Name: Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie eine experimentelle Pneumokokken-Besiedlung beim Menschen etablieren. Diese Methode nutzt intranasale Inokulation von Streptococcus pneumoniae und Nasenspülungen zur Überwachung. Sie ermöglicht die Untersuchung immunologischer Schutzmechanismen und unterstützt die Entwicklung neuer Impfstoffe.

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Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation (Grand Challenge Exploration Auszeichnung SBG), die National Institutes for Health Research (NIHR), Biomedical Research Centre in Microbial Diseases, und der NIHR Umfassende Local Research Network finanziert. Wir erkennen die NWDA für infrastrukturelle Unterstützung. Wir danken Prof. J. N Weiser, University of Pennsylvania und Prof. P Hermans, University of Nijmegen für die Pneumokokken-Isolate. Dank der EHPC Safety Committee für ihre Unterstützung und Beratung, um alle unsere Freiwilligen für ihre Teilnahme und Mathieu Bangert für die Fotos.

Ein. Ehrenamtliche Auswahl und Screening <ol><li> Gesunde Probanden durch Plakatwerbung und auf der Website der Universität nach dem NHS Forschung und Ethik Ausschuss Führung rekrutiert. </li><li> Die Einschlusskriterien für die Teilnahme sind: <ol><li> Erwachsene im Alter von 18-60 Jahren. </li><li> Spricht fließend Englisch und ist in der Lage, einfach zu kommunizieren sowohl Mobiltelefon und SMS. </li></ol></li><li> Die Ausschlusskriterien für die Teilnahme sind: <ol><li> Enger Kontakt mit gefährdeten Personen (Kinder, immunsupprimierten Erwachsenen, älteren, chronisch krank). </li><li> Aktuelle Raucher oder bedeutende Geschichte das Rauchen (&gt; 10 pack Jahre). </li><li> Asthma oder anderen Atemwegserkrankungen. </li><li> Schwangerschaft. </li><li> Allergie gegen Penicillin oder Amoxicillin. </li><li> Aktuelle Beteiligung an einer anderen klinischen Studie sei denn, Beobachtung oder in nicht-interventionellen Phase. </li><li> Nicht vollständig informierte Einwilligung zu geben. </li></ol></li><li>Eine erste Screening-Visite, etwa eine Woche vor der Impfung, eine fokussierte Anamnese und gezielte klinische Untersuchung. </li><li> Wenn eine zuvor unerkannte Störung gefunden wird, wird der Freiwillige aus der Studie ausgeschlossen und entsprechende Untersuchung wird durch die Grundversorgung organisiert werden. </li><li> Während des anfänglichen Screening über eine Blutbild erhalten wird, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Leukozyten im Normalbereich ist vor der Inokulation Besuch. Eine Nasenspülung wird durchgeführt, um natürliche Pneumokokken Träger auszuschließen (vgl. 6,1). </li><li> Vor der Inokulation werden Freiwillige auf den Risiken, die mit der Teilnahme an der Studie beteiligten erzogen und sind mit einem Notfall Packungsbeilage, digitale Thermometer, Notrufnummern und 3-Tages-Kurs von Amoxicillin vorgesehen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Impfung Stocks <ol><li> Vorbereitung der Impfung Bestände müssen in einer sauberen Umgebung durchgeführt werden. Die Pipetten verwendet werden, sollten nur verwendet werdend für Inokulumzubereitung. Alle Glas-und Kunststoff-ware sollten steril sein. Wir empfehlen, dass Impfen Aktien in einem eigenen Raum vorbereitet werden, mit einem dedizierten fumehood und Inkubator. </li><li> Pneumokokken-Stämme werden auf einer Agarplatte beimpft. Die Platten werden bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht inkubiert. Die folgenden Tage alle Bakterien aus dem Blut-Agar-Platte abgeschabt und geimpft zu einem Wulst Bestandserhaltung System. Diese Raupe Aktien werden für die Impfung Stoffaufbereitung. Testen Sie die Perlen Aktien für Verschmutzung und Kolonie Einheitlichkeit vor der Zubereitung eine Impfung Lager. </li><li> Um die Inokulation Lager herzustellen, anzuimpfen eine Agarplatte mit zwei Wülsten von der gewünschten Pneumokokken Serotyp Wulst Lager, Ausstreichen, um die gesamte Platte abzudecken. Inkubieren Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht. Alle weiteren Inkubationen verwenden diese gleichen Bedingungen. Auch bebrüten die Vegitone media Nacht, um die Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Am nächsten Morgen TupferHälfte der Platte, dabei nicht zu entfernen Blutagar, und fügen Sie 12 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe. Wiederholen Sie mit der anderen Hälfte der Platte. Lassen Sie die zwei 12 ml-Fläschchen bei 37 ° C für 2 