Name: Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Lernen Sie die neonatale subventrikuläre Elektroporation zur genetischen Manipulation neuraler Stammzellen bei Neugeborenen. Diese Methode ermöglicht effiziente Markierung und Untersuchung neurogener Prozesse im Gehirn.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (Idea Development Award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stammzell-Stipendium (AB), und eine National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF) unterstützt. Das vorliegende Material basiert auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovations, Inc. hatte die Geldgeber keine Rolle in der Studie, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

Diese Vorgehensweise ist im Einklang mit Yale IACUC Anforderungen. Wissenschaftler sollten sicherstellen, dass IACUC Richtlinien zugelassen sind und nach ihrer institutionellen Voraussetzungen gefolgt. Ein. Abschnitt 1. Herstellung von DNA, Lösungen und Glaspipetten <ol><li> Generieren hoher Reinheit (OD 260/280&gt; 1,80) hoher Konzentration (ug / ul&gt; 2,5) Endotoxin-freien DNA. </li><li> Planen 0,9% iger Kochsalzlösung und steril filtriert durch ein 22 pm-Filter. </li><li> Platz 10 cm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillarrohre (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in ein Modell PP-830 Narishige PC-10 Glaspipette Abzieher mit einem Kanthal Draht. Set Abzieher einem Schritt gewichteten Pull bei 70,5 ° C. Brechen Sie Tipps mit kreisförmigen Pinzette und überprüfen unter einem Binokular für gezackte Ränder. Bevel Tipps und unter einer UV-Lampe für 15 min. Gezogen Pipetten sollte bei 2 mm von der Kante der Spitze zu kennzeichnen. </li><li> Bereiten 0,1% Gewicht / Volumen schnell grün Löauf durch Mischen sterilfiltriert 0,9% iger Kochsalzlösung mit trockenem schnell grün. </li></ol> 2. Abschnitt 2. Tierische Vorbereitung, Glaspipette Laden und Plasmid Injection <ol><li> Entfernen postnatalen Tag 0-1 Welpen einzeln aus Käfigen, statt auf eine Glas-Petrischale vorgekühlt auf 4 ° C, und legen Sie dann auf nassem Eis. </li><li> Nach ca. 5 min, bestimmen den Zustand der Betäubung durch die Nutzung der Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung auftritt, unterliegen Welpen zu intraventrikuläre Injektion. </li><li> Es ist wichtig zu beachten, dass die Kombination von schnell grün, DNA und Salzlösung kann in schneller Verdampfung, Kristallisation und Blockade Glaspipetten führen. Daher erzeugen eine Stammlösung und aliquoten 1-2 ul auf Parafilm unmittelbar vor Injektionen. </li><li> Saugen Sie die gesamte aliquotierten Lautstärke mit dem gezogenen Glaspipette. </li><li> Halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. </li><li> Schalten Sie Lampe eind Halten Sie den Kopf des Welpen etwas außerhalb des Lichtstrahls. Falls erforderlich, setzen auf den Kopf Kochsalzlösung, um die Menge an Licht, das von pup wider reduzieren. Die Ventrikel sollte nun beleuchtet werden. </li><li> Mit Ihrer dominanten Hand, die Nadel in lateralen Ventrikel am nächsten zu Ihnen (1A und 1B). Die Injektionsstelle sollte ungefähr gleich weit von der Lambdanaht und Auge und 2 mm lateral zur Sagittalnaht. Legen Sie zog Pipette auf die 2 mm Marke für eine P0 Welpen, die sollten das Eindringen in den lateralen Ventrikel zu gewährleisten. Zufällig, sehen Sie möglicherweise Verfüllen von CSF in die Pipette aus der Auflösung von Hirndruck. Um Hirndruck, die Injektion von Plasmid hilft zu reduzieren, lockern Sie Ihren Griff auf den Kopf des pup.Step 2,8. Inject rund 0,5 ul Plasmid in lateralen Ventrikel mit einem Luft-Druck-Injektor (Picospritzer, Parker). </li></ol> 3. Abschnitt 3. Elektroporation und Recovery <ol><li> Set die Spannung des Generators Elektroporation für 5 Rechteckimpulsen, 50 msec / Impuls bei 100 Volt mit 950 msec Intervallen. Die räumliche Spezifität von Plasmid Elektroporation wird durch die Bündelung von Charge-Transfer diktiert. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Platzierung angesichts der Heterogenität der Stammzell-Populationen entlang der SVZ 8 gegeben. Unterschiede in den Raten von Proliferation und das Schicksal der Zelle haben ventral-dorsal und rostral-kaudale Standorten 9,10 identifiziert worden. </li><li> Sobald das Plasmid injiziert wird, dip Pinzette Elektroden in PBS. Dieser Schritt dient dazu Ladungstransfer zu maximieren und Verbrennungen durch Widerstand zu verhindern. </li><li> Platzieren Sie die positive Elektrode auf der dorsalen seitlichen Wand des pup nahe dem Ohr ipsilateral zur Stelle von Plasmid-Injektion (1C und 1D). Zeigen die negative Elektrode auf der kontralateralen ventralen seitlichen des pup Schnauze. </li><li> Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls footsHexe Pedal und fegen die Elektroden von dorsal nach lateral mit ~ 25 °-Winkel Abständen. </li><li> Ort elektroporiert Jungtieren auf ein Heizkissen für 5 min. Drehen Sie vorsichtig Welpen alle 30 sec mit einer milden Stimulation. </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben zu machen.

Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptischer...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Schwere Polished Borosilikat Tubing </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF150-110-10 </td><td></td></tr><tr><td> Dual-Stage Glas Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Narishige </td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Fischer Scientific </td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square Wave Impulsgeber </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0488 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber-Optic Light Source </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten HalogenLampe </td><td> USHIO America, Inc </td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td> Parker Instruments </td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal subventrikulärzone elektroporation

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen 1 enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene 2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder in wirbellosen erforscht. Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung 3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn 5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation Ergebnisse bei der Etikettierung von fast allen radialen Gliazellen zusammenhängend mit dem Rücken, dorsal lateral und lateral Subventrikulärzone nach dem &quot;Sweeping&quot; Bewegung der Pinzette Elektrode (1E). Allerdings kann Elektroporation der Anforderung des jeweiligen Experiments zugeschnitten werden, aber nicht Fegen der Elektrode und unter Verwendung spezifischer Anordnung und Ausrichtung, wie in dem Video. Da beispielsweise dorsal örtlichen radialen...

Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die molekularen Bestandteile von neuralen Stammzellen der subventrikulären Zone genetisch zu markieren und zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit DNA beladene Glaspipette in den lateralen Ventrikel eines P null P eingeführt wird.Der zweite Schritt besteht darin, DNA in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit des lateralen Ventrikels auszustoßen. Als nächstes wird Strom an das P angelegt, was den Transfer von DNA auf neurale Stammzellen ermöglicht, die die Seitenventrikel auskleiden.Letztendlich wird eine Kombination molekularer Techniken, einschließlich Immunhistochemie, Molekularbiologie, Mikroskopie und Elektrophysiologie, verwendet, um Veränderungen des Schicksals, der Proliferation, der Migration und der Reifung von Neurostammzellen der subventrikulären Zone sichtbar zu machen. Die Elektroporation der subventrikulären Zone bei Neugeborenen kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurogenese zu beantworten, z. B. welche molekularen Signalwege für die Regulierung der Proliferation, Differenzierung, Migration und Reifung von neuronalen Stammzellen und ihren Nachkommen verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik geg

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In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

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