Name: Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Lernen Sie einen Hämolyse-Assay zur Bewertung pH-responsiver endosomolytischer Wirkstoffträger. Diese Methode nutzt Erythrozyten als Modell für endosomale Membranen und ermöglicht die quantitative Analyse der Membranzerstörung für die zytosolische Lieferung von Biologika.

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Die Autoren danken der Finanzierung durch das Department of Defense vom Kongress Regie Medical Research Programme (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) und der American Heart Association (# 11SDG4890030).

Ein. Vorbereitung und Sterilisation von Puffer und Test-Agents <ol><li> 150 mM NaCl-Puffer: Man löst 4,383 g NaCl-Kristalle in 500 ml Nanopure-Wasser. </li><li> pH-Puffer: Planen Phosphatpuffer bei pH 5,6, 6,2, 6,8 und 7,4 durch Mischen entsprechender Mengen an einbasischen und zweibasischen Natriumphosphat. Wenn Proben, bei niedrigeren pH-Werten (dh pH &lt;5,6), dann eine mehr geeigneten Puffer, wie Citrat-Puffer getestet werden sollen, zu verwenden. Buffer Rezepte sind leicht zugänglich, und ein Beispiel verwiesen wurde hier. 12 </li><li> Sterilisieren alle Puffer oben erwähnt durch eine Flasche-top Vakuumfiltervorrichtung und Re-Check-Puffer pH-Werten. </li><li> 20% Triton X-100 (positive Kontrolle): Mix 20 ml reinem Triton X-100 in 80 ml nanoreinem Wasser. Vortex kräftig und beschallen zu lösen. Hinterlegen über Nacht bei Raumtemperatur vor der Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung von Erythrozyten <ol><li> Erhalten 25 ml Blut from eine anonyme menschlichen Spender direkt in K 2-EDTA-beschichteten Vacutainer Röhrchen gezogen, um Gerinnung zu verhindern. </li></ol> HINWEIS: Alle Verfahren müssen von der zuständigen Institutional Review Board (IRB) und Venenpunktion und Blutentnahme im Voraus genehmigt werden muss durch einen geschulten phlebotomist durchgeführt werden, um das Risiko für den Spender zu minimieren. Standard Phlebotomie Verfahren wurden an anderer Stelle. Veröffentlicht 13 <ol start="2"><li> Zentrifuge Blut bei 500 xg für 5 min, und markieren Ebenen der Hämatokrit (rot, untere Schicht) und Plasma (gelblich, obere Schicht) auf dem Rohr. </li><li> Absaugen Plasma vorsichtig über eine Mikropipette in bleach hinzuzufügen, und entsorgen in biologischer Abfälle. </li><li> Füllen Hämatokrit Rohr markierte Zeile (ursprüngliche Niveau von Plasma) mit 150 mM NaCl-Lösung. Cap und invertieren ein paar Mal vorsichtig mischen. Zentrifugation bei 500 xg für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,3-2,4 an Blutzellen wieder waschen. Dann saugen übernatürlichenant und ersetzen mit PBS bei pH 7,4. Invertieren mischen. </li><li> Split Blut gleichmäßig in vier Rohre, die der jeweiligen pH, die getestet werden soll. Kennzeichnen der Rohre nach jedem pH zu testenden (5.6, 6.2, 6.8, 7.4). </li><li> Zentrifuge Blut Röhrchen bei 500 xg für 5 min. Markieren Sie Ebenen an Rohren, dann absaugen Überstand. </li><li> Füllen Sie jedes Rohr markierte Zeile mit Puffer geeigneter pH-Wert (wie in 2,6 angegeben). </li><li> Etikett vier 50 ml konischen Röhrchen (eine pro pH-Test) und Pipette 49 ml PBS des geeigneten pH-Wertes in jeden konischen Rohrs. </li><li> 1 ml Erythrozyten (gleichen pH) in entsprechende Rohr für einen 1:50-Verdünnung. Sichtprüfung der verdünnten Blut, das trübe und sollte werden niederlassen, wenn sie ungestört. Wenn kein Pellet Formen haben Zellen lysiert. </li></ol> 3. Lysis Assay 96 Well Plate Setup und