Stunden oder bis eine Veränderung der Trübung wird deutlich, was zuerst eintritt. </li><li> Fügen Sie die 12 ml bis 40 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe und mischen. Wiederholen Sie dies für die anderen 12 ml Fläschchen. Dies ist Zeitpunkt = 0 ist. 100 ul zu entfernen, um die optische Dichte (OD) bei 600 nm abgelesen. Entfernen 20 ul zur Quantifizierung der Bakterien durch koloniebildende Einheit (CFU) Zählung unter Verwendung einer Variation des Verfahrens von Miles und Misra (M &amp; M) 7. Inkubieren beide Fläschchen. <ol><li> Für die M &amp; M, teilen eine Agarplatte in sechs Abschnitte. Fügen Sie 180 ul sterilem PBS zu sechs Vertiefungen einer 96-Well-Platte (U-Boden). Fügen Sie 20 ul der Brühe nach oben gut und mischen. Serienmäßig wird die Probe 1.10 sechsmal und entsorgen 20 ul aus dem sechsten gut. Platz drei 10 ul Tropfen von oben auch in den ersten Abschnitt desBlutagarplatte. Wiederholen Sie dies für die fünf anderen Brunnen. Sicherstellen, dass die Platte trocken ist, bevor es invertiert und inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag die Anzahl der sichtbaren Kolonien in jeder Verdünnung Abschnitt und aufzeichnen. Verwendung der Verdünnung Abschnitt mit einer Anzahl zwischen 30 und 300, unterteilen die Anzahl der sichtbaren Kolonien durch drei um einen Durchschnittswert zu bekommen. </li><li> Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dann geteilt durch 10 (die Menge der 10 ul drop). Dies gibt CFU / ul. </li><li> Multiplizieren Sie diese Zahl um 1.000 auf CFU / ml erhalten. </li></ol></li><li> Führen OD 600 Lesungen und Quantifizierung der Bakterien durch M &amp; M Verfahren stündlich bis frühen mittleren log-Phase erreicht wird, einen Außendurchmesser von 0,25. </li><li> Sobald dies OD erreicht, so ist sterilisiert 10% Glycerin zu einem Fläschchen und Herstellung von 1 ml Aliquots. Shop Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Für eine konzentrierte Lager, zentrifugieren Sie das andere Gefäß bei 3.345 xg für 15 min und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 22,5 ml Vegitone mittleren und 10% Glycerin. Bereiten Sie 1 ml und bei -80 ° C. </li><li> Lassen Aktien bei -80 ° C für mindestens 48 Stunden vor dem Auftauen und Quantifizierung. </li><li> Quantifizierung des gefrorenen Bakterien Aktie durch den M &amp; M-Methode. Testen Sie drei Lager Röhren einzeln um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verwenden Sie den Wert erhalten, den Bestand an die gewünschte Inokulumkonzentration in Kochsalzlösung verdünnen, wie unten beschrieben. </li><li> Für eine Inokulation wird die Menge von Pneumokokken in dem Inokulum vor und nach der Inokulation berechnet. Diese Quantifizierung der Bakterien durch die M &amp; M Verfahren wird verwendet, um die durchschnittliche Anzahl von Pneumokokken in dem Inokulum, das für die Zeit, die es braucht, um die gesamte Verfahren ausführen ausmacht bestimmen. <ol><li> Bereiten Sie ein Inokulum, Verdünnen auf die gewünschte Konzentration, und führen Sie die Quantifizierung durch die M &amp; M-Methode für die &quot;pre-Impfung&quot; zählen. </li><li> In unserem Clinical Research Facility dauert es dem Team 30 min, um die gesamte Impfung abzuschließen. Pneumococcal Suspensionen in Kochsalzlösung wird in der Regel zeigen eine verringerte Anzahl in diesem Intervall. Um dies zu berücksichtigen, lassen wir die verdünnte Inokulum sitzen bei Raumtemperatur für 30 min und dann eine &quot;post-Impfung&quot; Quantifizierung der Bakterien durch die M &amp; M-Methode. </li><li> Der Mittelwert der vor und nach den endgültigen inokuliert Konzentration zu bestimmen. Stellen Sie die &quot;sitzend&quot; Zeit nach Ihrer klinischen Protokoll, sondern halten das Intervall so kurz wie möglich. </li></ol></li><li> Alle neuen Aktien sollten an ein Referenzlabor zur Bestätigung auf Lager Reinheit und Identität gesendet werden. </li></ol> 3. Inokulumzubereitung <ol><li> Vorbereitung des Inokulums sollte 30 Minuten vor der geplanten freiwilligen Impfung Termin beginnen. </li><li> Nehmen Sie eine der bisherigen Lager Rohre aus dem -80 ° C Gefrierschrank, auftauen und drehen Sie das Rohr in der Mikrozentrifuge bei 17.000 xg für 3 min. </li><li> Warm Blutagarplatten in der 37 ° C-Inkubator. Vorbereiteneine 96-Well-Platte für die bakterielle Quantifizierung von M &amp; M Verfahren und bereiten Verdünnungsröhrchen entsprechend der gewünschten Dosis. </li><li> Entfernen der Brühe aus dem