Name: Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-27T08:54:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie eine nicht-invasive Methode zur Evaluation von Myoblastentransplantationen mittels Reportergen-Ansatz und Biolumineszenz-Imaging. Diese Technik nutzt ein Tri-Fusions-Reportergen zur Verfolgung transplantierter Zellen in vivo.

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Die Autoren möchten Sanjiv Gambhir für das Geschenk des fluc/mrfp/sr39tk Reportergen danken. Diese Arbeit wurde von The Stem Cell Network (SCN) von Kanada und des Jesse Journey Foundation finanziert.

Ein. Erhaltung und Vermehrung der C2C12 Myoblasten <ol><li> Platte C2C12 Myoblasten in einem 75 cm 2-Kolben und aufrechtzuerhalten Zellen in hohen Glucose Dulbeccos modifiziertes Eagle-Serum (HG-DMEM) mit fötalem Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von 10% ergänzt. Lassen Sie keine Zellen zu jederzeit konfluent, da dies die myoblastic Bevölkerung erschöpfen werden. . Immer warm mittel-bis 37 ° C in einem Wasserbad vor dem Gebrauch: Medium sollte jeden zweiten Tag Hinweis geändert werden. </li><li> Wenn Myoblasten ca. 80% konfluent geworden, Passage-Zellen zu einer neuen Flasche. Absaugen Kulturmedium. Waschen der Zellen mit 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), um alle Spuren von Kulturmedium, die Trypsin-hemmende Serum enthält entfernen. Kurz spülen Zellschicht mit 2-3 ml 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA-Lösung, um die adhärenten Myoblasten aus dem Kolben zu trennen. Absaugen Trypsin und Ort Kolben in Brutschrank bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Während dieser Inkubationtion, bereiten Sie einen neuen Kolben mit 9 ml HG-DMEM/10% FBS-Medium. Nach Trypsinisierung 10 ml Vollmedium zu den Zellen und Pipette 4-5 mal die Sammlung aller Zellen in dem Medium zu gewährleisten. 1 ml der Zellsuspension auf die neue Kolben und inkubieren in 5% CO 2 bei 37 ° C. </li></ol> 2. C2C12 Zelltransfektion <ol><li> Sobald Zellen haben 50% Konfluenz erreicht, transfizieren nach den Anweisungen des Herstellers von Invitrogen. Kurz gesagt, verbinden 90 ul Lipofectamin 2000 Reagenz mit 4,5 ml OPTI-MEM-Medium. In einem anderen Rohr verbinden 36 ug CMV-trifusion Reportergen DNA mit 4,5 ml OPTI-MEM. Flick jedes Rohr zu kombinieren und zu warten, 5 min. Kombinieren Inhalt beider Rohre, vorsichtig mischen und Inkubieren bei Raumtemperatur für genau dreißig Minuten. Hinweis: In einem zweiten Kolben sollten auch für nicht transfizierte Zellen eingestellt werden, dass nur empfangen Lipofectamin und OPTI-MEM, um als Negativkontrolle zu dienen. </li><li> Entfernen Medium von C2C12 Zellen und fügen 15,5ml frisches HG-DMEM/10% FBS-Medium. Fügen Transfektionsmedium zum Gesamtvolumen auf 20 ml zu bringen. </li><li> Erlauben Zellen über Nacht transfizieren für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag absaugen Transfektionsmedium und 10 ml HG-DMEM/10% FBS. </li><li> Sehen Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Erfassen sowohl Hellfeld und rote Fluoreszenz Bilder (mit einem TRITC-Filter cube; mRFP ex / em: 584/607 nm). Zähle die Anzahl der RFP-exprimierenden Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop durch die Gesamtzahl der Zellen unter Hellfeld für mehrere Felder der Blick auf die Transfektionseffizienz zu generieren angesehen unterteilt angesehen. </li></ol> 3. Assessment of Cell Survivability / MTT Assay <ol><li> Einen Tag vor der Transfektion Platte 1x10 5 C2C12 Zellen in jedem Well in einer 24-Well-Platte. Zellen sollten in 500 ul Volumen in HG-DMEM/10% FBS ausplattiert. </li><li> Am nächsten Tag transfizieren Myoblasten über Nacht wie zuvor beschrieben. Herstellerangaben Vorschläge für die Transfektion Reagent-Volumes für eine 24-Well-Platte. Inkubieren eines Satzes von Vertiefungen mit Lipofectamin durch (keine DNA) als Kontrolle. Sehen Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass ordnungsgemäße Transfektion aufgetreten. </li><li> Entfernen Transfektionsmedium und inkubieren Myoblasten mit 5 mg / ml Thiazolyl Blau tetrazoliumbromid (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Hinzufügen