Quantifizierung <ol><li> Stammlösungen aller experimentellen Drug-Delivery-Agenten, bei 20x die gewünschte Endkonzentration getestet werden (Assaywerden 10 ul von Drug-Delivery-Agent + 190 ul verdünnte roten Blutkörperchen, was zu einer 1/20 Verdünnung des ursprünglichen Drug-Delivery-Agenten in die endgültige Testansatz) nehmen. Stocks von 20, 100 und 800 Mikrogramm / ml vorgeschlagen, was zu abschließenden Test Konzentrationen von 1, 5 und 40 ug / ml. </li><li> Pipet 10 ul jeder Stammlösung in V-96-Well-Platten. Für optimale Ergebnisse, laden jede Probe in dreifacher oder vierfacher. </li></ol> Hinweis: Der Einfachheit, wird empfohlen, dass eine separate 96-Well-Platte für jedes pH sollte vorbereitet sein, getestet, mit jeder Probe werden (bei ​​jeder Konzentration) geladen bei n = 3-4 pro Platte. <ol start="3"><li> Für positive Kontrollvertiefungen, mit 10 ul 20% Triton X-100. </li><li> Für negative Kontrollvertiefungen, fügen Sie 10 ul Phosphatpuffer. Verwenden Puffer bei gleichem pH getestet werden. </li><li> Pipet 190 ul verdünnte Erythrozyten (siehe 2,10) in jede Vertiefung, um sicherzustellen, Zelle Stammlösung bleibthomogenes während der Übertragung. Hinweis: Verwenden Sie Mehrkanal-Pipette, um diese Aufgabe zu vereinfachen. </li><li> Inkubieren Platten bei 37 ° C für eine Stunde (Optional: Verwenden Sie einen Orbitalschüttler oder Wippe). </li><li> Zentrifuge Platten für 5 min bei 500 xg zu pelletieren intakte Erythrozyten. Hinweis: Beim Entfernen der Platte aus der Zentrifuge und der Transport zum nächsten Schritt, pfleglich zu behandeln und sicher sein, nicht auf das Zellpellet zu stören. </li><li> Mit einer Mehrkanalpipette, dann 100 ul Überstand aus jeder Vertiefung in eine klare, mit flachem Boden 96-Well-Platte. Hinweis: Wenn das Zellpellet versehentlich für jede Probe (n) gestört, kann man erneut zentrifugieren Platte und fahren Sie dann mit Überstand Transfer. </li><li> Messen Absorption der Überstände mit einer Platte Leser. Beachten Sie, dass ein Bereich von Wellenlängen verwendet werden (400 - 541 nm) sein. </li></ol> HINWEIS: Verschiedene Platereader unterschiedliche Sättigung Punkte und Empfindlichkeiten haben, so dass die Wahl der Wellenlänge für michaßangaben davon abhängt, ob oder nicht die Hämolyse von Daten von experimentellen Proben zuverlässig gegen maximale Hämolyse normalisiert werden, wie durch Detergensbehandlung induziert. Dies erfordert eine genaue Messung der Absorptionswerte der positiven Kontrollproben. <ol start="10"><li> Mit Microsoft Excel oder einer ähnlichen Software zur Datenanalyse, den Durchschnitt der Hintergrundabsorption Lesungen aus den negativen Kontrollproben für jeden pH-Wert (Schritt 3,4) eingestellt. Subtrahieren diesem Hintergrund Extinktionswert von allen anderen Proben, die bei diesem pH-Wert gemessen wurden. </li><li> Nach Subtraktion des Hintergrunds, finden die durchschnittliche Absorption der positiven Kontroll-Waschmittel-behandelten Proben (Schritt 3,3). Dann normalisieren alle experimentellen Daten zu dieser Extinktionmittelwert, was sollte 100% Hämolyse darstellen. Schließlich multiplizieren jede Kavität Wert mit 100% bis% Hämolyse, die in jeder einzelnen Vertiefung relativ zu dem Detergens Kontrolle aufgetreten berechnen. </li></ol>

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</ol>

IRB-Zulassung: Verfahren am Menschen wurden von der Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB; Protokoll # 111251) genehmigt worden. Keine Interessenskonflikte erklärt.