zentrifugierten Überstand Rohr und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. Dieser Schritt entfernt die Brühe aus dem Inokulum. </li><li> Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. </li><li> Entfernen Sie die Kochsalzlösung Überstand und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. </li><li> Führen Verdünnung Satz für die gewünschte Inokulumkonzentration und Quantifizierung von M &amp; M-Methode. </li><li> Nehmen Sie das Inokulum der Freiwilligen Ernennung und nach Beimpfen die Freiwilligen, wiederholen Sie die Quantifizierung im Labor. Das Röhrchen mit dem Datum und Inokulum Dosis und bei -80 ° C. </li><li> Um die Konsistenz Inokulation bis Inokulation zu gewährleisten, ist es wichtig, die gleichen Pipetten und engagierten Laborgeräte jedes Mal verwenden. </li></ol> 4. Impfung <ol><li> Freiwillige sollten bequem in einem halb liegende Position sitzen. </li><li&gt; Mit einem P200 Pipette und Sterilfilter Tipps auszuarbeiten 100 ul des Inokulums und die Spitze nur innerhalb der Nasenhöhle. </li><li> Langsam vertreiben das Inokulum auf die Nasenschleimhaut mit einer kreisförmigen Bewegung. </li><li> Entscheidend ist, dass die Pipettenspitze nicht in Kontakt mit der Nasenschleimhaut kommen als Störung der Integrität des Epithels könnte in den Bakterien in die Blutbahn führt. </li><li> Es ist auch wichtig, dass das Inokulum nicht zu weit nach hinten oder platziert wird es laufen in den Rachen, es sollte in der Nasenhöhle befinden. </li><li> Wiederholen Sie dies für die anderen Nasenloch. </li><li> Haben die Freiwilligen in der halb liegende Position bleiben für 10 min ohne Sniffing oder Schneuzen. Diese Zeit ist notwendig, um die Bakterien durch die Schleimhaut zu dispergieren. </li></ol> 5. Überwachung <ol><li> Volunteers werden täglich nach der Impfung überwacht. Dies beinhaltet eine tägliche SMS von den Freiwilligen die Ermittler vor 02.00 Uhr gesendet. </li><li> Wenn der Text is nicht empfangen um 2 Uhr die Freiwillige kontaktiert wird sein / ihr Wohlbefinden zu gewährleisten. Wenn er / sie nicht reagiert, wird die zugeordnete nächsten Angehörigen kontaktiert, um der Freiwilligen Wohlbefinden zu gewährleisten. </li><li> Freiwillige werden gebeten, auf allen oberen Atemwege Symptome bei jedem Termin berichten. Klinikpersonal fragt die Freiwillige seine / ihre Symptome zu beschreiben und Follow-up keine Beschwerden. </li><li> Die Antibiotika gegeben, um den Freiwilligen sind nur unter drei Umstände berücksichtigt werden, in dem Fall, dass sie krank sind und werden angewiesen, die ihnen von dem Forschungsteam zu nehmen, wenn sie die Durchführung Pneumokokken sind am Ende der Studie, oder wenn sie sich unwohl und unfähig, die Forschungs-Team zu kontaktieren. Der Freiwillige wird ermutigt, diese Notlicht mit ihnen halten zu allen Zeiten während der Studie und wird gebeten, das Forschungsteam auf einer täglichen Basis für die nächsten 7 Tagen kontaktieren. </li><li> Unser Team ist 24/7 erreichbar mit Krankenschwester Kontakt während der Arbeitszeit und zwei Ärzte zur Verfügung von hours. Alle Anfragen werden mit per Telefonanruf und / oder sofortige Überprüfung behandelt. Rückstellungen für unmittelbare, direkte Zulassung zu einer Infectious Disease Abteilung zur Verfügung, wenn nötig. </li></ol> 6. Nasal Wash (NW) Procedure <ol><li> Nasal Waschen (NW) in einem ersten Screening-Visite, sowie 48 Stunden, 7 und 14 Tage nach der Inokulation durchgeführt. Die NW-Methode verwendet wird, aus Naclerio et al. 8 Freiwillige natürlich kolonisiert durch S. pneumoniae sind Inokulation ausgeschlossen und Follow-up. </li><li> Der Freiwillige ist komfortabel und sitzt der Kopf wird wieder 30 ° aus der Senkrechten geneigt. </li><li> Bitten Sie die Freiwilligen einen tiefen Atemzug zu nehmen und halten den Atem an, während schob ihre Zunge nach oben und hinten gegen das Dach des Mundes. Während in dieser Stellung wird der Proband gebeten zu signalisieren, dass sie bereit sind. </li><li> Eine Spritze mit 20 ml Kochsalzlösung gefüllt ist in die vordere Nase Raum eingeführt und 5 ml Kochsalzlösung ausgestoßen wird. Die volunteer dann nach vorne beugt sofort und vertreibt die Flüssigkeit durch Ausatmen schnell durch die Nase in eine Folie Schüssel. </li><li> Diesen Vorgang 3 mal so daß jedes Nasenloch wurde zweimal gewaschen und die vollen 20 ml verwendet wurde. </li><li> Pool alle Proben zusammen in einem Zentrifugenröhrchen und senden an das Labor bei Raumtemperatur