Klinische Anwendung der Dornröschen Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Dieses Protokoll modifiziert T-Zellen genetisch, um chimäre Antigenrezeptoren einzuführen, die spezifisch für Tumorantigene sind, und vermehrt dann klinisch signifikante Zahlen auf Designerzellen, die künstliches Antigen präsentieren. Beginnen Sie mit der Elektroübertragung des Dornröschens. Transponieren und Transponieren von A-DNA-Plasmiden in ruhende mononukleäre Zellen, die aus peripherem oder Nabelschnurblut isoliert wurden.

Messen Sie dann die Transfektionseffizienz mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Als nächstes co-kultivierten die transfizierten T-Zellen über sieben Tage auf K 5 62 abgeleiteten künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen unter Zugabe von exogenen Zytokinen in vierwöchiger Stimulation. Die Proliferationszyklen werden fortgesetzt, um die elektroporierten und vermehrten autopositiven T-Zellen zu analysieren, zu konservieren und für die Anwendung beim Menschen freizusetzen.

Das Transponierungssystem von Dornröschen bietet eine Alternative zu viralen Gentransferansätzen, um ein Gen stabil in die Zelle der Wahl einzuführen. Einer der Hauptvorteile des Dornröschensystems besteht darin, dass man Gene zu wirklich geringeren Kosten integrieren kann, verglichen mit DNA-Plasmiden, die sich durch illegitime nicht-homologe Rekombination integrieren. Der Vorteil besteht also darin, dass das Dornröschen-System verwendet werden kann, um ein Gen kostengünstig und mit hoher Effizienz zu exprimieren.

Im Allgemeinen müssen Individuen, die neu in dieser Methode sind, zunächst die Effizienz von Elektro-T-Zellen bei der selektiven Vermehrung von autopositiven T-Zellen auf künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen überwinden. Beide Schritte sind aufgrund der Notwendigkeit der Co-Kultur schwer zu meistern. Genetisch veränderte T-Zellen auf künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen.

Diese Methode ist nützlich auf dem Gebiet der adoptiven Immuntherapie, insbesondere bei der effektiven Genabgabe und der Herstellung einer klinisch signifikanten Anzahl von T-Zellen. Die breitere Anwendung erstreckt sich auch auf die Therapie von Krebs, da T-Zellen des Immunsystems tumorspezifisch modifiziert werden können. Das Verfahren wird von Margaret Dawson und Matthew Fiola vorgeführt.

Techniker aus meinem Labor: Zuerst verdünnen Sie das periphere Blut mit einem gleichen Volumen P-B-S-E-D-T-A und Nabelschnurblut mit vier Volumina P-B-S-E-D-T-A und schichten langsam 25 Milliliter verdünntes Blut auf 12 Milliliter Fial in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Fial-Gradienten bei 400 G für 30 bis 40 Minuten ohne Pause. Übertragen Sie nun die mononukleäre Zellfraktion in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit P-B-S-E-D-T-A.

Erhöhen Sie das Volumen auf 50 Milliliter und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig in 50 Millilitern kompletter Kultur, Medien und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 400 g. Bündeln Sie dann die Zellpellets in CCM und führen Sie eine Zellzählung durch.

Mit der Triam-Blau-Ausschlussmethode. Die mononukleären Zellen können nun für die Elektroporation verwendet oder für die zukünftige Verwendung kryokonserviert werden. Wenn Sie kryokonserviertes MNC verwenden, tauen Sie schnell zweimal 10 bis zu den Achtelzellen auf, um eine Elektroporation in vollem Umfang zu erhalten, und übertragen Sie die Zellen vorsichtig in ein Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe mit Vorwärmung.

Vervollständigen Sie das phenolfreie RPMI-Kulturmedium und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie die mononukleären Zellen In P-F-R-P-M-I führen Sie eine Zellzählung durch und überführen Sie die Zellen in ein Zellkulturgefäß geeigneter Größe in einer Konzentration von 10 der sechs Zellen pro Milliliter. Äquilibrieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator. Ernten Sie das MNC durch Zentrifugation, resuspendieren und kombinieren Sie die Zellpellets vorsichtig in P-F-R-P-M-I und zählen Sie die Zellen auf. Übertragen Sie nun zweimal 10 auf das achte MNC in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 200 Gs für 10 Minuten ohne Pausen

Saugen Sie den Überstand so an, dass keine Medienreste um das Zellpellet herum verbleiben. Bereiten Sie eine sterile 12-Well-Platte mit 10 Wells vor, die vier Milliliter warmes P-F-R-P-M-I enthält, und äquilibrieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Rekonstituieren Sie dann die Lonzo Nucleo-Effektorlösung aus dem humanen T-Zell-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers für jede Reaktion.

Q Vet bereitet 100 Mikroliter DNA-Mastermix vor, der die supplementierte NU-Kerneffektorlösung enthält. 15 Mikrogramm der Transponierung auf Plasmid und fünf Mikrogramm des Transponierungsplasmids. Als nächstes dispergieren Sie das Pellet der T-Zellen und resuspendieren einen DNA-Mastermix der NU-Kernlösung bei einer endgültigen Zellkonzentration von zwei mal dem Zehntel der siebten Zellen pro 100 Mikroliter.

