Name: Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Lernen Sie ein visuelles Assay zur Überwachung T6SS-vermittelter bakterieller Konkurrenz zwischen Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die schnelle Bewertung bakterizider Aktivität.

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Diese Arbeit wurde durch den Wellcome Trust Gewährung WT091939MA finanziert. Alain Filloux wird von der Royal Society unterstützt.

Ein. Bakterienstämme und Kulturen <ol><li> Engineering einer Escherichia coli Empfängerzelle (Prey, P) durch Transformieren (unter Verwendung von Standardverfahren CaCl 2-Behandlung oder Elektroporation) 15 E. coli DH5a Zellen mit einem Plasmid, so dass der a-Komplementation des lacZ-Gens (Tab. 1). Platte die transformierten Zellen auf Luria-Bertani-Agar-Platten (LBA, 1,5% Agar), das 5-Brom-4-chlor-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) bei 40 mg / ml Endkonzentration und geeigneten Antibiotikum. Inkubation bei 37 ° C über Nacht und am nächsten Morgen wählen Sie für Blau Transformanten (vgl. § 1,3). </li><li> Wachsen die Pseudomonas aeruginosa Spenderzellen, die T6SS-aktiv sind (D +) oder T6SS-inactive (D-) (Tabelle 1) auf LBA über Nacht bei 37 ° C. In dem hier vorgestellten Beispiel verwendeten wir ein P. aeruginosa RETs belasten besitzeneine konstitutiv aktive H1-T6SS 16 und einen isogenen Mutante mit einer Deletion des H1-T6SS Gencluster (Tabelle 1). </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten eine Übernachtung flüssigen Kultur in belüfteten Kolben durch Impfen einer hellblauen Klon unter den E. coli-Transformanten (P) von der Platte in § 1.1 beschrieben, in 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. Wachsen unter Rühren bei 37 ° C. Verfahren gleichermaßen mit einer einzelnen Kolonie von (D +) und von (D -) von der Platte in § 1.2 beschrieben. </li></ol> 2. Wettbewerb Assay <ol><li> Bereiten LBA Platten für den nächsten Tag Experiment. Achten Sie darauf, diese Platten richtig getrocknet (entweder in der Nähe der Bunsenbrenner oder in Reinraumgehäuse). Bereiten Sie ein &quot;Assay-Eingang&quot; (A-Eingang) Platte für die Stämme (D +), (D -) und (P </strong&gt;). Vorbereiten eines &quot;Assay-Ausgang&quot; (A-Output)-Platte für die Stämme (D - + P) und (D + + P). Teilen Sie und beschriften Sie die Platten entsprechend. </li><li> Nach Wachstum über Nacht (siehe § 1.3), messen die optische Dichte (OD 600nm) des Eingangs-Bakterienkultur (D - D + und P) und Berechnen der Volumen benötigt, um eine Zelldichte äquivalent zu 1 Einheit OD 600nm jedes Stammes erhalten . Jedes &quot;Eingang&quot; Zellkultur (D - D + und P) anfänglich in ein steriles 1.5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt. </li><li> Zentrifugation der Proben bakteriellen bei 13.000 rpm während 1 min bei Raumtemperatur und der Überstand verworfen. </li><li> Resuspendieren der Pellets des D - inokulieren D + und P Kulturen, in 100 ml frisches TSB durch vorsichtiges Pipettieren und 10 ml jeder entspreentsprechenden Stamm einer einzigen Stelle auf der &quot;A-Eingang&quot; Platte (hergestellt in § 2,1). </li><li> Inokulieren &quot;A-Ausgabe&quot; Platte (hergestellt in § 2,1). Genauer gesagt, vorsichtig mischen 30 ul (D +) mit 30 ul (P) und 30 ul (D -) mit 30 ml (P) in zwei getrennte Eppendorf-Röhrchen (beachten Sie, dass die Kulturen verwendet, die in § 2.4 beschrieben sind) . Beimpfen 20 ul des Mixes (D + / P) und (D - / P) als einzelne Punkte auf der &quot;A-Ausgabe&quot; Platte. Lassen Sie die Spots in der Nähe einen Bunsenbrenner trocknen und legen Sie die Platte in einem Brutschrank bei 37 ° C für einen angemessenen Zeitraum, während dessen der Abtöten der Bakterien stattfindet. Im Fall von S. aeruginosa wird eine effiziente Bakterienabtötung beobachtet nach 5-stündiger Inkubation bei einem Vergleich eines aktiven T6SS mit einem T6SS defekte Stamm. </li></ol> 3. Qualitative Beobachtung von ter Abtöten der Bakterien <ol><li> Planen LBA Platten, enthaltend 40 ug / ml X-gal für das Auslesen des Assays. Die Platten werden als &quot;Readout