Name: Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie die stereotaktische Lentivirus-Injektion zur microRNA-Überexpression in der Maus-Hippocampus-CA1-Region. Diese Methode ermöglicht präzise räumliche und zeitliche Kontrolle zur Untersuchung kognitiver Funktionen.

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Diese Studie wurde von der Edmond und Lily Safra Center for Neurowissenschaften (SB Gemeinschaft), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Programm der Israel Science Foundation (Grant No 378/11, zu HS) und der Deutsch-Israelischen Stiftung für wissenschaftliche unterstützt Forschung und Entwicklung (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010 zu HS).

1. Lentivirus Vorbereitung <ol><li> Wachsen HEK-Zellen 293FT bis 90% Konfluenz. </li><li> Am Tag der Transfektion Änderung Zellmedium serumfreiem DMEM, ergänzt mit 1 mM Glutamin und 50 mg / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Co-Transfektion der Zellen mit einem pLKO.1-Puro Vektor und mit Plasmiden, die für das Delta-R8.2 und VSV-G-Reste und der miRNA von Interesse unter Verwendung von 10 ul 1 mg / ml Polyethylenimin als Träger 9. </li><li> Sammle verpackten Lentiviren bei 24 h und 48 h nach der Transfektion Filter durch 0,45 um-Filter. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Lentiviren mit Ultrazentrifugation in 70.000 xg für 2 h und 15 ° C, und Aliquot bei -70 ° C. </li><li> Messen Virustiter durch Infizieren von HEK-293T-Zellen, die mit seriell verdünnten Virus Zubereitungen (1 bis 10 -6 ml Vektor pro Vertiefung). Die resultierende Titer (mindestens ~ 1 × 10 9 infektiöse Partikel pro ml wird empfohlen) ist für die Expression des ge ausgewertetne von Interesse, mit Puromycin-Selektion und Quantifizierung von GFP-exprimierenden Viren durch Zählen fluoreszierenden Zellen. </li></ol> Für weitere detaillierte Protokoll lentivirus Herstellung siehe 10. 2. Vorbereiten Tiere für Chirurgie <ol><li> Chirurgen Gewand sollte OP-Kittel, sterile Handschuhe, Mütze und Maske. </li><li> Wiegen Sie das Tier dann betäuben sie mit einem IP-Injektion eines Ketamin Mischung, wobei das Volumen proportional zu dem Tier Gewicht wie für jedes Arzneimittel angegeben. Für eine Ketamin / Xylazin Mischung wird ein Dosisbereich von 80-200 mg / kg Ketamin und 7-20 mg / kg Xylazin in der Regel für Mäuse verwendet. </li><li> Warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt, dann aus Mangel an Rückzug Reflex im Hinterbein des Tieres überprüfen, indem sich das Bein und dann die Taste mit dem Finger. </li><li> Injizieren Sie das Tier subkutan mit Rimadyl, wie auf der Verpackung angegeben ist, zur Schmerzlinderung. Typische Dosisbereich für Rymadil ist 5-10 mg. </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, um einen stetigen Körpertemperatur zu halten und befeuchten die Augen mit Salbe. </li><li> Shave den Bereich zwischen den beiden Ohren mit einer Fräsmaschine. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut mit betadine. </li></ol> 3. Die Exposition der Schädel und Bohren <ol><li> Legen Sie das Tier innerhalb des stereotact indem die Stangen in die Spalten knapp vor dem Tier die Ohren. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um eine Vorwärts-Rückwärts-Schnitt von ca. 1,5 cm zwischen den Ohren machen und halten Sie es mit der Operation Klemmen (serfines) zu öffnen. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit einem Wattestäbchen, bis der Schnittpunkt zwischen der Kranznaht und sagittalen Nähten, dh die Bregma und den Schnittpunkt zwischen den koronalen und lambdoiden Nähte, dh Lambda, sichtbar sind. </li><li> Richten Sie die Spitze der Spritze, durch die stereotact gehalten, der Bregma Punkt, an allen drei Achsen. Notieren Sie sich die Koordinaten. Dieser Punkt würde als Null-po berücksichtigt werdenint in allen drei Achsen. </li><li> Heben Sie die Spritze in der vertikalen Achse, so dass eine ebene Bewegung nicht kratzen würde den Schädel und bewegen Sie die Spritze Kopf an die richtige Stelle. Hippocampus CA1 Injektionen erfordern die folgenden Koordinaten relativ zum Bregma in mm: -2 an der vorderen / hinteren Achse, ± 1,8 bei der lateralen / medialen Achse bzw. -1,5 an der dorsal / ventral Achse. </li><li> Senken Sie die Spitze der Spritze, bis er den Schädel berührt und markieren Sie die Stelle mit einem Marker. Entfernen Sie