Übertragen Sie vorsichtig 100 Mikroliter der Zellsuspension auf jede der 10 Küvetten von Lonza Nucleo Affection und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Tippen Sie nun einmal auf die qve und elektro mit dem Programm U 0 1 4 für unstimulierte T-Zellen. Übertragen Sie die Küvetten und die äquilibrierende 12-Well-Platte in die Kulturhaube mit einer Vielzahl von Transferpipetten mit feiner Spitze bei 500 Mikrolitern des vorgewärmten Kulturmediums aus der entsprechenden Vertiefung auf jede Vertiefung.

Übertragen Sie die elektroporierten Zellen auf die Platte und lassen Sie die Zellen zwei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator regenerieren. Übertragen Sie dann die Zellen aus allen Vertiefungen in ein steriles Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen nach einer Wäsche, dispergieren Sie das Zellpellet vorsichtig und restimulieren Sie es in CCM, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nachdem Sie eine Zellzählung durchgeführt haben, passen Sie die Zellkonzentration so an, dass sie bei CCM auf die sechs Zellen pro Milliliter tendiert.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in einen Kulturkolben und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator, um EGFP-transfizierte Zellen zu erzeugen. Wiederholen Sie das Elektroporationsprotokoll mit fünfmal 10 der sechs Zellen pro Vete mit fünf Mikrogramm Amox-Kontroll-EGFP-Plasmid. Ernten Sie die elektroporierten Zellen und führen Sie dann eine Zellzählung mit der Trien-Blau-Ausschlussmethode durch.

Dann färben Sie ein bis zwei mal 10 der sechs Zellen mit Antikörpern, die spezifisch für CD 3, CD vier, CD acht und humanes IgG FC Gamma sind, um die Car-Expression zu messen. Erfassen Sie die Zellen auf Faxkaliber. Analysieren Sie die Daten mit der FCS-Express-Software, um den Ausdruck des Fahrzeugs zu bestimmen.

Berechnen Sie dann die autopositiven Zellen in Kultur. Der A PC-Klon Nummer vier würde von K 5 62 Zellen abgeleitet werden, um erwünschte T-Zell-Co-stimulatorische Moleküle aufzutauen, die ein Aliquot von gefrorenen bestrahlten, A A PC in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad auftauen. Waschen Sie dann die Zellen und CCM, zählen Sie die lebensfähigen Zellen durch Trip-Blue-Ausschluss auf und berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen A A PC, die für die Stimulation erforderlich sind.

Mischen Sie die elektroporierten Zellen, die CAR exprimieren, und die gammabestrahlten A A PC in einem sterilen Behälter im Verhältnis eins zu zwei. Passen Sie das A-PC-Verhältnis für die Expression von car basierend auf der Durchflusszytometrie am Tag nach der Elektroporation an. Geben Sie 30 Nanogramm pro Milliliter IL 21 zur Zellsuspension. Dann pflegte Eloqua die sechs Zellen pro Milliliter in T-75-Kolben oder betrachtete Lebenskulturbeutel und kehrte zum Kulturinkubator zurück, um den Elektrotransfer von DNA-Plasmiden und die Vermehrung von T-Zellen auf gammabestrahltem Plasma durchzuführen.

Ein PC kann verwendet werden, um eine klinisch ansprechende Anzahl von T-Zellen aus peripherem Blut und Nabelschnurblut für humane Anwendungen zu erzeugen. Bei dieser Charakterisierung von genetisch veränderten T-Zellen aus der peripheren Blutexpression von EGFP am Tag Null des ersten Stimulationszyklus werden Kontrollen für die Effizienz der Gentransferexpression von CD 19-spezifischem Auto mittels Durchflusszytometrie an CD drei positiven, CD acht positiven und CD vier positiven T-Zellen etwa 24 Stunden nach der Elektroporation bewertet. Und dann 28 Tage nach der Co-Kultur an A A die PC-Kinetik der Autoexpression auf T-Zellen, die in einem funktionell geschlossenen System gezüchtet wurden.

Die Vermehrung von aus peripherem Blut gewonnenen autopositiven T-Zellen im Laufe der Zeit kann eine klinisch ansprechende Anzahl von T-Zellen erzeugen, die das Auto stabil exprimieren. Nach vierwöchiger Co-Kultur auf einem A PC beträgt die durchschnittliche Faltenexpansion von drei positiven Zöliakie-T-Zellen etwa 19.800 mit einer CAR-Expression von 90%. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man T-Zellen auswählt und vermehrt, die ein gewünschtes Auto exprimieren.

Denken Sie daran, das übermäßige Wachstum von NK-Zellen zu überwachen. Die Elektroporation und Vermehrung von T-Zellen erfolgt in der Regel über vier siebentägige Stimulationszyklen. Weitere Untersuchungen, wie z.B. Zytokinfreisetzungs- und Zytotoxizitätsassays, können durchgeführt werden, um die umgeleitete Spezifität der genetisch veränderten T-Zellen im Bereich der adoptiven Immuntherapie zu bewerten.

Diese Technik hilft uns, das therapeutische Potenzial von T-Zellen zu verstehen, die in den Menschen infundiert werden.