D-Luciferin zu acht der transfizierten Brunnen, und Inkubieren bei 37 ° C für vier Stunden. </li><li> Entfernen Medium aus Brunnen. Solubilisierung blauen Formazan Kristalle durch Zugabe von 180 ul Isopropanol in jede Vertiefung. Schütteln bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Vermeidung jeglicher Niederschlag, Pipette Lösung in eine 96-Well-Platte und Extinktion bei 575 nm auf. </li></ol> 4. Herstellung von Myoblasten für Transplant <ol><li> Entfernen Medium, waschen Myoblasten mit HBSS und trypsinieren Zellen wie in 1,1 skizziert. </li><li> Resuspendieren Zellen in 4 ml vollständigem Medium. </li><li> Mit einem Hämocytometer zählen Zellen Bände mit 10 6 Myoblasten zu generieren. Pipette volume in sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße. Mit einer Transfektionseffizienz von ~ 10%, geben diese Werte dass 100.000 Luciferase-exprimierenden Zellen werden auf der GE ExploreOptix Scanner nach der Transplantation nachweisbar. </li><li> Erreiche endgültigen Injektionsvolumen von 15 ul, mit 10 6 C2C12 Zellen. Wenn nötig, zentrifugieren Mikroröhrchen bei 2.000 rpm für 1 Minute. Vorsichtig absaugen Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Zellen in 15 ul HG-DMEM fehlt FBS. </li></ol> 5. Zellimplantation <ol><li> Anesthetize Maus mit 2% Isofluran / 2% O 2. Pluck Haare aus dem dorsalen Hinterbein Bereich. Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5% Isofluran / 2% O 2. </li><li> Stellen Sie sicher, C2C12 Myoblasten sind gut aufgehoben. Mit der Maus in Bauchlage, verlängern die Hinterbein und verwenden Sie eine Insulinspritze, Zellen direkt in den seitlichen Kopf des M. gastrocnemius bei einem Winkel von 30 ° zu injizieren. Injizieren transfizierten Myoblasten in den rechten hinteren Extremität und untransfizierten Myoblasten into die Gegenseite (links) Hinterbein. </li><li> Führen Sie eine Baseline Biolumineszenz-Scan: Schnell zu übertragen Maus auf die Bühne in der optischen Scanner, legen Sie die Maus in Bauchlage. Schließen Sie das Anästhetikum Linie. Um sicherzustellen, dass die Maus weiterhin betäubt, sollte eine zweite Person anwesend sein, um hook up das Anästhetikum Linie, während die anderen Orte das Tier in den Scanner. </li><li> Gently erweitern das Hinterbein so im Bereich der Injektion sichtbar ist. Band Hinterbeine an Ort und Stelle mit einem sanften Klebstoff wie medizinisches Klebeband. </li><li> Schließen der Kammer und sicherzustellen, daß kein Licht in das Innere des Scanners zuzugreifen, da dies das Hintergrundsignal detektiert erhöhen. Der Scanner sollte die Parameter in Ihrem Anweisungen des Herstellers für Biolumineszenz-Bildgebung enthalten eingestellt werden. Insbesondere ist sicherzustellen, &quot;kein Laser&quot; ausgewählt ist. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) um den gezupften Bereich und Scan starten. </li></ol> 6. Die Injektion von Fluc Substrat, D-Luciferin in mdx-Maus &lt;ol&gt; <li> Während sich die Maus betäubt intraperitoneal injiziert 150 mg / kg der Leuchtkäfer-Luciferase Substrat, D-Luciferin (von 40 mg / ml Stammlösung, bestehend nach den Anweisungen des Herstellers). </li><li> Erholen Maus und erlauben eine 15 min vor der Zubereitung Aufnahmeperiode Maus für die nächste Abtastung. </li></ol> 7. BLI um Luc-exprimierenden MPCs Nach Implant in Mausmodellen der DMD Richten <ol><li> Nach Aufnahme Zeit betäuben Maus wieder, wie in 5.1 beschrieben. </li><li> Übertragen der Maus zurück zu dem optischen Scanner und lassen nochmals Biolumineszenz Abtastung in der gleichen Weise wie der Hintergrund-Scan. </li><li> Obwohl ein 20 min Aufnahmeperiode maximale Signalstärke bieten sollte, kann bei einer späteren Untersuchung durchgeführt werden. </li><li> Nach Abschluss der Bildaufnahme, opfern die Maus nach den Richtlinien von Ihrem Institutional Animal Ethics Committee und des Canadian Council on Animal Care (CCAC) eingestellt. Isolieren Hinterbein Muskeln und unmittelbar in 10% Formalin für Paraffin Einbettung beheben. Führen Immunhistochemie Färbung für Luciferase intramuskuläre Injektion von Myoblasten zu bestätigen. </li></ol>