die Spritze zurück, um zu vermeiden Stechen. </li><li> Bohren Sie ein flaches Loch, nur in den Schädelknochen mit einem feinen Bohrer. Halten Sie den Bohrer stetig, damit es nicht weiter in die weichen Gewebe unter bohren. Sie können dies durch Verstetigung einerseits mit dem anderen und durch Bohren in kurzen Impulsen zu verhindern. </li></ol> 4. Die Injektion des Lentivirus <ol><li> Ziehen Sie 0,5 ml der konzentrierten Lösung lentivirus. </li><li> Legen Sie die Spritze über dem Loch und langsam und senkrecht absenken, bis es reaches die Oberfläche des Schädels. Fahren Sie mit der Spritze in das Gehirn sehr langsam senken. Bei diesem Schritt einige Blutungen auftreten, die nicht unbedingt auf eine fehlgeschlagene Penetration. Kommt es zu Blutungen wischen Sie sie mit einem Wattestäbchen. </li><li> Stellen Sie den digitalen Pumpe bis 0,02 ml / min (0,5 ul würde in 25 min injiziert werden) und Infusion starten. Langsame Infusion ermöglicht eine effektive Ausbreitung des Virus in das Gewebe und verhindert Rückfluss. In einigen Spritze Arten betrachten Einsetzen der Spritze für eine zusätzliche Tiefe von 0,5 mm vor dem Rückzug zu den ursprünglichen Koordinaten und Infusion. </li><li> Nach Infusion beendet ist für zusätzliche 5 Minuten, um das Material in das Gehirn statt Rückzug zurück in den Kanal mit der Spritze ausgebildet verbreiten. </li><li> Entfernen Sie die Spritze sehr langsam und achten Sie zurück fließt. Wenn eine Rückströmung bei diesem Schritt festgestellt wird, wurde ein Teil des eingespritzten Materials wahrscheinlich verloren. </li></ol> 5. Wound Sealing and Recovery <ol><li> Seal the gewickelt mit Histoacryl. Achten Sie darauf, zu vermeiden undicht des Histoacryl in die Augen. </li><li> Injizieren Sie das Tier intraperitoneal (IP) mit 1 ml vorgewärmten Kochsalzlösung, um eine Dehydratation zu vermeiden. </li><li> Legen Sie das Tier in einem Käfig, der Erholung auf einem Heizkissen positioniert ist. Sehen Sie sich das Tier, während es für eine weitere Stunde erholt. </li></ol> Bei der Gewichtsabnahme, Appetitlosigkeit, Schwäche sollte / Unfähigkeit, Futter oder Wasser, moribund oder Infektion, Euthanasie des Tieres zu erhalten durchgeführt werden. Akzeptierte für Euthanasie von Nagetieren sind Barbiturate, Inhalations-Anästhetika, CO 2, CO, oder Kaliumchlorid in Verbindung mit Vollnarkose. Nach 4 bis 6 Wochen, beurteilen des Tieres Navigationsspeicher im Morris Water Maze beurteilt. Das wird in der Regel infizieren lentivirus meisten Zellen innerhalb der Injektion Sphäre. 6. Behavioral Assessment im Morris Water Maze <ol><li> Trainieren Sie die Tiere in der Morris Wasser-Labyrinth. Für genaue Ausbildung und Prüfung Protokoll sehen 11. Nach jedem Versuch, trocknen das Tier mit einem trockenen Tuch, ersetzen Sie ihn in seinem Käfig und erfrischen das Wasser in den Tank. </li><li> Testen Sie die Tiere im Morris Water Maze an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, 4 Versuche jeden Tag. Jeden Tag legen, das Tier in das Labyrinth in jeder der 4 Richtungen des Labyrinths (Nord, Süd, Ost und West) in einer sich verändernden, um z. B. einen Tag: Ost-West-Nord-Süd-, Tag zwei: West-Süd -Nord-Ost. Wischen Sie die Tiere nach jedem Versuch. </li><li> Während der Testläufe verfolgen das Tier mit einem Tracking-System wie Noldus Trackingsystem. </li><li> Nach der 12. Test-Studie, legen Sie das Tier in den Wassertank ohne die Plattform für eine Minute. Dies würde verwendet, um die Suchstrategie das Tier nimmt zu analysieren. </li><li> Analysieren Sie die Daten wie in 12 vorgeschlagen. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
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<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
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<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Stereotaktische Injektion eines Lentivirus ist ein relativ schnelles Verfahren zur in vivo Beurteilung sowohl Vorwärts-oder Rückwärts-Regulation verschiedener Gene und miRNA. Die wichtigste Alternative ist eine gentechnisch veränderte Maus, die ein viel mühsame und zeitaufwendige Technik dann direkt lentivirus Injektion ist. Darüber hinaus ist die Regelung bis in lentivirus Injektion, tritt zu einem bestimmten Zeitpunkt in der erwachsenen Maus und beinhaltet keine Möglichkeit Undichtigkeit während der Entwicklu...