Eingang&quot; oder &quot;R-Eingang&quot; zu isolierten Bakterien oder &quot;Readout Ausgang&quot; oder &quot;R-Ausgang&quot; auf gemischte Bakterienkulturen zu erkennen und so gelesen das Töten Leistung erkennen werden. Diese Platten müssen auch richtig getrocknet werden. Teilen Sie die Platte in vier gleiche Teile auf seinem Rücken und kommentieren diese Teile 0, 10 -1, 10 -2 und 10 -3, Bestimmung der Verdünnungen der Bakterienkultur auf den Agarplatten erkennen (vgl. § 3,3). Die Verdünnung wird eine semi-quantitative Auswertung der blau / weiß Bakterien-Verhältnis innerhalb der gleichen Stelle zu ermöglichen. </li><li> Sammeln Sie mit einer sterilen Schleife die einzelnen bakteriellen Spots aus dem &quot;A-Eingang&quot; Platte (vgl. § 2,4) und &quot;A-Ausgabe&quot; Platte (vgl. § 2,5) und resuspendieren jeden Ort in verschiedenen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml TSB. Zeigen in einer Eppendorf-Schüttler Block während 30 min, um effizient die resuspendierenBakterien. </li><li> Bereiten Sie eine Serie von 5 mal 3 Eppendorf Röhrchen mit 900 ul TSB und gehen für jeden resuspendierten Ort zu zehn fache serielle Verdünnungen bis zu 10 -3. Achten Sie darauf, Pipettenspitzen zu ändern und Vortex 5 Sekunden zwischen jedem Verdünnungsschritt. </li><li> Fahren Sie mit dem Spotten Ihre bakterielle Verdünnungen in § 3,3 auf gut getrockneten LBA-Platten mit 40 ug / ml X-gal, indem Sie mit der meisten verdünnten dem unverwässerten Suspension hergestellt, so dass diese die &quot;R-Eingang&quot; Platten für die &quot;A -input &quot;-Spots und die&quot; R-Ausgang &quot;Platten für die&quot; A-Ausgabe &quot;Flecken (Abbildung 2). Vortex kurz jedes Rohr, bevor Sie mit dem Spotting, um eine homogene Bakteriensuspension zu halten. Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, spot 20 ul in dreifacher Ausfertigung innerhalb eines Quadranten (Abbildung 2). Die relative Trockenheit Ihrem Teller ist in diesem Stadium wichtig, da die Flecken bleiben einzeln auf der Platte getrennt und nicht aufeinander gleiten müssen. Eine Quantifizierung des Kompetitionstest ist auch in dieser Phase des Experiments möglich. Nach dem Schritt 3,3, verteilt 100 ul der Verdünnung 10 -3 auf LBA-Platten mit 40 ug / ml X-gal. Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu einer Beschichtung in dreifacher Ausfertigung für jeden Punkt aus dem &quot;A-Ausgabe&quot; Platte gehen. Platzieren Sie die Verdünnungsplatten in einem 37 ° C Inkubator über Nacht (entsprechend 16 h Inkubation). Fahren Sie mit dem Zählen der blauen Kolonien (die P-Zellen, die am Leben geblieben). Typische Ergebnisse nach 5 Stunden von Wettbewerb erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Hinterlegen der Platte offen (ohne Deckel) innerhalb eines sterilen Zone, um die Absorption der Flüssigkeit in Überschuß innerhalb jeder Stelle zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator über Nacht. Während dieser Inkubationszeit wird die Abtötung noch auftritt in der Mischung (D + / P), da beide Stämme sind noch in Kontakt. </li><li> Nehmen Sie ein Bildoder Scannen Ihrer Platten für die Output-Analyse (Abbildung 2). Wo Flecken weitgehend blauen bleibt es zeigt, dass E. coli nicht durch P. getötet worden aeruginosa. Das ist der Fall, wenn E. coli wird mit einem T6SS defekten P. gemischt aeruginosa Stamm (D-) (Abbildung 2, Platte unten rechts). </li></ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
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<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Methode in diesem Artikel vorgestellt ermöglicht eine visuelle Beobachtung der T6SS-vermittelte bakterizide / Bakteriostase Aktivität. Der Assay basiert auf der Oberfläche einer Agarplatte durchgeführt. Es wurde zuvor gezeigt, dass T6SS-abhängigen Abtötungsassay mit gemischten bakteriellen flüssigen Kultur durchgeführt nicht effizient ist, wahrscheinlich wegen der fehlenden stationären Kontakt zwischen den beiden Bakterien 8. Die T6SS wird angenommen, dass mit einem Mechanismus ähnlich dem von Bakteriophagen verwendet, um