für die Verarbeitung. </li></ol> 7. Nasal Wash Verarbeitung <ol><li> Zentrifugation der Proben für 10 min bei 3345 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Speicher als 1 ml Aliquots in beschrifteten Eppendorf-Röhrchen bei -80 ° C. </li><li> Fügen Sie 100 ul StGG Medium 9 zu dem Pellet und gründlich mischen. Sicherstellen, dass das Gesamtvolumen im Rohr an dieser Stelle bestimmt wird. Diese Verdünnung wird bei der Berechnung der CFU eines Wagens positive NW verwendet werden. </li><li> Platte eine 20 ul Tropfen des StGG mit dem resuspendierten Pellets auf einer Agarplatte mit Gentamicin und streifenfrei die gesamte Platte. <ol><li> Wenn die NW ist nach der ImpfungEntfernen Sie 10 ul aus dem StGG mit dem resuspendierten Pellets und Einsatz für bakterielle Quantifizierung durch M &amp; M-Methode. </li></ol></li><li> Hinzufügen 800 ul StGG der NW Rohr und gründlich mischen. </li><li> Platte 25 ul auf eine Agarplatte und 25 ul auf eine Schokolade Agarplatte, Schlieren die gesamte Platte. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden Bakterien in StGG Medium in 2 Kryoröhrchen und bei -80 ° C suspendiert </li><li> Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht in 5% CO 2. </li><li> Die Platten am nächsten Tag für Pneumokokken und andere potenzielle Atemwegspathogene. </li><li> Pneumokokken sind auf Platten durch Kolonie Morphologie identifiziert. Alpha hämolytische Kolonien mit Zeichner Morphologie subkultiviert auf Blut-Agar mit einem Optochin Disc und über Nacht inkubiert. </li><li> Mutmaßlich Pneumokokken Kolonien, Optochin sensitive sind, Gram gefärbt, um Gram positive Diplokokken bestätigen und serotypisiert mit dem Statens Serum Institut Pneumotest-Latex-Kit. </li></ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622(2012).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li>
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<li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash%2C+using+culture+and+PCR%2C+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122(2011).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die EHPC Plattform hat eine Reihe von Verwendungsmöglichkeiten einschließlich der Verwendung als Schleimhaut-Impfstoff-Modell und als Surrogat des Schutzes zum Testen neuer Protein Impfstoffen. Die Methode ist abhängig von einer konsequenten Impfung Technik und hoher Qualität NW. Reproduzierbarkeit kann ein Problem mit dem Inokulum sein. Durch die variable Natur der gefrorenen Aliquots bakteriellen, kann es schwierig sein, die gewünschte Dosis zu replizieren. Eine Halbierung oder Verdoppelung der gewünschte Dosis wird in Reichweite betrachtet. Es ist entscheidend, dass der bakterielle Quantifizierung erfolgt unmittelbar vor-und nach der Inokulation werden, um genau zu bestimmen Quantifizierung der Bakterien durch CFU Zählung. Aus diesem Grund kann es hilfreich sein, wenn freiwillige Termine gleichzeitig auftreten, so dass nur ein Inokulum vorbereitet zu werden brauchen und die Quantifizierung plating getan vor und nach der Impfung geschieht nicht mehr als 30 min auseinander. Die NW Methode erfordert die Kooperationration der Freiwilligen und würde nicht eine ideale Methode bei Kindern. Wenn die Ausbeute beträgt weniger als 5 ml, kann das Verfahren wiederholt, wobei bis zu einem zusätzlichen 20 ml enthält. Prothesenträger können reduzieren die NW Ausbeute. Wenn die Freiwillige hat eine blockierte / verstopfte Nase und die Salzlösung wird knapp vorne nach dem Einsetzen, blasen die Nase, die Spritze ein wenig weiter zurück, und neigen Sie den Kopf nach hinten mehr, wenn nötig. Die NW ist eine Technik, die besser mit der Praxis kommt. Einige Volumen wird in der Regel verloren, so ist das Ziel für eine Rückkehr von mindestens 10 ml werden. Wenn die Freiwillige kann Kochsalzlösung während der NW schmecken dann wird die Verbindung zwischen dem hinteren Nasopharynx und Oropharynx wurde nicht ausreichend von den ehrenamtlichen Zunge geschlossen. Wenn die Freiwillige schluckt die meisten der Saline, erklären den Vorgang erneut, betont das Schieben der Zunge gegen den Gaumen. Dann wiederholen Sie den Vorgang, um die Lautstärke zu erhöhen zurückgegeben. Wenn die NW enthält eine substantial Menge Schleim, ist es am besten, um es vor der Zentrifugation zu entfernen. Vortex die Probe, um alles, was an den Schleim gebunden werden könnten und dann zu entfernen, wie viel von den großen Stücken wie möglich beim Entfernen