Die Rolle von miRNAs in bestimmten Funktion des Nervensystems wurde kürzlich von lentiviralen Injektion in mehreren Studien in Frage gestellt worden. MiRNAs gefunden werden entscheidend für die Aufrechterhaltung und Umformen Synapse Struktur 1, 2 und Synaptogenese Synapse Umbau und Wartung 3. Diese Studien deuten stark darauf hin, dass miRNAs tätig sind, über vielschichtigen regulatorische Effekte sowohl in der Gestaltung und bei der Aufrechterhaltung der Hauptausgang des Nervensystems, die kognitive Funktion. Stereotaktische Injektion von Lentivirus Teilchen in bestimmten Regionen im Gehirn von Nagetieren ermöglicht die Suche nach Änderungen in Synapse Morphologie und neuronaler Aktivität und wurde für die Herstellung der funktionelle Bedeutung überexprimierten Transkripte 4,5 verwendet. Direkte Infektion von Neuronen an wohldefinierten Hirnareale mit miRNA-exprimierenden Lentiviren kann in Studien des Alterns, Gehirn-Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sein; Studium der miRNAs im Bereich der Verhaltens-Regulierung 6-8 sind in einer weit weniger fortgeschrittenen Stadium, und stereotaktische Injektion von miRNA-Expression lentivirus Teilchen durch Verhaltenstests gefolgt kann nützlich sein, für solche Zwecke. Eine wesentlich aufwendigere Verfahren zur Induktion über-oder unter-Ausdruck beinhaltet gentechnisch Knock-in-oder Knockout-Mäusen. Genetische Systeme können weiter für die bedingte und zeitliche Steuerung der Expression (zB Cre-Lox, Tet-Systeme) ermöglichen, aber diese bieten kaum die räumliche Spezifität der Injektion und es gibt fast immer eine gewisse Undichtigkeit. Auch müssen die technischen Verfahren nicht operiert und kann über Labors mit relativ guter Reproduzierbarkeit verwendet werden, jedoch sind sie langsamer und benötigen viel mehr personelle und finanzielle Ressourcen. Darüber hinaus ist die zeitliche Steuerung der Über-oder Unter-Expression in injizierten Mäusen ist weitaus genauer verglichen mit gentechnisch veränderten Mäusen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nagetierwaage</td><td>Burtons (UK)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>FIRstTechnologie</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>Trimmmaschine</td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>Stereotakt</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell und Klingen</td><td>Kent wissenschaftlich</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>Harland Spritze</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>digitale Pumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>Wassertank und Plattform</td><td>Stoelting</td><td>60135<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>Ketamin </td><td>Vetoquinol (Köder Frankreich)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer Tiergesundheit</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtigkeitssalbe - Synthomycin 5%</td><td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktische injektion von microrna-exprimierenden lentiviren der maus hippocampus ca1 region und beurteilung der behavioral outcome