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<li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li>
</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie haben wir eine schnelle und zuverlässige molekulare Bildgebung, Reportergen Ansatz zur nicht-invasiven Ziel Myoblasten / MPCs beschrieben nach der Transplantation. Während diese Studie demonstriert die kurzfristige Lokalisierung von transplantierten MPCs über bioluminescense Bildgebung (BLI), der Art, in der Zellen ausgerichtet sind können in der Tat leicht zu einer longitudinalen Beurteilung Engraftment aufgebracht werden, durch die Implantation von Zellen, die stabil exprimieren das ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> C2C12 Myoblasten </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium </td><td> Life Technologies </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> fötales Rinderserum </td><td> Life Technologies </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Life Technologies </td><td> 25200-72 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Life Technologies </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE2000-5 </td><td> Nikon Instruments Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-Luciferin </td><td> PerkinElmer </td><td> 122796 </td><td> 40 mg / ml in PBS </td></tr></tbody></table>

molecular imaging transplantierte muscle progenitor zielzellen

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere, genetisch bedingte neuromuskuläre Erkrankung, die 1 wirkt in 3.500 Jungen und zeichnet sich durch progressiven Muskelschwund 1, 2 gekennzeichnet. Bei Patienten, wird die Fähigkeit der Bewohner Muskel-Satelliten-Zellen (SCs), um beschädigte Muskelfasern regenerieren zunehmend ineffizient 4. Daher ist die Transplantation von Muskel-Vorläuferzellen (MPL) / Myoblasten von gesunden Probanden ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur DMD. Eine wesentliche Einschränkung auf die Verwendung von Stammzelltherapie ist jedoch ein Mangel an zuverlässigen bildgebenden Technologien zur Langzeitüberwachung von implantierten Zellen und zum Auswerten ihrer Wirksamkeit. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Echtzeit-Ansatz, um den Erfolg der Myoblasten Transplantation zu bewerten. Dieses Verfahren nutzt die Vorteile eines einheitlichen Reportergen-Fusion der Gene aus (Firefly Luziferase [fluc], monomere rot fluoreszierendes Protein [mRFP] und sr39 Thymidinkinase [sr39tk]), dessen Expression können mit unterschiedlichen Abbildungsmodalitäten 9, 10 abgebildet werden. Eine Vielzahl von bildgebenden Verfahren, einschließlich Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Kernspintomographie (MRI), optische Bildgebung, und Hochfrequenz 3D-Ultraschall sind nun mit jeweils eindeutigen Vorteile und Einschränkungen 11. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) Studien, zum Beispiel, haben den Vorteil, dass relativ geringen Kosten und hohem Durchsatz. Es ist aus diesem Grund, der in dieser Studie, nutzen wir der Firefly Luziferase (fluc) Reportergen Sequenz innerhalb des Fusionsgens und Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) für die kurzfristige Lokalisierung von lebensfähigen C2C12 Myoblasten enthalten nach der Implantation in eine Maus Modell DMD (Muskeldystrophie auf dem X-Chromosom [mdx] mouse) 12-14. Wichtig ist, bietet BLI uns ein Mittel, um die Kinetik der markierten MPCs nach der Implantation zu prüfen, und wird nützlich sein, um Zellen zu verfolgen wiederholt über time und nach der Migration. Unser Reporter-Gen Ansatz weiter ermöglicht uns, mehrere bildgebende Verfahren in einem einzigen lebenden Subjekt verschmelzen; angesichts der tomographischen Natur, feine räumliche Auflösung und die Fähigkeit zur Skalierung auf bis zu größeren Tieren und Menschen 10,11, wird PET bilden die Grundlage für die künftige Arbeit, dass wir schlagen kann ermöglichen eine schnelle Übersetzung von Methoden in Zellen präklinischen Modellen und klinische Anwendungen entwickelt.