DNA in Zielzellen 17 einzuspritzen betreiben. In flüssiger Kultur, die röhrenförmige Struktur des T6SS kann leichter brechen können inter-bakterielle Kontakt verloren, und die Giftstoffe nicht effizient bereitgestellt. In Bezug auf die Inkubationszeiten, sind die 5 ersten Stunden der Kontakt, den wir beschreiben, zwischen dem Donorstamm und die Beute aus, um bakterielle Tötung zwischen P. beobachten aeruginosa und E. coli, wie in Abbildung 3 dargestellt </strong&gt;. Trotzdem ist es empfehlenswert, die Inkubationszeit durch Durchführung einer kinetischen um die Versuchsbedingungen zu optimieren einzustellen. Da dieses Verfahren eine Farbe basierten Technik können die Ausgabeergebnisse vom Pigmentierung der Donorstamm beeinträchtigt werden. Zum Beispiel werden im Fall von S. aeruginosa, produzieren einige Stämme hohe Buntpigmente wie Pyocyanin und Pyoverdin, das mit dem Assay Auslesen stören können, wodurch der Unterschied zu der Beute relativ schwierig. Andere chromogene β-Galactosidase-Substrate, wie der Magenta-gal oder die rot-gal, kann anstelle des X-gal (Tabelle 1) verwendet werden. Der Wettbewerb Assay kann Verwendung anderer Reportergene für das Auslesen machen. So hat ähnlichen Assay auch durch Verwendung grün fluoreszierendes Protein-markierten preys 12 durchgeführt. Unser Test zwar nicht quantitativ, gibt einen guten Hinweisder T6SS Aktivität, da sie auf das Überleben oder die Tötung eines Reporters Beute basiert. Diese Technik bietet den Vorteil, dass sie einfach und bequem, die bakterizides / Bakteriostase Aktivität T6SSs aus beliebigen Bakterien-Spezies zu evaluieren. Bisher war die Aktivität des T6SS hat gegen Gram-negative Bakterien und keine klare Beispiels T6SS-sensitive gram-positive Bakterien gezeigt wurde berichtet noch 12. Es ist auch offensichtlich, dass in der Kultur Inkompatibilität der verschiedenen Bakterienarten zu testen (zB Wachstumstemperatur, Sauerstoffzufuhr, spezifischer Medien) zu berücksichtigen. Unserem Assay kann auch verwendet werden, um auszuwerten, welches der T6SS Komponenten sind unbedingt erforderlich, da bereits Spuren von einem sekretierten Toxin könnte ausreichend sein, um die Beute zu töten. Auch schwache Aktivität der T6SS könnte dann deutlich von unseren Test nachgewiesen werden, dass Standard-Verfahren Tests T6SS-abhängige Sekretion mit Kulturüberstand und Western-Blot-VergleichAnalyse. Allerdings ist eine richtige koloniebildenden Einheit (CFU) Zählen noch für eine genaue Quantifizierung dieses T6SS Aktivität erforderlich.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETs (D +) (Aktiv T6SS) </td><td> Laborstamm </td><td></td><td> Beschrieben in Reference 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETs Δ H1-T6SS (D -) (inaktive T6SS) </td><td> Diese Studie </td><td></td><td> Die H1-T6SS Cluster (umfasst der Gene PA0070 um PA0095) durch allelischen Austausch wurde nach dem Verfahren in Referenz 18 beschrieben gelöscht. Die Bis-Fragment-Primer: Die Mutator-Fragment wurde mit dem folgenden Satz von Primern erzeugt: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, und 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Die Down-Fragment Primer: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5 </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 Ende A1 hsd R17 (r k -, m k +) pho A sup E44 λ-thi -1 gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Dieser Vektor drückt die α-Peptid der β-Galactosidase für α-Komplementation verwendet. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Verwenden Sie bei 40 pg / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani-Agar </td><td> Merck-Chemikalien </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (Kasein Soja Brühe) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex Schüttler Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Zelldichte Meter </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> Research Organics </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Strain, Plasmid, Material und Reagenz verwendet. </td></tr></tbody></table>