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische einzigen RNA-Moleküle etwa 22 Nukleotide lange, die kann jeder Ziel-mRNA-Transkripte und zahlreiche dim eine ganze Genexpression Weg durch Induktion Zerstörung und / oder Hemmung der Translation dieser Ziele. Mehrere miRNAs eine wichtige Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung neuronaler Struktur und Funktion und in höheren Funktionen des Gehirns, und Methoden zur Manipulation ihrer Ebenen für die Erkundung dieser Funktionen gesucht. Hier präsentieren wir einen direkten in vivo-Verfahren zur Untersuchung der kognitiven Folgen der erzwungenen miRNAs Überschuss in Mäusen durch stereotaktische Injektion von miRNA-encoding Viruspartikel. Konkret beinhaltet das aktuelle Protokoll Injektion in den Hippocampus CA1-Region, die Säugetier-Speicher-Konsolidierung, Lernen und Stress-Reaktionen beiträgt und bietet eine bequeme Injektionsstelle. Die Koordinaten werden gemäß der Maus bregma und Viren Perfusion digital gesteuert und gehalten sehr langsam gemessen.Nach der Injektion wird die Operation Wunde verschlossen und die Tiere erholen. Lentiviren kodiert Schalldämpfer der entsprechenden mRNA Ziele dienen, um die spezifische miRNA / Target-Wechselwirkung verantwortlich für den beobachteten Effekt implizieren, mit naiven Mäuse, Mäuse mit Kochsalzlösung und Mäuse mit &quot;leeren&quot; Lentivirusvektoren als Kontrollen injiziert. Einen Monat nach der Injektion werden die Tiere in der Morris Water Maze (MWM) zur Beurteilung ihrer Navigation Lernen und Gedächtnis Fähigkeiten untersucht. Die MWM ist ein runder Behälter mit gefärbtem Wasser mit einer kleinen Plattform 1 cm unter der Wasseroberfläche untergetaucht gefüllt. Stetige visuelle Hinweise um den Tank für die räumliche Navigation (Ton und der Erde das Magnetfeld kann auch helfen, die Tiere in der Navigation) erlauben. Videokamera-Überwachung ermöglicht die Messung der Strecke von Bad und die Zeit zu finden und betragen die Plattform. Die Maus wird zuerst gelehrt, dass die versteckte Montage-Plattform bietet einen Ausweg aus der erzwungenen Schwimmen, es wird dann für die Verwendung dieser Flucht-und f getestetndlich ist die Plattform entfernt und Sonde Tests prüfen, ob die Maus erinnert sich an seine früheren Standort. Wiederholte Tests über mehrere Tage hintereinander markieren verbesserte Leistung der getesteten Mäuse in kürzeren Latenzzeiten zu finden und montieren Sie die Plattform, und da immer mehr direkte Wege, um die Plattform oder seine Position zu erreichen. Bei Nichterscheinen solche Verbesserung stellt beeinträchtigt Lernen und Gedächtnis und / oder Angst, die dann geprüft werden kann speziell (zB im erhöhten Plus-Labyrinth). Dieser Ansatz ermöglicht die Validierung von spezifischen miRNAs und Ziel-Transkripte in der untersuchten kognitiven und / oder Stress-Prozesse.

Die Injektion von 0,5 ul Lentivirus in der CA1-Region des Hippocampus der Maus, mit der Strömungsgeschwindigkeit beim Protokoll angegeben ergibt einen infizierten Bereich von etwa 1 mm im rostralen-kaudalen Achse und etwa 0,5 mm in der medial-lateralen und vorderen -posterioren Achsen (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bregma Punkt und Einspritzvorrichtung. (A)</...

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung dienen<em&gt; In vivo</em&gt; Auswirkungen der überexprimierten miRNAs in spezifischen Hirnregionen.