Bei 50-60% Konfluenz, C2C12 Myoblasten wurden vorübergehend mit der oben erwähnte Fusionsprotein Reportergenkonstrukt bestehend aus Glühwürmchen-Luciferase transfiziert [fluc], monomere rot fluoreszierendes Protein [mRFP] und sr39 Thymidinkinase [sr39tk] (Abb. 1A). Die Transfektionseffizienz wurde durch Fluoreszenzmikroskopie (1B, C) ​​berechnet wird, unter Verwendung der in unserer mRFP Sequenz Reporterkonstrukt. Zelle Überlebensfähigkeit wurde nicht...

Ein nicht-invasiver Mittel, um den Erfolg der Transplantation Myoblasten auszuwerten beschrieben. Das Verfahren nutzt ein einheitliches Fusionsprotein Reportergen, dessen Expression von Genen kann mit unterschiedlichen Bildgebungsverfahren abgebildet werden zusammengesetzt. Hier nutzen wir ein<em&gt; Fluc</em&gt; Reporter Gensequenz Zellen über Biolumineszenz-Bildgebung zielen.

Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Erfolg der Myoblastentransplantation mit Hilfe eines Reportergen-Ansatzes und Biolumineszenz-Bildgebung nicht-invasiv zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Trifusionsgen, das f Luke, MRFP und SR drei 90 tk unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert, in die immortalisierte C zwei C 12 Myoblasten-Zelllinie eingeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Anzahl der Myoblasten zu quantifizieren, die das Porter-Gen exprimieren.In dieser Studie wird die Transfektionseffizienz durch Zählen von MRFP-exprimierenden Zellen an einem Fluoreszenzmikroskop berechnet. Als nächstes werden 10 bis fünf manipulierte Zellen mit einem Volumen von 15 Mikrolitern oder weniger intramuskulär in die Hintergliedmaßen von dystrophischen MDX-Mäusen implantiert. UNT-transfizierte Zellen werden als Kontrolle in die kontralaterale Hintergliedmaße implantiert, dann wird ein Baseline-Scan durchgeführt.Der letzte Schritt besteht darin, intraperitoneal das von Luke beschriebene Gensubstrat Lucifer nach einer Aufnahmezeit von etwa 20 Minuten zu injizieren und einen zweiten Biolumineszenz-Scan durchzuführen, um ein Bild der implantierten Zellen zu erhalten. Letztendlich wird die Aufnahme von Luzifer spezifisch in f Luke-exprimierenden Zellen ohne nachweisbare Biolumineszenz in Kontrollzellen beobachtet, die das Berichtsgen nicht exprimieren. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mild-Loss-Transfer-Technologie zu beantworten, wie z. B. die Migration von Zellen nach der Implantation sowie das Überleben von Zellen nach der Transplantation.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Muskelerkrankungen wie der Duchenne-Muskeldystrophie, da sie ein schnelles und zuverlässiges Mittel ist, um Zellen nicht-invasiv zu bekämpfen. Nach der Transplantation können wir so den transplantierten Bereich im Laufe der Zeit beurteilen und den Erfolg oder Misserfolg der Behandlung bewerten. Kelly Gut Pe, eine Doktorandin, und Rebecca Mcg, eine Forschungstechnikerin aus unserem Labor, Entschuldigung, werden das Verfahren demonstrieren, Kultur C zwei C 12 Myoblasten in hohem Glukose-dcos modifiziertes Adlermedium mit 10% fötalem Rinderserum gemäß Standardverfahren für diese Zelllinie. Lassen Sie die Zellen nicht zu mehr als 80 % konfluent werden, da dies die myotische Population erschöpft.Um die Zellen zunächst für die Transfektion vorzubereiten, werden die Zellen aus dem Stammkolben geerntet, indem die HBSS-Spülzellschicht kurz mit Trypsin bedeckt wird. Dann wird das Trypsin schnell abgesaugt und der Kolben für fünf Minuten in den Gewebekultur-Inkubator gelegt. Während der Inkubation werden zwei T 75-Kolben mit je neun Millilitern Nährboden vorbereitet.Wenn die Inkubationszeit abgelaufen ist, geben Sie 10 Milliliter Medium in den Kolben und spülen Sie das Medium vier- bis fünfmal über den Boden des Kolbens, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden. Anschließend wird jeder der T 75-Kolben mit einem Zehntel der Zellsuspension aus dem serienmäßigen T 75-Kolben besiedelt. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, führen Sie einen MTT-Assay durch, um die Wirkung der Zellmarkierung auf das Überleben und die Differenzierung der Zellen sowie die Lebensfähigkeit der manipulierten Myoblasten vor der Transplantation zu beurteilen.Sobald die Zellen eine Konfluenz von 50 % erreicht haben, wird ein T 75-Kolben mit 36 Mikrogramm des CMV-Tri-Fusionsreporter-Gens in einem optimalen Volumen von 4,5 Millilitern unter Verwendung von Lipofectamine 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Zusätzlich wird eine Scheintransfektion des zweiten T 75-Kolbens durchgeführt, wobei nur Lipo 2000 und optimalerweise ohne DNA als Negativkontrolle verwendet wird. Lassen Sie die Zellen am nächsten Tag mindestens 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius transfizieren, aspirieren