ein visual assay zur t6ss-vermittelte bakterielle wettbewerb überwachen

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Typ VI Sekretionssysteme (T6SSs) sind molekulare Nanomaschinen ermöglichen Gram-negativen Bakterien zu transportieren und zu injizieren Proteine ​​in einer Vielzahl von Zielzellen 1,2. Die T6SS besteht aus 13 Kern-Komponenten und zeigt strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Schwanz-Rohr von Bakteriophagen 3. Der Phage verwendet ein Rohr und ein Stechgerät die Zellhülle von Ziel-Bakterien eindringen und injizieren DNA. Es wird vorgeschlagen, dass die T6SS ein invertiertes Bakteriophagen Vorrichtung Schaffung eines spezifischen Pfades in der bakteriellen Zellwand und Toxine Effektoren an die Oberfläche zu treiben. Das Verfahren könnte weiterhin entnommen werden, und die Vorrichtung könnte T6SS anderen Zellen, mit denen das Bakterium in Kontakt zu perforieren, wodurch die Injektion der Effektoren in diesen Zielen. Der Schwanz Rohr und Stechgerät Teile der T6SS mit Hcp und VgrG Proteinen bzw. 4,5. Die Vielseitigkeit des T6SS wurde durch s nachgewiesenTUDIEN mit verschiedenen bakteriellen Erregern. Die Vibrio cholerae T6SS enthaltene Zytoskelett eukaryontischer Wirtszellen durch Einspritzen eines &quot;entwickelt&quot; VgrG Tragen eines C-terminalen Aktin Vernetzen Domäne 6,7 umzugestalten. Ein weiteres eindrucksvolles Beispiel wurde kürzlich dokumentiert mit Pseudomonas aeruginosa in der Lage, anzugreifen und zu töten Bakterien in einem T6SS-abhängigen Weise, also die Förderung der Errichtung von Bakterien in spezifischen mikrobiellen Nischen und Wettbewerbsumfeld 8,9,10 ist. Im letzteren Fall sind drei T6SS-sekretierte Proteine, nämlich Tse1, Tse2 und TSE3 wie die Toxine in den Zielbakterien (Abbildung 1) injiziert identifiziert. Donorzelle ist aus der schädlichen Wirkung dieser Effektoren über einen Anti-Toxin-Mechanismus, durch den TSI1, TSI2 und Tsi3 Immunität Proteine ​​vermittelt 8,9,10 geschützt. Dieses antimikrobielle Aktivität kann überwacht werden, wenn T6SS-kompetenten Bakterien zu n cokultiviert werdenolid Oberflächen im Wettbewerb mit anderen Bakterienarten oder mit T6SS-inactive Bakterien der gleichen Art 8,11,12,13. Die verfügbaren Daten betonte eine numerische Annäherung an die bakterielle Kompetitionsassay, einschließlich zeitaufwändig CFU Zählen, das hängt stark von Antibiotika Entscheidungsträger. Im Fall von antibiotikaresistenten Stämmen wie P. aeruginosa, können diese Methoden ungeeignet sein. Ferner mit der Identifizierung von etwa 200 verschiedenen T6SS Loci in mehr als 100 Bakteriengenome 14, ist eine bequeme Screening-Werkzeug sehr wünschenswert. Wir entwickelten einen Test, der einfach zu bedienen ist und erfordert Standard-Labor-Material und Reagenzien. Das Verfahren bietet eine schnelle und qualitative Technik, um die T6SS-abhängige bakterizide / Bakteriostase-Aktivität durch Verwendung eines Reporter-Stamm als Beute (in diesem Fall Escherichia coli DH5a) Zulassen einer-Komplementation des lacZ-Gens zu überwachen. Insgesamt ist dieses Verfahren graphic und ermöglicht eine schnelle Identifizierung von T6SS-bezogene Phänotypen auf Agarplatten. Dieses experimentelle Protokoll kann auf andere Stämme oder Bakterienspezies unter Berücksichtigung der besonderen Bedingungen wie Wachstumsmedium, Temperatur oder Zeit des Kontaktes angepasst werden.