pH-empfindlichen Polymeren oder anderen Mitteln zur endosomolytischen Funktion konstruiert sein kann rasch und effektiv bezogen auf die Lyse der roten Blutzellen bei pH-Werten im Endosom angetroffen (Abbildung 1 gescreent; pH 6,8 - frühe Endosom, pH 6,2 - späte Endosom, pH 5,6 - Lysosom). 14-17 pH-abhängigen Hämolyse wurde verwendet, um die Fähigkeit von Trägern zu endosomalen Freisetzung biomakromolekulare Therapeutika (z. B. Peptide, siRNA, ODNs, Proteine) vermitteln screenen, und ...

Obwohl es viele potenzielle high-impact therapeutische Ziele innerhalb der Zelle sind, stellt die intrazelluläre Abgabe von Mitteln eine große Herausforderung. Häufig werden Drogen, insbesondere Biologika, durch Zellen internalisiert und gehandelte zu Vesikeln, dass entweder eine Verschlechterung ihres Inhalts durch die Endo-lysosomalen Weg führen, oder zurück aus der Zelle über pendelte Exozytose. 1 Bei letzterem Verfahren, das interne pH der Vesikel auf etwa 5-6 angesäuert, welches der optimale pH für die Aktivität von Enzymen, die Funktion in diesem Abteil, wie Lysozym. 2 In jüngster Zeit haben eine Reihe von Materialien speziell zu nutzen, die Versauerung der Endosomen, um cytosolische Lieferung von ihrer Ladung zu erleichtern entwickelt. Ein Beispiel für diesen Ansatz verwendet synthetische, Polymermizelle Nanopartikel, deren Kern im zwitterionischen und ladungsneutrale bei physiologischem pH (dh 7,4). Jedoch bei pH 6,0- 6.5, wobei die Polymere zu erwerben protoniert und eine positive Nettoladung, die die Micellkerns destabilisiert, und die freiliegenden Polymersegmente interagieren und stören die endosomale Membran. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass die endosomalen Entweichen von Peptid und Nucleinsäure-Therapeutika zu fördern, so dass sie ihre Ziele cytosolischen übersetzen. 3,4 Andere Beispiele von Methoden entwickelt, die den Escape-endosomalen Membranbarriere stören vermitteln beinhalten &#39;fusogenen&#39; Peptide oder Proteine, die Membranfusion oder transiente Porenbildung in der Phospholipid-Doppelschicht vermitteln können. 5 Homopolymerisate von anionischen Alkylacrylsäuren wie Poly (Propylacrylsäure) sind eine weitere gut untersuchten Ansatz, und in diesen Polymeren, bestimmt der Protonierungsgrad von anhängenden Carbonsäure Übergangs in eine hydrophobe, Membran-disruptive Zustand in endo-lysosomalen pH-Bereiche. 6,7 Ein nützliches Modell für das Screening endosomolytischen Verhalten ist die ex vivo pH-abhängig Hämolyse-Assay. 8 In diesem Modellsystem dient die Erythrozytenmembran als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht-Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Dieses Modell generalisierbar von anderen verwendet worden, um die endosomolytische Verhalten zellpenetrierendes Peptide und andere polymere Genabgabesysteme auszuwerten. 8-11 In diesem Experiment sind menschliche rote Blutzellen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die imitieren coinkubiert extrazellulären (7,4), frühe Endosomen (6,8), und am späten endo-lysosomalen (&lt;6,8) Umgebungen. Die Menge an Hämoglobin während der Inkubationszeit freigesetzt wird als Maß für die Lyse der roten Blutkörperchen, die der Menge an Hämoglobin im positiven Kontrollproben mit einem Detergens lysiert freigesetzt normalisiert wird quantifiziert. Von Screening einer kleinen Bibliothek von potenziell endosomolytischen Testmaterialien, kann man folgern, dass Proben, die keine Hämolyse produzieren bei pH 7,4, aber deutlich erhöhten Saumolysis bei pH &lt;6,5, werden die effektivsten und cytocompatible Kandidaten für cytosolische Drug Delivery sein. Materialien, die diese Kriterien erfüllen würde voraussichtlich nicht inert und nicht wahllos zerstören Lipiddoppelschichtmembranen (dh, die Zytotoxizität führen können) bis an einen Abfall der lokale pH-Wert nach Internalisierung in endo-lysosomaler Kompartimente ausgesetzt werden. In diesem Protokoll werden Erythrozyten von einem menschlichen Spender isoliert und bei pH 5,6, 6,2, 6,8 oder 7,4 mit experimentellen endosomolytische Arzneimittelabgabe Mittel co-inkubiert. Intakte Erythrozyten werden pelletiert, und die Überstände (enthaltend Hämoglobin aus lysierten Erythrozyten freigesetzt) ​​für die charakteristische Absorption von Hämoglobin über einen Plattenleser (Abbildung 1) analysiert.