Sie das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop durch das geeignete Volumen des Kulturmediums.Erfassen Sie sowohl Hellfeld- als auch rote Fluoreszenzbilder, um die Transfektionseffizienz zu berechnen. Nach der Ernte des transfizierten Myoblasten durch Trypsin und Reanimation, bei der die Zellen in vier Millilitern vollständigem Medium suspendiert werden, verwenden Sie ein Hämozytometer, um eine Zellzählung durchzuführen. Pipettieren Sie 10 der sechs Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit einer Transfektionseffizienz von etwa 10 %. Diese Anzahl von Zellen sollte 100.000 nachweisbare Luzifer-Arrays ergeben, die nach der Transplantation Zellen exprimieren, das endgültige Injektionsvolumen sollte 15 Mikroliter betragen.Wenn das Volumen im Röhrchen größer ist, zentrifugieren Sie die Mikroröhrchen eine Minute lang bei 2000 U/min, asatisieren Sie das Supinat und biegen Sie es dann erneut mit einem maximalen Volumen von 15 Mikrolitern Wachstum. Medium ohne FBS Nach Einleitung der Anästhesie bei der Maus mit 2 % Fluor auf 1,5 % Fluor zur Aufrechterhaltung der Anästhesie umstellen. Bringen Sie die Maus während des Eingriffs in Bauchlage und zupfen Sie die Haare aus dem Bereich der hinteren Gliedmaßen.Stellen Sie sicher, dass die C zwei C 12-Myoblasten gut suspendiert sind, und laden Sie dann die Zellsuspension in eine Insulinspritze. Injizieren Sie die Zellen in einem Winkel von 30 Grad direkt in den lateralen Kopf des Magenmuskels. Nach der Injektion von transfizierten Myoblasten in die rechte Hintergliedmaße wiederholen Sie den Vorgang mit UNT-transfizierten Myoblasten in der kontralateralen Hintergliedmaße.Führen Sie einen Basis-Biolumineszenz-Scan durch. Eine Person sollte die Maus schnell auf die Bühne im optischen Scanner bringen und die Maus in Bauchlage bringen. Eine zweite Person schließt gleichzeitig den Narkoseschlauch an, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt bleibt.Strecken Sie die Hintergliedmaßen vorsichtig aus und halten Sie die Gliedmaße mit medizinischem Klebeband an Ort und Stelle, so dass beide Injektionsbereiche sichtbar sind. Schließen Sie die Kammer und stellen Sie sicher, dass kein Licht in das Innere des Scanners eindringen kann, da dies das erkannte Hintergrundsignal erhöht. Der Scanner sollte auf Parameter eingestellt werden, die in den Anweisungen des Herstellers für die Biolumineszenz-Bildgebung enthalten sind.Zeichnen Sie einen interessierenden Bereich um den gezupften injizierten Bereich und starten Sie den Scan, um das Grundbild zu erhalten, während die Maus anästhesiert ist. Intraperitoneal. Injizieren Sie 150 Milligramm pro Kilogramm Glühwürmchen-Luziferase-Substrat Luzifer. Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und lassen Sie sie sich von der Narkose erholen.Warten Sie eine 15-minütige Eingewöhnungsphase, bevor Sie die Maus für den nächsten Scan vorbereiten. Nach der 15-minütigen Aufnahmephase. Betäuben Sie die Maus und übertragen Sie sie wie zuvor auf den Scanner.Führen Sie einen zweiten Lumineszenzscan auf die gleiche Weise wie den Hintergrundscan durch. Die gesamte Aufnahmezeit von 20 Minuten sollte eine maximale Signalintensität bieten, aber auf Wunsch kann ein nachfolgender Scan durchgeführt werden. Dieses Schema zeigt das CMV Tri Fusion Reporterkonstrukt.Das linke Bild zeigt das Hellfeldbild von C zwei C 12-Myoblasten, die mit dem Fusionsreporter-Plasmid transfiziert wurden, und das rechte Bild zeigt die gleiche Region als Fluoreszenzbild wie hier. Es wird ein Bereich von Interesse gezeichnet, der den Bereich der gezupften Hintergliedmaßen umschließt, in den die Myoblasten injiziert wurden. Biolumineszenz wird bei einem Hintergrundscan nicht erkannt.23 Minuten nach der Injektion von Luciferian wird ein klares Signal von der rechten Hintergliedmaße detektiert, wo Luciferase exprimierende Myoblasten injiziert wurden. In der kontralateralen Hintergliedmaße, die mit nicht resezierten Myoblasten injiziert wurde, wird keine Biolumineszenz nachgewiesen. Hier bestätigt die Immunhistochemie mit einem Glühwürmchen-Luciferase-Antikörper die intramuskuläre Implantation von transfizierten C zwei C 12-Zellen.Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, aseptische Gewebekulturtechniken und geeignete Praktiken im Umgang mit Tieren nach seiner Entwicklung anzuwenden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Muskelerkrankungen den Weg, die Wirksamkeit der Zelltherapie vorerst in präklinischen Kleintiermodellen einer Krankheit zu erforschen. Später, im klinischen Umfeld bei Patienten, sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen implantiert und wie man manipulierte transplantierte Myoblasten mithilfe der Biolumineszenz-Bildgebung nicht-invasiv lokalisiert.