Typische Ergebnisse sind in Abbildung 1 mit den Stämmen und Reagenzien in Tabelle 1 beschrieben dargestellt. Die Platten in dieser Figur gezeigt sind, wurden nach Inkubation über Nacht gescannt. Die &quot;Auslese-Input&quot; Platten zeigen eine Verdünnungsreihe Muster für die Stämme in diesem Assay verwendet. Wie erwartet ist der E. coli Beute Flecken (P) Überexprimieren das lacZ-Gen erscheinen blau auf Medien mit X-gal ergänzt, während der Spender P. aeruginosa-Stämme (D +, T6SS aktiv) und (D -, T6SS inaktiv) weiß bleiben. Die &quot;Auslese-Ausgang&quot; Platten, auf denen die Mischung zwischen dem Opfer und einem T6SS aktiven Stamm (D + / P) gesichtet wurde zeigen, das Verschwinden der blauen Beute damit angibt, dass es getötet wurde. Dies zeigt die Fähigkeit des Spenders, um die Beute outcompete. Die Persistenz der blauen Farbe auf dem (D - / P)-Platte zeigt die Unfähigkeit eines inaktiven T6SS Spender, um den blauen Beute zu töten. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Tötung von E. coli durch T6SS-kompetent P. aeruginosa. P. aeruginosa spritzt Toxine in den E. coli Zielzelle in einem T6SS-abhängigen Weise (durch den weißen Pfeil). Zwei Toxine Tse1 und TSE3 (orange und rote Kreise) in den E. eingespritzt coli Periplasma und verschlechtern die Peptidoglycan 9. Die Tse2 Toxin (gelber Kreis) wird in den E. eingespritzt coli Zytoplasma und hat eine bakteriostatische Wirkung 8,10. Die kombinierte Wirkung der Toxine tötet die Zielzellen (Blitz und Schädel). Die Überlebensrate von Zielzellen kann durch Überwachen der Aktivität des hergestellten β-Galactosidase (siehe auch Figur 2) erfaßt werden. P. eineruginosa gegen die Aktivität der Toxine durch die Immunität Proteine ​​TSI1, TSI2 und Tsi3 (orange, gelb und rot Plätzen, jeweils) 8,9,10 geschützt. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Agar-Platten-Assay zu überwachen T6SS-abhängige Abtöten der Bakterien In dieser Zahl sind auf dem oberen Teil der &quot;Auslese-Input&quot; Platten, bestehend aus den Verdünnungsreihen der D gezeigt -., D + und P-Eingang Zellen. Die P Eingangszellen sind blau aufgrund des α-Komplementation des lacZ-Gens und damit produzierten β-Galactosidase, dass spaltet X-Gal. Im unteren Teil wird die &quot;Auslese-Output&quot; Platten aus Verdünnungsreihen der bakteriellen Mischung zwischen einem aktiven (D + / P) gezeigt, </strong&gt;, oder ein inaktives (D - / P), T6SS Donor P. aeruginosa Stamm mit der E. coli Beute. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Die Quantifizierung der Tötung von E. coli durch P. aeruginosa nach 5 h Inkubation. Die Grafik zeigt die CFU Zählung von E. coli beschrieben in der 3,4 Schritt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen eine 3-fache Differenz zwischen dem T6SS + und den T6SS-Stämmen, was darauf hindeutet, dass die meisten der Tötung stattfindet während der 5 ersten Stunden des Kontakts.