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die neurologischen und kognitiven Auswirkungen einer Überexpression von Mikro-RNA in Mäusen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt ein Mikro-RNA-exprimierendes Lentivirus hergestellt wird. Das Lentivirus wird in eine bestimmte Hirnregion injiziert, wodurch die Mikro-RNA überexprimiert und eine Regulation ihrer Zielstrukturen durchführen kann.Es werden Ergebnisse erzielt, die kognitive Effekte der Überexpression von Mikro-RNA aufgrund der anatomisch gezielten Applikation des Lentivirus in das Maushirn zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Gentechnik liegt darin, dass die Gentechnik deutlich aufwändiger und zeitraubender ist als die direkte Lentivirusinjektion. Außerdem ermöglicht die Lentivirusinjektion eine vollständige räumliche und zeitliche Kontrolle sowie Nachverfolgung des überexprimierten Moleküls.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Spiegelneuronen zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss eine Über- oder Unterexpression eines bestimmten Spiegelns auf Lernen und Gedächtnis hat, wie durch Verhaltenstests bewertet. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, da mikro-RNAs für therapeutische Eingriffe geeignet sind. Inkubieren Sie die gepflanzten Verpackungszellen, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen, transfectieren Sie sie dann zunächst und wechseln Sie anschließend ihr Medium in serumfreies DMEM, ergänzt durch einen Millimolar Glutamin und 50 Milligramm pro Milliliter.Penicillin-Streptomycin, anschließend ko-transfizieren Sie die Zellen mit dem A-P-L-K-O 0,1 pur-Vektorplasmid, das für die Delta R 8.2- und VSVG-Gruppen codiert, sowie mit dem Plasmid, das die gewünschte micro-RNA enthält. Verwenden Sie 10 µL eines Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Polyethylins als Träger nach 24 und 48 Stunden. Sammeln Sie nach der Transfektion die verpackten Lentiviren und filtrieren Sie diese durch einen 0,45-µm-Filter. Konzentrieren Sie das Filtrat mit Lentiviren durch Ultrazentrifugation bei 15 Grad Celsius und 70.000 × g über zwei Stunden. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Lentivirus in der minimalen Menge an deionisiertem destilliertem Wasser, die erforderlich ist, um das Pellet vollständig aufzulösen, sodass keine sichtbaren Klumpen verbleiben. Anschließend stellen Sie Aliquots der Konzentratlösung her, um sie bei minus 70 Grad Celsius zu lagern.Als Nächstes messen Sie die Viruslast, indem Sie Verpackungszellen mit seriell verdünntem Virus infizieren. Verwenden Sie eine 12-Loch-Platte mit Vektormengen von einem Milliliter bis zu einem Millionstel Milliliter pro Loch. Die resultierende Titerkonzentration sollte mindestens 1 Milliarde infektiöse Partikel pro Milliliter betragen.Wiegen Sie das Tier und betäuben Sie es mit einer intraperitonealen Injektion eines Ketamin-Gemischs. Verwenden Sie das für jedes Medikament entsprechend dem Körpergewicht des Tieres proportionale Volumen. Warten Sie, bis das Tier vollständig anästhesiert ist.Überprüfen Sie anschließend das Fehlen eines Withdrawal-Reflexes in der Hinterextremität, wenn kein Reflex vorhanden ist. Injizieren Sie dem Tier subkutan das auf der Verpackung angegebene Schmerzmittel IL. Stellen Sie das Tier unter eine Wärmelampe oder auf eine Heizplatte und befeuchten Sie die Augen mit Salbe.Schließlich den Bereich zwischen den beiden Ohren mit einer Schermaschine rasieren und die Haut mit 70 %igem Ethanol desinfizieren. Das Tier in das stereotaktische T platzieren und die Stäbe in die Vertiefungen justieren, direkt innenseitig der Ohren des Tieres. Anschließend mit einem Skalpell einen anteroposterioren Schnitt von etwa 1,5 Zentimetern Länge zwischen den Ohren durchführen und den Schnitt mit Operationsklemmen offen halten.Reinigen Sie anschließend die Oberfläche des Schädels mit einem Wattestäbchen, bis die Kreuzung zwischen der Koronalsymphysis und den Sagittalsymphyse sichtbar ist. Dazu gehören das bgma und die Kreuzung zwischen der Koronalsymphysis und der Lambdasymphysis oder das Lambda. Positionieren Sie nun die Spitze der Spritze, die in der Stereotaxie gehalten wird, am bgma-Punkt entlang aller drei Achsen exakt auf den Koordinaten.Das sind die Nullpunkte. Anschließend heben Sie die Spritze entlang der vertikalen Achse an, damit sich eine planare Bewegung nicht am Schädel vom bgma abkratzt. Bewegen Sie die Spritze an die erforderliche Position zum Hippocampus ca1, beispielsweise zwei Millimeter nach unten entlang der AP-Achse, 1,8 Millimeter nach oben und unten entlang der LM-Achse