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Für die Blutentnahme </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Blutentnahmekanülen, 20,5-Gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Für die Blutentnahme </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Für die Blutentnahme </td></tr><tr><td> BD Marke Isopropylalkohol Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Für die Blutentnahme </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Für die Blutentnahme </td&gt; </tr><tr><td> Salzsäure (konz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Zur Einstellung des pH der D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Positive Kontrolle </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 Sterile Bottle-Top-Filter-Einheit mit SFCA Membrane </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD 96-Well-Platten mit flachem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Für plattenförmige Lesung am Ende des Assays. </td></tr><tr><td> BD 96-Well-Platten, mit rundem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Für die Inkubation von roten Blutkörperchen mit den experimentellen Mitteln. </td></tr></table&gt;

ex vivo red blood cell hämolyse-assay für die beurteilung von ph-responsive endosomolytischen agenten für cytosolic lieferung von biomakromoleülkomplexen drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Phospholipiddoppelschichten die endo-lysosomalen Vesikeln bilden eine Barriere, die Lieferung von biologischen Medikamenten zur intrazellulären Ziele darstellen. Um diese Barriere zu überwinden, wurde eine Reihe von synthetischen Droge Trägern entwickelt worden, um aktiv zu stören den endosomalen Membran und liefern Fracht in das Zytoplasma. Hier beschreiben wir die Hämolyse Assay, der als rasche, Hochdurchsatz-Bildschirm für den cytocompatibility und endosomolytische Aktivität der intrazellulären Drug Delivery Systemen verwendet werden können. In der Hämolyse Assay werden menschlichen roten Blutkörperchen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die extrazelluläre, frühe endosomalen und lysosomalen späten Endo-Umgebungen imitieren coinkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt zu pelletieren intakten roten Blutzellen, wird die Menge des Hämoglobins in das Medium freigesetzt spektrophotometrisch gemessen (405 nm für die besten Dynamikbereich). Der prozentuale Anteil der roten Blutkörperchen Störung wird dann quantifiziert, bezogen auf positive Kontrolle samples lysiert mit einem Reinigungsmittel. In diesem Modellsystem die Erythrozytenmembran dient als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Das gewünschte Ergebnis ist vernachlässigbar Hämolyse bei physiologischem pH (7,4) und robuste Hämolyse in der endo-lysosomalen pH-Bereich von etwa pH 5 bis 6,8.

<html> Typischerweise weisen die Mittel, die idealen pH-abhängigen hämolytischen Verhalten zeigen das höchste Potenzial für cytosolische Abgabe von Medikamenten, Nukleinsäuren oder anderen bioaktiven Molekülen. Dies wird durch Agent # 1 beispielhaft dargestellt, wie in Abbildung 2, die minimale Hämolyse bei pH 7,4 zeigt dargestellt, aber ein starker Anstieg der hämolytischen Verhalten bei endosomalen pH-Bereichen (&lt;6.5). Einige Mittel können ein erhebliches Maß an hämolytisch Verhalten bei physiologis...

