Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Ziel dieses Verfahrens ist es, die molekularen Bestandteile von neuralen Stammzellen der subventrikulären Zone genetisch zu markieren und zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit DNA beladene Glaspipette in den lateralen Ventrikel eines P null P eingeführt wird.Der zweite Schritt besteht darin, DNA in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit des lateralen Ventrikels auszustoßen. Als nächstes wird Strom an das P angelegt, was den Transfer von DNA auf neurale Stammzellen ermöglicht, die die Seitenventrikel auskleiden.

Letztendlich wird eine Kombination molekularer Techniken, einschließlich Immunhistochemie, Molekularbiologie, Mikroskopie und Elektrophysiologie, verwendet, um Veränderungen des Schicksals, der Proliferation, der Migration und der Reifung von Neurostammzellen der subventrikulären Zone sichtbar zu machen. Die Elektroporation der subventrikulären Zone bei Neugeborenen kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurogenese zu beantworten, z. B. welche molekularen Signalwege für die Regulierung der Proliferation, Differenzierung, Migration und Reifung von neuronalen Stammzellen und ihren Nachkommen verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. transgenen Mäusen, besteht darin, dass sie eine schnelle und robuste Markierung von Neuronenstammzellen der SVZ auf zeiteffiziente und kostengünstige Weise ermöglicht.

Stellen Sie zunächst sicher, dass die zu reinigende DNA von hoher Reinheit und Konzentration und frei von Endotoxinen ist. Ziehen Sie 10 Zentimeter große, feuerpolierte Kapillarrohre aus BO-Quarzglas in Pipetten. Hier kommt ein PP eight 30 ghhi PC 10 Pipettenabzieher-Set zum Einsatz, um einen einstufigen gewichteten Zug bei 70,5 Grad Celsius zu ziehen. Nach dem Ziehen der Pipette mit einer kreisförmigen Pinzette die Spitze brechen.

Untersuchen Sie dann die Pipette unter einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass keine gezackten Kanten vorhanden sind. Bei Bedarf kann die Spitze mit einem Schleifstein abgeschrägt werden. Legen Sie anschließend die gegossenen Pipetten 15 Minuten lang unter eine UV-Lampe.

Markieren Sie die Pipette nach Ablauf der 15 Minuten zwei Millimeter vom Rand der Spitze entfernt mit einem feinen Spitzenmarker. Bereiten Sie zum Schluss eine schnelle grüne Lösung mit 0,1 Gew.-% pro Volumen vor, indem Sie steril gefilterte 0,9%ige sterile Kochsalzlösung mit trockenem, schnellem grünem Anästhesiemittel mischen. Ein null bis einen Tag alter Welpe, eine gläserne Petrischale, die auf vier Grad Celsius vorgekühlt und auf Westeis gelegt wird. Bestimmen Sie nach etwa fünf Minuten den Zustand der Betäubung mit Hilfe der Fußquetschreaktion.

Wenn keine Bewegung auftritt, beginnen Sie mit der intraventrikulären Injektion. Kombinieren Sie die schnelle grüne Lösung mit der DNA-Lösung und aliquotieren Sie ein bis zwei Mikroliter auf Biofilm. Es ist wichtig, dass dies kurz vor der Injektion erfolgt, da die Kombination von schneller grüner Lösung mit DNA zu einer schnellen Verdampfung und Kristallisation mit anschließender Blockierung von Glaspipetten führen kann, das gesamte aliquote Volumen mit einer Mikrofilmspritze aspirieren und die Glaspipette auf einen Druckluftinjektor laden.

Fassen und halten Sie nun vorsichtig den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der letzten dominanten Hand. Schalten Sie dann die Lampe ein und halten Sie den Kopf des Welpen knapp außerhalb des Lichtstrahls. Wenn die Ventrikel nicht deutlich sichtbar sind, befeuchten Sie den Kopf mit steriler Kochsalzlösung, um die von der Kopfhaut reflektierte Lichtmenge zu reduzieren.

Führen Sie dann mit der dominanten Hand die Nadel in den seitlichen Seitenventrikel ein. Die Injektionsstelle sollte ungefähr gleich weit von der OID-Naht und dem Auge entfernt sein und zwei Millimeter lateral zur sagittalen Naht. Führen Sie die gezogene Pipette bis zur Zwei-Millimeter-Markierung ein, um einen P-Null-Pop zu erzielen, der das Eindringen in die Seitenkammer gewährleisten sollte.

Durch die Entlastung des Hirndrucks kann es zu einer Rückfüllung des Liquors in die Pipette kommen. In diesem Fall lockern Sie den Griff am Kopf des POP, um den Druck zu verringern und die Injektion des Plasmids zu unterstützen. Sobald die Pipette optimal eingeführt ist, injizieren Sie etwa 0,5 Mikroliter Plasmid in den Seitenventrikel.

Stellen Sie die Spannung des Elektrobetriebsgenerators auf fünf Rechteckimpulse, 50 Millisekunden pro Impuls und 100 Volt in Intervallen von 50 Millisekunden ein. Die räumliche Spezifität des Plasma-Elektrobetriebs ist durch die Richtung des Ladungstransfers gegeben, so dass die Platzierung der Elektroden angesichts der Vielfalt der Zellen der SVZ räumlich berücksichtigt werden sollte. Es wurden Veränderungen in Bezug auf das Zellschicksal und die Proliferation in den ventralen dorsalen bis CAU-Lokalisationen berichtet

Nach der Injektion des Plasmids tauchen die Pinzettenelektroden in PBS ein, um den Ladungstransfer zu maximieren und Verbrennungen durch den spezifischen Widerstand zu verhindern. Platzieren Sie anschließend die positive Elektrode an der dorsalen Seitenwand des Schädels in der Nähe des Ohrs und tauchen Sie die laterale zur Zytoplasma-Injektion. Platzieren Sie dann die negative Elektrode auf der kontralateralen Hemisphäre ventral lateral der Popschnauze.

Diese Abbildung zeigt die korrekte Ausrichtung der negativen und positiven Elektroden in Bezug auf die x-, y- und z-Achse auf dem injizierten Pup. Starten Sie die Stromübertragung, indem Sie das Pedal des Impulsfußschalters betätigen und die Elektroden in Abständen von etwa 25 Grad von dorsal nach lateral bewegen. Sobald die Elektroporation abgeschlossen ist, legen Sie alle elektroporierten Welpen fünf Minuten lang auf ein Heizkissen.

Drehen Sie die Welpen vorsichtig alle 30 Sekunden mit leichter Stimulation. Dieses Bild zeigt den lateralen Ventrikel einer neugeborenen Maus 24 Stunden nach der Elektroporation eines EGFP-kodierenden Vektors. Die elektrobewerteten Zellen fluoreszieren grün.

Hier sehen wir, dass der laterale Ventrikel, der 28 Tage nach der Elektroporation von Cree-Rekombinase und GFP-kodierenden Plasmiden in Mäusen mit einem Stopp-Code stromaufwärts der TD-Tomate markiert ist, die Expression der TD-Tomate induziert, die in rot zu sehen ist, eine sukzessive Verdünnung des Plasmids, die zu wenigen verbleibenden EGFP-positiven SVZ-Zellen führt, oder eine genomisch exprimierte TD-Tomate wird dauerhaft exprimiert. Die Verdünnung des Plasmids, der grün dargestellten DNA, ist offensichtlich, da mehr Zellen in der Körnerzellschicht des Riechkolbens mit der Markierung OB den in rot gezeigten genomischen Marker TD-Tomate exprimierten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stammzellen aus der SVZ markiert und manipuliert.