Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Ziel dieses Verfahrens ist es, einen experimentellen Pneumokokken-Transport beim Menschen zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Bakterien im Inokulum verdünnt und quantifiziert werden. Im zweiten Schritt wird der Proband intranasal mit Streptococcus pneumoniae geimpft.

Als nächstes wird der Freiwillige an den Tagen zwei, sieben und 14 nach der Impfung einer Nasenspülung unterzogen. Schließlich wird die klassische Mikrobiologie verwendet, um festzustellen, ob der Freiwillige den geimpften Occus trägt. Letztendlich kann mit dieser sicheren und reproduzierbaren Methode ein experimenteller menschlicher Pneumokokkentransport gewonnen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden murinen Transportmodellen besteht darin, dass diese Technik ein Modell der Beförderung im natürlichen Wirt des Pneumokokkens, dem Menschen, bietet. Darüber hinaus kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pneumokokken zu beantworten, z. B. was sind die immunologischen Korrelate des Schutzes? Was ist die immunisierende Wirkung der Übertragung, und wie wirkt sich der Wirtsdruck auf den Erreger in der nasopharyngealen Nische aus?

Zu den Anwendungen dieser Technik gehört ihre Verwendung als Methode zur Selektion neuartiger Pneumokokken-Impfstoffe. Wir planen, die Verhinderung der Beförderung als Ersatz für die impfstoffinduzierte Immunität zu nutzen. Schwester Angie Wright und der leitende Krankenpfleger David Shaw werden die klinische Technik vorführen.

30 Minuten vor dem geplanten Impftermin für Freiwillige wird ein Inokulum-Vorratsröhrchen aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank entnommen. Schleudern Sie dann das Tho-Inokulum in einer Mikrozentrifuge drei Minuten lang mit 17.000 Mal herunter. G, während sich das Röhrchen dreht, erwärmen Sie einige Blutagarplatten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Entfernen Sie dann das Brühesatt aus dem Zentrifugeninokulum und waschen Sie das Pellet in einem Milliliter Kochsalzlösung. Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschschritt. Führen Sie ein Verdünnungsset für die gewünschte Inokulumkonzentration durch und quantifizieren Sie dann die Menge der Bakterien im Inokulum mit einer Miles-and-Misra-ähnlichen Methode.

Die ausgewachsenen Völker werden am nächsten Tag sichtbar. Bringen Sie das Inokulum zum Freiwilligen, der bequem in einer halb liegenden Position sitzen sollte. Anschließend mit einem Perpe P 200 und sterilen Filterspitzen.

Ziehen Sie 100 Mikroliter des Inokulums in die Perpe-Spitze und führen Sie die Spitze direkt in die Nasenhöhle ein. Stoßen Sie das Inokulum langsam mit kreisenden Bewegungen auf die Nasenschleimhaut aus. Platzieren Sie die Pipettenspitze nicht zu weit nach hinten, da sonst das Inokulum den Rachen hinunterläuft.

Wiederholen Sie die Impfung für die anderen Naris, um zu verhindern, dass Bakterien in den Blutkreislauf gelangen. Achten Sie darauf, die Schleimhaut nicht mit der Pipette zu stören. Lassen Sie den Freiwilligen dann 10 Minuten lang in der halb liegenden Position bleiben, damit sich die Bakterien über die Schleimhaut verteilen können.

Nachdem Sie den Probanden das Inokulum verabreicht haben, wiederholen Sie die bakterielle Quantifizierung im Labor. Beschriften Sie dann das Röhrchen mit dem Datum und der Inokulumdosis und lagern Sie das Inokulum bei minus 80 Grad Celsius. Bevor Sie mit der Nasenspülung beginnen, lassen Sie den Freiwilligen bequem mit dem Kopf um 30 Grad nach hinten geneigt sitzen.

Lassen Sie den Freiwilligen dann tief einatmen und anhalten, während er die Zunge nach oben und hinten gegen den Gaumen drückt. Lassen Sie den Freiwilligen signalisieren, wenn diese Position erreicht ist. Waschen Sie nun die Nasenhöhle viermal mit 20 Millilitern Kochsalzlösung und geben Sie jeweils fünf Milliliter der Kochsalzlösung in den vorderen Nasenraum ab.

Lassen Sie den Freiwilligen sich sofort nach vorne lehnen und schnell durch die Nase in eine Folienschüssel ausatmen, um die Flüssigkeit nach jeder Fünf-Milliliter-Kochsalzlösung auszustoßen. Nachdem Sie die Nasenhöhle mit den vier 20 Millilitern gewaschen haben, ziehen Sie alle gesammelten Proben in einem Zentrifugenröhrchen zusammen. Zentrifugieren Sie nun die freiwilligen Nasenwaschproben für 10 Minuten bei 3.345 mal G. Entfernen Sie das Supinat und lagern Sie es als ein Milliliter Aliquote in markierten Einor-Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius.

Geben Sie 100 Mikroliter STGG-Medium in das Pellet und mischen Sie es gründlich und bestimmen Sie dann das Gesamtvolumen im Rohr. Auf der nächsten Platte wird ein 20-Mikroliter-Tropfen des resuspendierten Pellets auf eine Blutagarplatte mit Gentamycin gegeben und die gesamte Platte durchstrichen. Wenn die Nasenspülung nach der Inokulation erfolgt, verwenden Sie 10 Mikroliter des STGG, das das resuspendierte Pellet enthält.

Für die bakterielle Quantifizierung nach der Miles- und Misra-Methode geben Sie weitere 800 Mikroliter STGG in das Nasenwaschrohr und mischen Sie es gründlich. Dann gibst du 25 Mikroliter der STGG-Bakterienzelllösung auf eine andere Blutagarplatte und 25 Mikroliter auf eine Schokoladenagarplatte, wobei du die Gesamtheit beider Platten durchstreichst. Anschließend frieren Sie die restlichen Bakterien in zwei Kryo-Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius ein.

Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht in 5% Kohlendioxid. Untersuchen Sie am nächsten Tag die Platten auf Pneumokokken und andere potenzielle Krankheitserreger der Atemwege. Blutagarplatten, die mit Nasenspülungen geimpft wurden, können schwer zu lesen sein.

Dieses Bild zeigt das Beispiel einer gut lesbaren Platte, auf der die Pneumokokken deutlich sichtbar sind. Diese Platte enthält jedoch viele co-besiedelnde Pflanzen, was es schwieriger macht, bei jedem Termin festzustellen, ob Pneumokokken anwesend sind. Die Freiwilligen wurden gebeten, etwaige Symptome der oberen Atemwege zu beschreiben, falls vorhanden, und der Vergleich zwischen Trägern und Nicht-Trägern wurde hervorgehoben.

Von den 145 Personen, die kürzlich mit Pneumokokken geimpft wurden, klagten 28 über Symptome, die in dieser Tabelle zusammengefasst sind. Acht dieser Freiwilligen waren Träger, 20 nicht. Alle Beschwerden wurden vom externen Sicherheitsausschuss und im Anschluss an umfassende Untersuchungen geprüft.

Es wurden keine Symptome auf eine Pneumokokken-Erkrankung zurückgeführt. Die häufigsten Symptome waren Halsschmerzen, verstopfte Nase und grippeähnliche Erkrankungen. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, einen sehr gründlichen Sicherheitsplan zu haben, der jeden Schritt der Methode abdeckt, insbesondere für die Sicherheit der Freiwilligen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine experimentelle Pneumokokken-Beförderung beim Menschen etabliert und die Beförderung mit einer Nasenspülung nachweist.