Wir beschreiben einen qualitativen Test auf bakterielle Wettbewerb durch die vermittelten überwachen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Type VI Sekretionssystem (T6SS). Der Assay beruht auf der Überlebensrate / Abtötung von Escherichia coli eine tragende Zielzellen<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Diese Technik ist einstellbar, um die bakteriziden / Bakteriostase Aktivität T6SS-kompetente Mikroorganismen einzuschätzen.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Fähigkeit zweier Bakterienarten zu bewerten, miteinander zu konkurrieren, wenn sie in der gleichen Nische gedeihen. Insbesondere werden wir die Rolle des Sekretionssystems vom Typ sechs oder vom Typ sechs in diesem Wettbewerbsprozess bewerten. Dies wird durch die Vorbereitung von Assay-Eingangsplatten entweder mit Spenderzellen mit einem aktiven Typ 6 oder mit Beutezellen erreicht, die zu blauen OnX-Skalenplatten werden.Anschließend werden Assay-Ausgabeplatten vorbereitet, auf denen der Spender- und der Lobpreisstamm kombiniert werden. Als nächstes werden die Platten inkubiert, damit die Aktivität des Typs sechs stattfinden kann. Dann wird die serielle Verdünnung von den Eingangs- und Ausgangsplatten hergestellt, und die verdünnten Kulturen werden auf den Ein- und Ausgabeplatten der Auslese aufgefleckt.Es werden Ergebnisse erhalten, die Unterschiede in der Dominanz der blauen Farbe in jedem Fleck zeigen, basierend auf einer einfachen visuellen Beobachtung, die das Überleben der Beutezellen in jedem Fall anzeigt. Je mehr Blau bedeutet, desto mehr Überleben der Beute und damit eine geringe Tötungsaktivität der Spenderzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Zählen von koloniebildenden Einheiten besteht darin, dass diese Methode einfach und zeitaufwändig ist und eine direkte Bewertung der Aktivität des Typs sechs gegen eine bestimmte Beute ermöglicht.Diese Technik bewertet also die Siegelaktivität von Bakterien in Mischkulturen und kann daher helfen zu verstehen, warum einige chronische polymikrobielle Infektionen letztendlich von einer einzigen Bakterienart dominiert werden, wie es bei Pseudomona shin in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten der Fall ist. Zu Beginn von groben Pseudomonas aerogen Spenderzellen, die Typ sechs aktiv D positiv oder Typ sechs inaktiv D negativ sind, auf LB-Agar- oder LBA-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. In dem hier vorgestellten Beispiel haben wir einen Pseudomonas aerogen RET S-Stamm verwendet, der ein konstitutiv aktives H one Typ sechs besitzt, und eine isogene Mutante mit einer Deletion des H one Typ sechs Gencluster-Ingenieurs, einer E. coli-Empfängerzelle oder Beute durch Transformation von DH fünf alpha mit einem Plasmid, was die Alpha-Komplementierung des fehlenden Gens ermöglicht.Isolieren Sie die Bakterien aus einem Glycerinvorrat auf LB mit XGL und einem geeigneten Antibiotikum und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Auswahl und Auswahl von blauen Transformanten und Vorbereitung einer Übernachtkultur in fünf Millilitern Tryptychen, Sojabrühe oder TSB mit Antibiotikum unter Rühren bei 37 Grad Celsius für das Experiment am nächsten Tag: Vorbereiten von LBA-Platten, die als Assay-Eingabe für die Stämme, D-positiv, D, negativ und P gekennzeichnet sind, und Assay-Ausgabe für D-negativ plus P und D-positiv plus P. Messen Sie die optische Dichte und berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um eine Zelldichte zu erhalten, die einer Einheit OD 600 entspricht. Sammeln Sie jede Kultur in einem sterilen 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.Nach dem Pilotieren der Bakterienproben bei 13.000 U/min für eine Minute und dem Suspendieren der Pellets durch Resus in 100 Mikrolitern frischem TSB werden 10 Mikroliter jedes Stammes als einzelner Punkt auf der A-Eingabeplatte geimpft. Als nächstes mischen Sie vorsichtig 30 Mikroliter D-positiv mit 30 Mikrolitern P und in einem zweiten Röhrchen 30 Mikroliter D-negativ mit 30 Mikrolitern P. Beimpfen Sie dann den A-Ausgang der Platte mit einem 20-Mikroliter-Fleck jeder Mischung. Nachdem Sie die Flecken in der Nähe von Abus und Brenner trocknen gelassen haben, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, damit die Bakterien abgetötet werden können.Um die Leistung der Bakterienabtötung zu analysieren, bereiten Sie LBA-Platten mit 40 Mikrogramm