und 1,5 Millimeter nach unten entlang der DV-Achse.Senken Sie anschließend die Spitze der Spritze ab, bis sie den Schädel berührt. Markieren Sie die Stelle, ziehen Sie die Spritze dann zurück, um Platz für den Bohrer an dieser Stelle zu schaffen. Erstellen Sie mit einem feinen Bohrer ein flaches Loch im Schädelknochen.Halten Sie den Bohrer ruhig und bohren Sie nicht in das Weichgewebe hinein. Kurze Bohrimpulse können während des Bohrens hilfreich sein. Achten Sie darauf, eine Hand mit der anderen zu stabilisieren, um sicherzustellen, dass das Durchbohren des Knochens nicht tiefer in das Weichgewebe vordringt.Ein halbes Milliliter der konzentrierten Lentivirus-Lösung in die Spritze aufziehen. Die Spritze über die Öffnung bringen und langsam vertikal absenken, bis sie die Oberfläche des Schädels erreicht. Die Spritze danach sehr langsam weiter in das Gehirn hinein absenken.Stellen Sie die digitale Pumpe auf 0,02 Milliliter pro Minute ein, um das Volumen innerhalb von 25 Minuten langsam zu injizieren. Dies verhindert einen Rückfluss und gewährleistet eine erfolgreiche Ausbreitung. Beginnen Sie die Infusion bei bestimmten Spritzentypen.Ziehen Sie in Betracht, die Spritze vor dem Zurückfahren zu den ursprünglichen Koordinaten und dem Beginn der Infusion um einen zusätzlichen halben Millimeter vorzuschieben, während die Substanz infundiert wird. Benetzen Sie den exponierten Bereich mit PBS, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern. Warten Sie nach Abschluss fünf Minuten, bevor Sie die Spritze zurückziehen.Dadurch kann sich das Material im Gehirn verteilen, anstatt in die Bahn der Spritze zurückzufließen. Anschließend die Spritze sehr langsam entfernen und auf Rückflüsse achten. Wenn ein Rückfluss beobachtet wird, ging vermutlich ein Teil des injizierten Materials verloren.Verschließen Sie die Wunde mit Histo-Acryl, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein Histo-Acryl in die Augen des Tieres gelangt. Als Nächstes, um eine Dehydrierung des Tieres zu verhindern, injizieren Sie ein Milliliter erwärmtes Kochsalzlösung intraperitoneal. Stellen Sie das Tier in einen Aufwachkäfig, der auf einer Wärmeunterlage steht.Beobachten Sie das Tier während der Erholungsphase über eine Stunde nach vier bis sechs Wochen und bewerten Sie das Navigationsgedächtnis des Tieres wie im Morris-Wasser-Maze-Test. Die Lentiviren haben die meisten der gezielten Zellen infiziert. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt eine Injektion von 0,5 µL Lentivirus in das ca.Ein Bereich des Maushippocampus wurde wie in der Anleitung beschrieben hergestellt. Das Tier wurde anschließend getötet und 40 µm dicke Schnitte seines Gehirns analysiert. Für die GFP-Expression ist die DAPI-Färbung in Rot sichtbar.Zusammenfassend ergab dies eine infizierte Sphäre von etwa einem Millimeter entlang der rostralen-caudalen Achse und etwa 0,5 Millimeter entlang der medialen lateralen sowie der anterior-posterioren AE. Mäuse, die mit einem Mikro-RNA-kodierenden Lentivector injiziert wurden, wurden im Morris-Wasserlabyrinth mit Kontrolltieren verglichen. Nach drei Tagen Training war der repräsentative Weg eines Kontrolltieres zur untergetauchten Plattform, dargestellt in Grün, deutlich kürzer als der eines Versuchstieres in Rot.Insgesamt hatten die Versuchstiere größere Schwierigkeiten, die Aufgabe zu erlernen, während die Kontrolltiere sie schneller meisterten. Diese Technik kann pro Maus in etwa 40 Minuten durchgeführt werden. Die Durchflussrate ist danach der einzige begrenzende Faktor bei diesem Verfahren.Andere Methoden wie die systematische Injektion von Oligonukleotiden können durchgeführt werden, um Fragen dahingehend zu beantworten, inwieweit dieses Verfahren die Kommunikation zwischen Gehirn und Körper verändert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Einweg-Tyvac-Laborkittel und neutrale Handschuhe getragen werden sollten. Zusätzlich müssen Glas- und Plastikgefäße, die flüssige Abfälle enthalten, vor der Entsorgung in einer Bioabfalltüte dekontaminiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Dieses Video zeigt die microRNA-vermittelte Hemmung von exzitatorischen synaptischen Strömen in Hippocampus-Hirnschnitten von Mäusen. Die CA3-Neuronen wurden mit einem rekombinanten viralen Vektor infiziert, der ein Konstrukt zur Expression eines fluoreszierenden Reporters, einen lichtaktivierten Membrankanal und eine microRNA enthält, die die Expression von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen herunterreguliert. Nach dem Platzieren einer Scheibe in einer Aufnahmekammer und dem Patchen eines...