so wenig wie möglich Kochsalzlösung lockern. Eine vorherige EHPC Studie in den USA wurde sicher und abgeschlossen hatten keine unerwünschten Ereignisse 11. Um die Fortsetzung Sicherheit des EHPC Plattform zu gewährleisten, haben wir eine Notfall-Protokoll, das rund 24 Stunden Zugriff auf das Research-Team der Basis eingestellt ist. Volunteers sind Ansprechpartner zur Verfügung, so dass sie dem Forschungsteam Zugang 24 Stunden am Tag. Jede medizinische Versorgung benötigt wird in der Royal Liverpool University Hospital zur Verfügung gestellt. Als weitere Maßnahme zum Schutz erhält ein Sicherheits-Komitee, bestehend aus Klinikern und Wissenschaftlern von außerhalb der Arbeitsgruppe eine wöchentliche Sicherheitsbericht. Der Bericht enthält die bakteriellen Dosis jeder Freiwillige erhielten und ob irgendwelche Symptome oder Krankheit gemeldet wurden. Dieser Bericht ermöglicht die Sicherheit von the Studie extern ohne Voreingenommenheit kritisiert werden. Der Sicherheitsausschuss sind auch 24 Stunden am Tag in dem unwahrscheinlichen Fall eines Notfalls.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fischer </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0,9% Natriumchlorid </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Magermilchpulver </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Trypton-Soja-Brühe </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Columbia-Agar mit chocolated Pferdeblut </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-Latex-Kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimentelle menschliche pneumokokken carriage

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentelle menschlichen Pneumokokken Schlitten (EHPC) ist wissenschaftlich wichtig, weil nasopharyngealen Streptococcus pneumoniae ist sowohl die wichtigste Quelle der Übertragung und die Voraussetzung der invasiven Erkrankungen. Ein Modell des Wagens ermöglicht die genaue Bestimmung der immunologischen Korrelate des Schutzes, die Immunisierung Wirkung des Wagens und die Wirkung der Host Druck auf die Erreger im Nasen-Rachen-Nische. Weitere, Methoden der Schlittenerfassungselements nützlich in epidemiologischen Studien, einschließlich Impfstoff-Studien, verglichen werden können. Ziel Wir streben eine EHPC Plattform, die eine sichere und nützliche reproduzierbare Methode, die down-select Kandidat Roman Pneumokokken-Impfstoffe mit Prävention des Wagens könnte als Surrogat des Impfstoffs induzierte Immunität verwendet wird, zu entwickeln. Es wird zur Prüfung von Impfstoffkandidaten und Beschreibungen der Mechanismen EHPC und Impfstoff Schutz vor Carria arbeitenge 1. Aktuelle Konjugat-Impfstoffe gegen Pneumokokken Schutz von Kindern vor invasiven Erkrankungen, obwohl neue Impfstoffe werden dringend benötigt, da der aktuelle Impfstoff nicht verleihen, hat einen optimalen Schutz gegen nicht-bakteriämische Pneumonie und es hat Beweise vom Serotyp Austausch mit Nicht-Impfstoff-Serotypen 2-4. Verfahren Wir impfen mit S. pneumoniae suspendiert in 100 ul Kochsalzlösung. Sicherheit ist ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung der EHPC Modell und wird durch intensive Freiwilligen Screening und Überwachung erreicht. Ein Sicherheits-Komitee, bestehend aus Klinikern und Wissenschaftlern, die unabhängig von der Studie sind bietet objektive Rückmeldung auf einer wöchentlichen Basis. Die bakterielle Inokulum ist standardisiert und erfordert, dass keine tierischen Produkte in Freiwilligen (Pflanzenöl-basierte Medien und Kochsalzlösung) sind geimpft. Die Dosen für die Besiedelung (10 4 -10 5) erforderlich sind viel niedriger than die in Tiermodellen (10 7) 5. Erfassen Pneumokokken Schlitten durch ein hohes Volumen (idealerweise&gt; 10 ml) ergänzt Nasenspülflüssigkeit relativ Schleim frei ist. Dieses Protokoll wird mit den wichtigsten Teilen der Protokoll nacheinander behandeln. Dies sind (a) Freiwillige Auswahl, (b) Pneumokokken Inokulumzubereitung, (c) Impfung, (d) Follow-up und (e) die Beförderung Erkennung. Ergebnisse Unsere aktuellen Protokoll wurde in über 100 Freiwilligen sicher in einem Bereich von Dosen mit zwei verschiedenen bakteriellen Serotypen 6. Eine Dosisfindungsstudie mit S. pneumoniae 6B und 23F wird derzeit durchgeführt, um die optimale Impfdosis für 50% Beförderung zu bestimmen. Ein vorhergesagter Satz von 50% des Wagens wird es der EHPC Modell hohe Empfindlichkeit für die Wirksamkeit des Impfstoffes mit kleinen Studie Zahlen haben.