pro Milliliter Xal vor. Beschriften Sie für die Assay-Anzeige die Eingabe der Plattenauslesung, um isolierte Bakterien zu erkennen, oder die Ausgabe, um gemischte Bakterienkulturen auf der Rückseite jeder Platte zu erkennen, die in vier gleiche Teile unterteilt ist, und beschriften Sie den Nullpunkt des Abschnitts 10 mit minus eins, 10 mit minus zwei und 10 mit minus drei. Jede Verdünnung ermöglicht eine semiquantitative Bewertung des Verhältnisses von blau-weißen Bakterien an derselben Stelle.Sammeln Sie mit einer sterilen Schleife die einzelnen Bakterienflecken von der A-Eingabeplatte und der A-Ausgangsplatte und resuspendieren Sie jeden Fleck in separaten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit einem Milliliter TSB. Schütteln Sie die Röhrchen 30 Minuten lang, um die Bakterien wieder zu suspendieren, während die Kulturen zittern. Bereiten Sie fünf Sätze mit je drei Mikroröhrchen vor, die jeweils 900 Mikroliter TSB enthalten.Bereiten Sie dann, beginnend mit jedem resuspendierten Spot, zehnfache serielle Verdünnungen mit frischen Spitzen vor und wirbeln Sie zwischen den Verdünnungsspots jede Verdünnung kurz auf LVA-Xalplatten vor, beginnend mit der am stärksten verdünnten Probe und endend mit der unverdünnten Probe. Plattieren Sie die A-Eingangsröhrchen auf den R-Eingangsplatten und die A-Ausgangsverdünnung auf den R-Ausgangsplatten pro Reproduzierbarkeitspunkt um 20 Mikroliter in dreifacher Ausfertigung innerhalb jedes Quadranten. Um den Wettbewerbsaufsatz in diesem Stadium zu quantifizieren, werden 100 Mikroliter der 10 bis minus drei Verdünnungen aus den A-Ausgangsproben in dreifacher Ausfertigung auf LBA xga-Platten inkubiert, über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert und blaue Kolonien im sterilen Bereich gezählt, lassen Sie die Platten offen, damit überschüssige Flüssigkeit absorbiert werden kann und der Inkubator über Nacht bei 37 Grad Celsius zunimmt. zu dieser Zeit wird immer noch gemordet.Da beide Stämme für die Ausgabe, das Analysebild oder den Scan der Platten noch in Kontakt sind. Flecken, die weitgehend blau bleiben, deuten darauf hin, dass E. coli nicht abgetötet wurde. Wie es bei der Kultivierung mit dem gezeigten defekten Posisstamm vom Typ sechs typisch ist, finden Sie hier eine serielle Verdünnung für die Auslese-Eingangsplatten für die in diesem Assay verwendeten Stämme.Wie erwartet, erscheinen die E-coli-Pre-Spots P über der Expression des fehlenden Gens auf Medien, die mit XGL ergänzt wurden, blau, während die Spender-P-Aerogennasenstämme D-positiver Typ 6 aktiv und D-negativer Typ 6 inaktiv weiß bleiben. Die Auslesetafeln, auf denen die Mischung zwischen der Beute und einem aktiven Stamm D positiv P vom Typ sechs gesichtet wurde, zeigen das Verschwinden der blauen Beute, was darauf hindeutet, dass sie getötet wurde. Dies zeigt die Fähigkeit des Spenders, die Beute zu übertreffen.Die Persistenz der blauen Farbe auf der D-negativen P-Platte zeigt die Unfähigkeit eines inaktiven Typ-6-Spenders, die blaue Beute zu töten. Wenn man also dieses Verfahren ausprobiert, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Anforderungen an das Wachstum oder an die Sekretionsaktivität vom Typ 6 von einer Bakterienart zur anderen variieren können und daher möglicherweise eine kleine Anpassung des Versuchsaufbaus erforderlich ist. Darüber hinaus müssen Sie auch daran denken, dass, wenn Sie die Sekretionsaktivität vom Typ 6 bei einer einzigen Spezies beurteilen möchten, es auch sehr wichtig ist, die Aktivität einer Typ-6-Sekretionsmutante streng mit dem Elternstamm zu vergleichen, wann immer dies möglich ist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie einen visuellen Aufsatz erstellen, um das Überleben von Präzellen zu beurteilen, nachdem sie mit dem kompetenten Typ sechs oder einem defekten Stamm vom Typ sechs in Kontakt gekommen sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Speare, L., et al. Coinkubationsassay zur Quantifizierung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Vibrio fischeri Isolaten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt einen Co-Inkubations-Assay, mit dem untersucht wird, wie Bakterienstämme in einer gemeinsamen Umgebung konkurrieren. Es wird in der Mikrobiologie häufig eingesetzt, um Mechanismen wie die kontaktabhängige oder kontaktunabhängige Abtötung zu identifizieren, die diese Wechselwirkungen antreiben.