Eine Hämolyse-Assay kann als schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Drug-Delivery-Systeme &quot;cytocompatibility und endosomolytische Aktivität für die intrazelluläre Frachtlieferungen verwendet werden. Der Assay misst die Unterbrechung der Erythrozytenmembranen als Funktion der pH Wert.

Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, das membranstörende Potenzial von Drug-Delivery-Vektoren für die intrazelluläre Abgabe von Biologika unter Verwendung von roten Blutkörperchen als biologischem Modell für die endosomale Membran quantitativ zu bewerten. Dieses Video wurde vom Advanced Therapeutics Laboratory der Vanderbilt University erstellt. Alle Verfahren, an denen menschliche Probanden beteiligt sind, wurden von der Institutional Review Board der Vanderbilt University genehmigt.Zunächst eine kurze Einführung in Endo, Hämolyse und Hämolyse. Träger von Biologika werden durch die Zelle mittels unspezifischer oder rezeptorvermittelter Endozytose in Endosomen aufgenommen. Nach der Endozytose.Die Fracht wird entweder in Lysosomen abgebaut oder für die Exozytose zurück in den extrazellulären Raum transportiert. Wie gezeigt, kann der abnehmende pH-Wert in einem Endosom jedoch mit pH-empfindlichen Arzneimittelträgern genutzt werden, die aufgrund der sauren Umgebung die Membran durchlässig machen, physikalisch porös werden oder die endosomale Membran destabilisieren. Ist die Endosomenmembran durchbrochen, kann die Arzneimittelfracht in das Cytoplasma freigesetzt und zu Zielorten im Cytoplasma, in den Mitochondrien oder im Zellkern diffundieren. In diesem Assay werden rote Blutkörperchen als Modell für die endosomale Membran bei physiologischem pH verwendet.Ideale Transportvehikel bleiben stabil und stören die rote Blutkörperchenmembran nicht. Bei abnehmendem pH-Wert werden die Transportvehikel jedoch instabil, was zu hydrophoben Wechselwirkungen führt, die die Membran der roten Blutkörperchen zerstören und Hämoglobin freisetzen. Das Hämoglobin kann anschließend aus den roten Blutkörperchen isoliert und spektralphotometrisch durch Absorption bei 405, 450 oder 541 Nanometern quantifiziert werden.H&ouml;here Absorptionswerte korrelieren mit einer st&auml;rkeren endomlytischen Wirkung. Dies kann mittels Zeitraffermikroskopie bei physiologischem pH visualisiert werden. Die roten Blutk&ouml;rperchen bleiben in Gegenwart des Arzneimitteltr&auml;gers stabil.Jedoch stören und zerstören die Transportvehikel bei einem niedrigeren pH-Wert, der für den endosomalen Weg charakteristisch ist, rasch die Membranen der roten Blutkörperchen. Die für diese Studie benötigten Materialien umfassen 150 Millimolar Natriumchlorid, hergestellt aus 500 Millilitern deionisiertem Wasser und 4,383 Gramm Natriumchlorid, sterilfiltriert mittels einer Vakuum-Filterapparatur mit Flaschenhalsanschluss. Zweitens wurden Phosphat-gepufferte Salzlösungen bei pH 7,4, 6,8, 6,2 und 5,6 durch Mischen der entsprechenden Mengen an Mono- und Dibasen-Natriumphosphatpuffern hergestellt und mittels einer Vakuum-Filterapparatur mit Flaschenhalsanschluss sterilfiltriert.Der pH-Wert wurde mit einem pH-Messgerät und/oder pH-Streifen überwacht und mehrere Methoden angewandt, um die Genauigkeit der Messungen sicherzustellen. 