Wir haben Erfahrung Impfen 159 Menschen, von denen 35 wurden Pneumokokken durchgeführt. Die niedrigste Dosis erreichten wir Wagen mit über Serotyp 6B war 11.100 CFU/100 ul pro Nasenloch, die höchste Dosis betrug 313.000 CFU/100 ul pro Nasenloch. Die niedrigste Dosis erreichten wir Wagen mit über Serotyp 23F war 9.000 CFU/100 ul pro Nasenloch, die höchste Dosis betrug 84.500 CFU/100 ul pro Nasenloch. Unsere Methode der Beförderung Assessment ist eine Nasenspülung gewählt, weil eine aktuelle Studie 10 zeigten, dass 91% der Freiwilligen Nasenspülung sich als komfortabler als Nasen-Rachen-Abstrich, der Nasenspülung war auch eher Krankheitserreger mit mikrobiologischen Kultur erkennen. Mikrobiellen Flora auf Blutagar Platten mit NW beimpft erholt variabel sein kann und schwer zu lesen. Gentamicin ist auf der ersten Blutagarplatte verwendet, um für Pneumokokken ausgewählt. Die Schokoladen-Agar Platte und die zweite Blutagarplatte werden verwendet, um andere mögliche respiratorischen Weg detektierenOgens, die helfen oder behindern Pneumokokken Kolonisierung kann. Ein Beispiel für eine Agarplatte mit NW beimpft, die leicht zu lesen ist, ist in Abbildung 1a gezeigt; eine schwierige Platte mit zahlreichen Arten der Flora ist in Abbildung 1b gezeigt. Bei jeder Bestellung Freiwilligen wurden gebeten, alle oberen Atemwege Symptome zu beschreiben, falls vorhanden, und Vergleiche zwischen den Trägern und nicht-Träger wurden markiert. Von den 145 Menschen vor kurzem mit Pneumokokken geimpft, beschwerte 28 von Symptomen (Tabelle 1). Acht von ihnen waren Träger, 20 waren es nicht. Die häufigsten Symptome waren unspezifisch nasale Symptome (Tabelle 1). Von den Fällen, in denen systemischen Symptomen wie Fieber und / oder Unwohlsein gemeldet wurden, zeigte keine der durchgeführten Untersuchungen Beweise für Pneumokokken-Erkrankungen und Symptome waren konsistent mit gleichzeitiger Virusinfektion außer in einem Fall einer Mandelentzündung. Zwei Pneumokokken positive Freiwilligen wurden mit Antibiotika behandelt. Einer beklagte Halsschmerzen und Ohrenschmerzen und nach einem Treffen mit dem Studium Arzt, wurde geraten, Antibiotika als Vorsichtsmaßnahme. Die anderen Freiwilligen wurde klinisch mit Mandelentzündung diagnostiziert. Alle Freiwilligen hatten rasche Rückbildung der Symptome. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Abbildung 1. Blutagarplatte mit NW inokuliert. Blut-Agarplatten mit NW inokuliert können schwierig zu lesen. 1a ist ein Beispiel einer Platte, die leicht mit Pneumokokken deutlich sichtbar zu lesen. 1b ist eine Platte mit vielen Co-besiedelnder Pflanzen so dass es schwer zu erkennen, wenn Pneumokokken vorliegt. <table border="1"><tbody><tr><td> Symptome </td><td></td><td> Carriage (n = 32) </td><td> Kein Carriage (n = 112) </td></tr><tr><td> AlleSymptome </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Systemisch </td><td> Fieber </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> Malaise * </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Lokal </td><td> Ears </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nase </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Kehle </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Charakterisierung von Freiwilligen berichteten Symptome nach S. pneumoniae 6B Impfung. Alle Beschwerden wurden von der externen Sicherheits-Ausschuss überprüft und nach der vollständigen Untersuchungen wurden keine Symptome Pneumokokken-Erkrankungen zugeschrieben. Die häufigsten Symptome waren Halsschmerzen, verstopfte Nase und Grippe-ähnliche Erkrankung.