Coinkubationsassay zur Untersuchung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen

Quelle: Perinbam, K., und Siryaporn, A. Ein schneller, bildbasierter bakterieller Virulenztest mit Amöben. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert eine schnelle, bildbasierte Methode zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz, indem Amöben mit oberflächengebundenen oder planktonischen Bakterien inkubiert, ein Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) Agarose-Pad angewendet und Fluoreszenz bildgeblich zur Erkennung von Wirtszellschäden durchgeführt wird.

Ein schneller, bildbasierter Test zur Überprüfung oberflächeninduzierter bakterieller Virulenz

Dieses Video zeigt eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Methode zur Untersuchung der bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Struktur und Funktion von Bakteriengemeinschaften.

Bakterieller Co-Inkubations-Assay: Eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der intraspezifischen bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene

Dieses Video zeigt eine Technik zur Bewertung der komplementvermittelten bakteriziden Aktivität von Antikörpern, die im Serum vorhanden sind. Dieser Ansatz kombiniert isoliertes Serum mit pathogenen Bakterien und exogenen Komplementproteinen. Nach der Inkubation werden die Bakterien auf einer Agarplatte gezüchtet und die produzierten Kolonien quantifiziert, um den bakteriziden Serumtiter zu messen.

Ein bakterizider Serumassay für die komplementvermittelte bakterizide Aktivität von Antikörpern

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Zwei Assays für mikroskopiebasiertes Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion beteiligt sind, werden beschrieben. Der Entry-Assay weist Wirtsfaktoren nach, die für den Brucella-Eintritt erforderlich sind, und der Endpunkt-Assay diejenigen, die für die intrazelluläre Replikation erforderlich sind. Das siRNA-Screening in HeLa-Zellen ist zwar für alternative Ansätze anwendbar, wird aber zur Veranschaulichung der Protokolle verwendet.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

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Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

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