20 % Triton X wurde hergestellt, indem 20 Milliliter Triton X-102 in 80 Milliliter nano-reines Wasser gelöst, kräftig geschüttelt und anschließend ultraschallbehandelt wurden, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten, nach Genehmigung durch die zuständige Ethikkommission. Lassen Sie von Ihrer Studienschwester oder dem Phlebotomisten 25 Milliliter Vollblut von einem anonymen Spender in vakuumversiegelte Behältnisse mit Kalium-EDTA-Beschichtung zur Verhinderung der Gerinnung entnehmen.In diesem Video wird eine Sammelkanüle mit 20,5 Gauge, die mit einem Vakutainer-Adapter verbunden ist, verwendet. Das gesammelte Blut wird fünf Minuten lang mit 500 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation sollten die Plasmaschicht und die Schicht der roten Blutkörperchen deutlich erkennbar sein.Vermeiden Sie sorgfältig, die Schichten durch Schütteln zu stören. Markieren Sie die Plasmaspiegel und saugen Sie anschließend vorsichtig mit einer Mikropipette oder einem Vakuumabsauger ab, wobei die Flüssigkeit in Bleichmittel entsorgt wird. Ersetzen Sie das Plasma durch 150 Millimolar Natriumchlorid, bis zur markierten Linie aufgefüllt. Schließen Sie das Gefäß mit einem Deckel und drehen Sie es mehrmals vorsichtig um, um es sanft zu mischen. Zentrifugieren Sie ein zweites Mal bei 500 G für fünf Minuten, gefolgt von der Aspiration des Überstandes. Ersetzen Sie den Überstand bis zur Markierungslinie durch 150 Millimolar Natriumchlorid und drehen Sie das Gefäß mehrmals vorsichtig um, um es sanft zu mischen. Zentrifugieren Sie ein drittes Mal bei 500 G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn bis zur Markierungslinie durch PBS mit einem pH-Wert von 7,4.Teilen Sie die Blutprobe gleichmäßig auf vier Röhrchen auf – eines für jeden zu testenden pH-Wert, einschließlich des physiologischen pH-Werts von 7,4, des frühen endosomalen pH-Werts von 6,8, des späten endosomalen pH-Werts von 6,2 und des späten Endosoms oder lysosomalen pH-Werts von 5,8. Wiederholen Sie die Zentrifugation zum vierten und letzten Mal mit 500 ×g für fünf Minuten.Markieren Sie die überstehenden Niveaus und aspirationsvorsichtig, wobei der Überstand in Bleichmittel entsorgt wird. Ersetzen Sie den Überstand durch PBS mit dem geeigneten pH-Wert. Die endgültigen Bestände an roten Blutkörperchen werden hergestellt, indem die Stammlösungen 50-fach in Puffer mit dem geeigneten pH-Wert verdünnt werden.In diesem Fall wurde ein Milliliter konzentrierter roter Blutkörperchen vorsichtig mit 49 Millilitern PBS versetzt und das Gefäß mehrmals umgedreht, um die roten Blutkörperchen vor der Blutpräparation zu vermischen. Bereiten Sie Stammlösungen der Transportvehikel mit der 20-fachen Konzentration vor. Für Polymere schlagen wir 2100 und 800 Mikrogramm pro Milliliter als Anfangstestkonzentrationen vor; nach der Verdünnung beträgt die Endkonzentration 105 beziehungsweise 40 Mikrogramm pro Milliliter. Verwenden Sie für die Inkubation kegelförmige oder rundbodige Platten, damit intakte rote Blutkörperchen durch Zentrifugation entfernt werden können. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der 20-fachen Polymerlösung in jedes Loch.Es wird empfohlen, Proben mindestens im Triplikat oder Quadruplikat anzulegen, um die Ergebnisse zu optimieren. Triton X lysiert alle Zellen und kann als positiver Kontrollansatz in einer Endkonzentration von 1 % verwendet werden. PBS bei pH 7,4 kann als negative Kontrolle eingesetzt werden. Pipettieren Sie 190 Mikroliter verdünnte rote Blutkörperchen in jedes Loch. Achten Sie darauf, dass die Lösung der roten Blutkörperchen homogen bleibt, was gegebenenfalls leichtes Schütteln oder Mischen erfordert, um sie in Suspension zu halten.Beachten Sie, dass nach Zugabe der roten Blutkörperchen bereits eine beginnende Lyse bei extrem hämolytischen Substanzen sichtbar sein kann. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius, um die Lyse nach einer Stunde ablaufen zu lassen. Entfernen Sie die Platten zur Zentrifugation und zentrifugieren Sie die Platten bei 500 ×g, um die roten Blutkörperchen zu pelletieren.