Experimentelle menschlichen Pneumokokken Wagen bietet ein natürliches Vorbild des Wagens und ein mögliches Modell für den Einsatz in der Entwicklung von Impfstoffen. Diese Technik ist wertvoll und doch komplex und beinhaltet klinisches Risiko durch die Einführung eines Erregers in einem Menschen. Wir haben ein detailliertes Protokoll entwickelt.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, einen experimentellen Pneumokokken-Transport beim Menschen zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bakterien im Inokulum verdünnt und quantifiziert werden. Im zweiten Schritt wird der Proband intranasal mit Streptococcus pneumoniae geimpft.Als nächstes wird der Freiwillige an den Tagen zwei, sieben und 14 nach der Impfung einer Nasenspülung unterzogen. Schließlich wird die klassische Mikrobiologie verwendet, um festzustellen, ob der Freiwillige den geimpften Occus trägt. Letztendlich kann mit dieser sicheren und reproduzierbaren Methode ein experimenteller menschlicher Pneumokokkentransport gewonnen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden murinen Transportmodellen besteht darin, dass diese Technik ein Modell der Beförderung im natürlichen Wirt des Pneumokokkens, dem Menschen, bietet. Darüber hinaus kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pneumokokken zu beantworten, z. B. was sind die immunologischen Korrelate des Schutzes? Was ist die immunisierende Wirkung der Übertragung, und wie wirkt sich der Wirtsdruck auf den Erreger in der nasopharyngealen Nische aus?Zu den Anwendungen dieser Technik gehört ihre Verwendung als Methode zur Selektion neuartiger Pneumokokken-Impfstoffe. Wir planen, die Verhinderung der Beförderung als Ersatz für die impfstoffinduzierte Immunität zu nutzen. Schwester Angie Wright und der leitende Krankenpfleger David Shaw werden die klinische Technik vorführen.30 Minuten vor dem geplanten Impftermin für Freiwillige wird ein Inokulum-Vorratsröhrchen aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank entnommen. Schleudern Sie dann das Tho-Inokulum in einer Mikrozentrifuge drei Minuten lang mit 17.000 Mal herunter. G, während sich das Röhrchen dreht, erwärmen Sie einige Blutagarplatten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.Entfernen Sie dann das Brühesatt aus dem Zentrifugeninokulum und waschen Sie das Pellet in einem Milliliter Kochsalzlösung. Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschschritt. Führen Sie ein Verdünnungsset für die gewünschte Inokulumkonzentration durch und quantifizieren Sie dann die Menge der Bakterien im Inokulum mit einer Miles-and-Misra-ähnlichen Methode.Die ausgewachsenen Völker werden am nächsten Tag sichtbar. Bringen Sie das Inokulum zum Freiwilligen, der bequem in einer halb liegenden Position sitzen sollte. Anschließend mit einem Perpe P 200 und sterilen Filterspitzen.Ziehen Sie 100 Mikroliter des Inokulums in die Perpe-Spitze und führen Sie die Spitze direkt in die Nasenhöhle ein. Stoßen Sie das Inokulum langsam mit kreisenden Bewegungen auf die Nasenschleimhaut aus. Platzieren Sie die Pipettenspitze nicht zu weit nach hinten, da sonst das Inokulum den Rachen hinunterläuft.Wiederholen Sie die Impfung für die anderen Naris, um zu verhindern, dass Bakterien in den Blutkreislauf gelangen. Achten Sie darauf, die Schleimhaut nicht mit der Pipette zu stören. Lassen Sie den Freiwilligen dann 10 Minuten lang in der halb liegenden Position bleiben, damit sich die Bakterien über die Schleimhaut verteilen können.Nachdem Sie den Probanden das Inokulum verabreicht haben, wiederholen Sie die bakterielle Quantifizierung im Labor. Beschriften Sie dann das Röhrchen mit dem Datum und der Inokulumdosis und lagern Sie das Inokulum bei minus 80 Grad Celsius. Bevor Sie mit der Nasenspülung beginnen, lassen Sie den Freiwilligen bequem mit dem Kopf um 30 Grad nach hinten geneigt sitzen.Lassen Sie den Freiwilligen dann tief einatmen und anhalten, während er die Zunge nach oben und hinten gegen den Gaumen drückt. Lassen Sie den Freiwilligen signalisieren, wenn diese Position erreicht ist. Waschen Sie nun die Nasenhöhle viermal mit 20 Millilitern Kochsalzlösung und geben Sie jeweils fünf Milliliter der Kochsalzlösung in den vorderen Nasenraum ab.Lassen Sie den Freiwilligen sich sofort nach vorne lehnen und schnell durch die Nase in eine Folienschüssel ausatmen, um die Flüssigkeit nach jeder Fünf-Milliliter-Kochsalzlösung