MicroRNA-vermittelte Hemmung exzitatorischer postsynaptischer Ströme in Hippocampusschnitten der Maus

Quelle: Chen, S., et al., Stereotaxische Chirurgie zur genetischen Manipulation in striatalen Zellen von Neugeborenen-Mausgehirnen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der für Cre-Rekombinase und grünes Fluoreszenzprotein (GFP) kodiert, in das Striatum eines genetisch veränderten Maus-Welpen, um eine Genmanipulation zu erreichen, indem eine loxP-flankierte STOP-Kassette herausgeschnitten und das rote Fluoreszenzprotein oder RFP als Reporter...

Stereotaktische Mikroinjektion eines viralen Vektors zur Genmanipulation in einem Striatum eines Maus-Jungtiers

Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

Stereotaktische Injektion von viralen Vektoren für die Reprogrammierung von Gliazellen in einem Mausmodell

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Design, Verpackung und Verabreichung von CRISPR-Retro- und Lentiviren mit hohem Titer durch stereotaktische Injektion. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die stereotaktische Virusinjektion zur präzisen neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen. Das Protokoll gewährleistet eine genaue Virusabgabe an den Gyrus dentatus und ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung und den CRISPR-vermittelten Gen-Knockout, um neuronale Schaltkreise, Genfunktionen und...

Stereotaktische Virusinjektion zur gezielten neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte stereotaktische Gehirninfusion von Amyloid-beta. Diese Methodik bietet ein alternatives In-vivo-Mausmodell, um die kurzfristigen Auswirkungen von Amyloid-Beta auf Gehirnneuronen zu untersuchen.

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

MicroRNAs spielen eine entscheidende Rolle im Gehirn und sind potenzielle Ziele für die Modellierung der Neurodegeneration. Die Störung des miRNA-Spiegels ist jedoch aufgrund der kurzen Länge der miRNA und der Unzugänglichkeit des Hirngewebes eine Herausforderung. Dieses Video stellt eine Methode für das Antagomir-Design und die gehirnspezifische Verabreichung unter Verwendung eines Neuropeptids bei Mäusen vor.

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Dieser Artikel zeigt die Vorbereitung eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, ergänzt mit Infusionskanüle und deren Implantation in die CA1-Region des Hippocampus bei Mäusen.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Lernen Sie die stereotaktische Lentivirus-Injektion zur microRNA-Überexpression in der Maus-Hippocampus-CA1-Region. Diese Methode ermöglicht präzise räumliche und zeitliche Kontrolle zur Untersuchung kognitiver Funktionen.

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome (Video) | JoVE Journal

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

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