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Forschung

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Medicine

Medizin

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Wir beschreiben die Methode der Programmierung Stammzellen zu therapeutischen Angiogenese-Faktoren für Überexpression mit biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikel. Beschriebenen Verfahren umfassen die Polymersynthese, die Transfektion von Fettgewebe abgeleitete Stammzellen in vitro, und die Validierung der Wirksamkeit der programmierten Stammzellen Angiogenese in einem Maushinterlauf-Ischämie-Modell zu fördern.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Radiomarkierung von mesenchymalen Stammzellen von Pferden und deren Implantation in Sehnenverletzungen beim Pferd, um das Zellüberleben und die Gewebeverteilung mittels Gammaszintigraphie zu bestimmen.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Wir beschreiben die intraparenchymale Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen, die mit einem dualen Reportervektor transduziert werden, der Luciferase-grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Gehirn der Maus exprimiert. Nach der Transplantation wird das Luciferase-Signal wiederholt mit In-vivo-Biolumineszenz und GFP-exprimierenden transplantierten Zellen gemessen, die in Hirnschnitten mittels Fluoreszenzmikroskopie identifiziert wurden.

Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und hochdimensionale Analyse von Muskelstamm- und Vorläuferzellen mittels Einzelzell-Massenzytometrie und deren Aufreinigung durch FACS für vertiefte Studien ihrer Funktion. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Regenerationsdynamik in Krankheitsmodellen zu untersuchen und die Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen zu testen.

Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie

Die Zelltherapie bietet eine vielversprechende Intervention bei Lungenfibrose, indem Vorläuferzellen verwendet werden, um geschädigtes Gewebe zu reparieren und die Lungenfunktion zu verbessern. Da die Bildgebung eine zentrale Rolle bei der Verfolgung der Zellintegration spielt, beschreiben wir hier die durch Magnetpartikelbildgebung gesteuerte in vivo-Verfolgung der Zelltherapie bei Lungenfibrose in einem Mausmodell.

Bildgestützte In-vivo-Verfolgung von transplantierten distalen Lungenepithel-Vorläuferzellen für Lungenfibrose mittels Magnetpulver-Bildgebung

Erfahren Sie eine nicht-invasive Methode zur Evaluation von Myoblastentransplantationen mittels Reportergen-Ansatz und Biolumineszenz-Imaging. Diese Technik nutzt ein Tri-Fusions-Reportergen zur Verfolgung transplantierter Zellen in vivo.

Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen

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