auszustoßen. Nachdem Sie die Nasenhöhle mit den vier 20 Millilitern gewaschen haben, ziehen Sie alle gesammelten Proben in einem Zentrifugenröhrchen zusammen. Zentrifugieren Sie nun die freiwilligen Nasenwaschproben für 10 Minuten bei 3.345 mal G. Entfernen Sie das Supinat und lagern Sie es als ein Milliliter Aliquote in markierten Einor-Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius.Geben Sie 100 Mikroliter STGG-Medium in das Pellet und mischen Sie es gründlich und bestimmen Sie dann das Gesamtvolumen im Rohr. Auf der nächsten Platte wird ein 20-Mikroliter-Tropfen des resuspendierten Pellets auf eine Blutagarplatte mit Gentamycin gegeben und die gesamte Platte durchstrichen. Wenn die Nasenspülung nach der Inokulation erfolgt, verwenden Sie 10 Mikroliter des STGG, das das resuspendierte Pellet enthält.Für die bakterielle Quantifizierung nach der Miles- und Misra-Methode geben Sie weitere 800 Mikroliter STGG in das Nasenwaschrohr und mischen Sie es gründlich. Dann gibst du 25 Mikroliter der STGG-Bakterienzelllösung auf eine andere Blutagarplatte und 25 Mikroliter auf eine Schokoladenagarplatte, wobei du die Gesamtheit beider Platten durchstreichst. Anschließend frieren Sie die restlichen Bakterien in zwei Kryo-Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius ein.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht in 5% Kohlendioxid. Untersuchen Sie am nächsten Tag die Platten auf Pneumokokken und andere potenzielle Krankheitserreger der Atemwege. Blutagarplatten, die mit Nasenspülungen geimpft wurden, können schwer zu lesen sein.Dieses Bild zeigt das Beispiel einer gut lesbaren Platte, auf der die Pneumokokken deutlich sichtbar sind. Diese Platte enthält jedoch viele co-besiedelnde Pflanzen, was es schwieriger macht, bei jedem Termin festzustellen, ob Pneumokokken anwesend sind. Die Freiwilligen wurden gebeten, etwaige Symptome der oberen Atemwege zu beschreiben, falls vorhanden, und der Vergleich zwischen Trägern und Nicht-Trägern wurde hervorgehoben.Von den 145 Personen, die kürzlich mit Pneumokokken geimpft wurden, klagten 28 über Symptome, die in dieser Tabelle zusammengefasst sind. Acht dieser Freiwilligen waren Träger, 20 nicht. Alle Beschwerden wurden vom externen Sicherheitsausschuss und im Anschluss an umfassende Untersuchungen geprüft.Es wurden keine Symptome auf eine Pneumokokken-Erkrankung zurückgeführt. Die häufigsten Symptome waren Halsschmerzen, verstopfte Nase und grippeähnliche Erkrankungen. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, einen sehr gründlichen Sicherheitsplan zu haben, der jeden Schritt der Methode abdeckt, insbesondere für die Sicherheit der Freiwilligen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine experimentelle Pneumokokken-Beförderung beim Menschen etabliert und die Beförderung mit einer Nasenspülung nachweist.

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Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

In-vitro-Assays können verwendet werden, um die Einhaltung der Befestigung von Streptococcus pneumoniae zu untersuchen, um die Zellmonoschichten epithelialen und mögliche Maßnahmen wie der Einsatz von Probiotika zur Hemmung Pneumokokken-Kolonisierung zu untersuchen.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

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Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Eine Methode zur Feststellung von Lungeninfektionen bei immunkompetenten Nagetieren wird beschrieben. Mit Kompetenz kann diese Methode schnell und einfach durchgeführt werden, um eine stabile Infektion mit vielen Isolaten von S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae und A. baumannii zu induzieren.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

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Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.

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Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Erfahren Sie, wie Sie eine experimentelle Pneumokokken-Besiedlung beim Menschen etablieren. Diese Methode nutzt intranasale Inokulation von Streptococcus pneumoniae und Nasenspülungen zur Überwachung. Sie ermöglicht die Untersuchung immunologischer Schutzmechanismen und unterstützt die Entwicklung neuer Impfstoffe.

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

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