Übertragen Sie anschließend vorsichtig 100 Mikroliter des Überstandes in eine flachbodige 96-Well-Platte. Es ist entscheidend, das Erythrozyten-Pellet nicht aufzuwirbeln; achten Sie daher auf sorgfältiges Arbeiten. Messen Sie die Extinktion jedes Wells mit einem Plattenreader bei 450 Nanometer.Wenn das Hämoglobin zu konzentriert ist und hohe ABSORBANZ-Werte gemessen werden, können die Platten auch bei 541 Nanometer ausgelesen werden. Alternativ, wenn das Hämoglobin zu verdünnt ist und niedrige Absorbanz-Werte erhalten werden, können die Platten bei 405 Nanometern ausgelesen werden, um die Absorbanz zu maximieren. Zur Datenanalyse kann der Prozentsatz der Hämolyse berechnet werden, indem angenommen wird, dass PBS keine roten Blutkörperchen lysiert und Triton X 100 % der roten Blutkörperchen lysiert.Die dargestellte Gleichung liefert den Prozentsatz der Homolyse für jede Probe. Software wie Microsoft Excel kann verwendet werden, um Experimente aus Hunderten von Vertiefungen schnell zu analysieren. Hier sind repräsentative Ergebnisse bei mehreren Konzentrationen über die erörterten pH-Bereiche hinweg.Diese Formulierung zeigt eine ideale pH-Antwort und weist keine hämolytische Aktivität bei physiologischem pH auf, zeigt jedoch ein schalterartiges Verhalten bei endosomalem pH, das zu einer signifikanten Membranstörung führt, wie durch den roten Pfeil dargestellt. Soeben haben Sie sich das Video unseres Labors angesehen, das den pH-abhängigen Hämolyse-Assay von roten Blutkörperchen beschreibt. Dies ist ein vergleichsweise kostengünstiger, einfach zu handhabender und hochdurchsatzfähiger Assay, der zur Untersuchung kombinatorischer Bibliotheken oder Serien von Polymeren eingesetzt werden kann, die für die endolytische Abgabe biologischer Arzneimittel konzipiert sind.Wir stellten fest, dass dieser Assay hochgradig vorhersagbar für die zytosolische Freisetzung und bioaktive Wirkung einer Reihe von Biologika ist, einschließlich Proteine, Peptide und Nukleinsäuren. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass es einige potenzielle Schwächen dieses Assays gibt. Er wird als gutes Vorhersagewerkzeug für Polymere oder Peptide angesehen, die tatsächlich die endosomale Membran physikalisch beeinträchtigen.Es ist jedoch kein geeignetes Vorhersagewerkzeug für Polymere oder andere Systeme, die nach einem auf dem Protonenspeicher-Effekt basierenden Mechanismus wirken. Zudem ist zu berücksichtigen, dass die Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht von roten Blutkörperchen nicht exakt der von endosomalen oder lysosomalen Membranen entspricht. Hinsichtlich der Lipidzusammensetzung und des Cholesteringehalts sollte man stets bereit sein, weitere Untersuchungen durchzuführen.Jedes Ergebnis zur Hämolyse roter Blutkörperchen mit komplementären Techniken und Assays. Beispielsweise kann die Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit endosomalen oder lysosomalen Farbstoffen für Kolokalisationsstudien verwendet werden, um den Entweichweg von biologischen Arzneimitteln aus den endo-lysosomalen Wegen sichtbar zu machen. Außerdem sollte stets die Messung der Bioaktivität oder der downstream-Effekte des verabreichten Arzneimittels oder Biologikums der letzte Schritt sein.Abschließend sei darauf hingewiesen, dass biohazardöse Abfälle stets gemäß den Vorgaben Ihrer Institution sachgerecht behandelt und entsorgt werden müssen. Damit endet unser Video. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs (Video) | JoVE Journal

Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

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