikroliter D-M-E-M-F 12 plus Pen-Streptokokken enthält. Entsorgen Sie schließlich in der Schale, die die Mesenchymstücke enthält, jegliches nicht-mesenchymales Gewebe. Dazu gehören die sublingualen Drüsen und alle abgelösten Knospen der Unterkieferdrüse.Das restliche Mesenchym beiseite stellen. Zuerst werden 200 Mikroliter Infektionsmedium mit der optimalen Titerkonzentration aus einem mit Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigten Viruspräparat hergestellt. Entfernen Sie nun unter dem Präpariermikroskop das Medium aus der Schale, die die fünf epithelialen Rudimente enthält.Geben Sie dann schnell 200 Mikroliter des Infektionsmediums hinzu und halten Sie die Rudimente mit einer Pinzette immer feucht. Trennen Sie die Epithelrudimente weit voneinander entfernt, um ein Zusammenkleben zu verhindern und damit sie sich am Boden der Schale absetzen können. Lassen Sie dann die Rudimente eine Stunde lang bei Raumtemperatur und minimaler Störung im viralen Medium inkubieren.Überprüfen Sie die Rudimente alle 15 Minuten, um sicherzustellen, dass sie nicht dicht beieinander gerutscht sind. Trennen Sie diese gegebenenfalls mit einer Pinzette. Entfernen Sie nach der Inkubation unter dem Präpariermikroskop vorsichtig das Virusmedium und entsorgen Sie es entsprechend, wobei darauf zu achten ist, dass die Rudimente nicht gestört werden.Waschen Sie anschließend die Rudimente zweimal mit 200 Mikrolitern frischem Medium. Diese Waschungen sind entscheidend, um alle Viren zu entfernen, die schwach am Epithel haften, und um eine Infektion des Mesenchyms zu verhindern. Nach dem zweiten Waschen mit Medien bei 200 Mikrolitern Medium, fahren Sie mit 2%Matrigel fort, wobei wiederum darauf zu achten ist, dass die Rudimente nicht verklumpen.Lassen Sie dann die Rudimente 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Prewitt 200-Mikroliter-Pipettenspitze inkubieren, legen Sie fünf Rudimente auf einen gekerbten Membranfilter, der auf 200 Mikrolitern Nährmedien in einer Mikrotiterplatte mit Glasboden schwimmt. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze oder einer Pinzette überschüssiges Medium von der Oberseite des Filters, damit der Filter nicht absinkt und die Epithelrudimente an Ort und Stelle bleiben. Als nächstes platzieren Sie alle meine Stücke, die von drei bis vier Drüsen stammen, um jedes Epithelrudiment, wobei sichergestellt wird, dass sie in direktem Kontakt stehen. Die Rekombination des Mesenchyms von drei bis vier Drüsen mit dem einzelnen viral infizierten Epithelrudiment ist entscheidend für das Wachstum und die Entwicklung der rekombinierten submandibulären Speicheldrüse.Entfernen Sie dann überschüssige Medien, die die Drüsen umgeben, damit sich das Mesenchym nicht von den Rudimenten entfernt. Inkubieren Sie nun die rekombinierten Drüsen in einem befeuchteten Inkubator für zwei bis drei volle Tage nach dem beschriebenen Verfahren. Intakte embryonale SMGs wurden isoliert, und nach der DYS-Pace-Behandlung wurde das epitheliale Rudiment aus dem umgebenden Mesenchym entfernt.Hellfeld-Bildgebung zeigte, dass die rekombinierten SMGs weiterhin eine verzweigte Morphogenese durchliefen. Bei ex-vivo-Kultivierung. Für die angegebenen Zeiten kombinierten wir Drüsen, die 48 Stunden nach der Behandlung mit A GFP gezüchtet wurden.Das Adenovirus exprimierte GFP nur im Epithel. Wir kombinierten SMGs, die fixiert, gebeizt und abgebildet wurden. Nach 72 Stunden wurden mehrere Marker verwendet.Die Zellkerne sind mit dpi gefärbt, der hier in Rot gehaltene Epithelmarker eco grenzt die Epithelzellpopulation vom umgebenden Mesenchym ab. Die Epithelzellen exprimieren adenovirale GFP-Expression Der Nachweis des Basalmembranproteins Peran in Cyan, das an der Peripherie des Epithels lokalisiert ist, zeigt, dass es zumindest eine teilweise Rekonstitution der Basalmembran in rekombinierten Drüsen gibt. Konfokale Projektionen für DPI in Blau und Beta-3-Tubulin in Rot zeigen, dass die parasympathischen Ganglien innerhalb des Mesenchyms ein URI-Wachstum durchlaufen und die Drüsen in Rekombinationskulturen innervieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis für die Techniken der embryonalen submandibulären Speicheldrüsenkultur. Sowohl die Entfernung des Mesenchyms aus dem Epithel als auch die Rekombination des Mesenchyms mit dem viral infizierten Epithel können sich als schwierige Schritte erweisen. Dieses Verfahren ermöglicht jedoch die Veränderung der Proteinexpression mit Hilfe eines viralen Konstrukts, das auf die Epithelzellen aufgebracht wird.Nur eine adenovirale Infektion ermöglicht es uns, dem Epithel konstitutiv aktive oder dominante negative Proteine hinzuzufügen, um zu bestimmen, wie die Manipulation eines bestimmten Proteins das Wachstum und die Entwicklung der embryonalen submandibulären Speicheldrüse verändert.

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Forschung

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