Live Cell Cycle Analysis von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relative Zellzyklusphase und die Zellgröße von Geweben mit genetisch manipulierten und mit GFP oder RFP markierten Zellpopulationen in Drosophila zu messen. Zuerst werden genetische Kreuzungen eingerichtet, um Nachkommen zu erzeugen, die Zellen enthalten, die mit den gewünschten fluoreszierenden Proteinen markiert sind, und mit den gewünschten genetischen Manipulationen in einem bestimmten Gewebe oder einer bestimmten Zellpopulation. Isolieren Sie das gewünschte Gewebe sauber aus den Nachkommen des richtigen Entwicklungsstadiums, dissoziieren Sie das Gewebe dann zu einer Einzelzellsuspension und färben Sie es mit einem lebensfähigen DNA-Farbstoff, um den DNA-Gehalt zu messen.

Analysieren Sie die gefärbten dissoziierten Proben mittels Durchflusszytometrie. Letztendlich messen die in vivo-Ergebnisse Veränderungen der Zellgröße und der Zellzyklusphase, die durch die untersuchten genetischen Manipulationen verursacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode der Durchflusszytometrie an lebenden Drosophila-Geweben unter Verwendung von ultravioletten Farbstoffen besteht darin, dass der violette Farbstoff des Färbezyklus mit kostengünstigeren Tischzytometern kompatibel ist, die einen violetten 4 0 5-Laser enthalten, der mit einem kleinen Budget erworben und in einem einzigen Labormaßstab gewartet werden kann.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Zellzyklus zu beantworten, indem sie Informationen über die Zellzyklusphase und die Zellgröße liefert, die detaillierter sind als nur die Messung der Gesamtgewebegröße und der Proliferationsrate. Das Verfahren wird von Kagel und Dan Sun, Doktoranden aus meinem Labor, und Olga Guko vorgeführt. Unser Techniker: Sammeln Sie reife Larven am dritten Larvenstadium Instar, etwa 110 bis 120 Stunden nach der Eiablage, für die Larvendissektionen.

Eine genaue Pupilleninszenierung ist für Studien während der Metamorphose für diese Ernte unerlässlich weiße Vorpuppe zu Beginn der Metamorphose Falls erforderlich, mesa versiegelte Petrischale von Puppen oder ein Fläschchen mit Larven in einem 37 Grad Celsius Wasserbad Um die Hitze zu aktivieren. Chuck Flip Base für die Abstammungsverfolgung von Klonen. Nachdem Sie die Petrischale geöffnet haben, legen Sie sie in einen Inkubator, um sie bis zum gewünschten Entwicklungsstadium für die Pupillendissektion zu altern.

Fassen Sie eine Puppe vorsichtig an der vorderen Spitze des Pupillengehäuses, wo sich eine Luftblase befindet, um eine Beschädigung der Puppe zu vermeiden, und positionieren Sie die schwimmende Puppe für den richtigen Griff. Schneiden Sie dann mit einer Mikroschere sauber durch die hintere Spitze der Puppe in einem leichten Winkel zum dorsalen Teil des Tieres, um den Innendruck abzulassen, ohne das Fett in das gewünschte Gewebe im Thorax zu zwingen, und schneiden Sie den Kopf vorsichtig entlang des dorsalen Medians ab, um eine Beschädigung der Flügel und des vorderen Auges zu vermeiden. Entfernen Sie dann die Pupille aus dem Pupillengehäuse, indem Sie den hinteren Rand der Pupillenepidermis mit einer Pinzette fassen und aus dem Pupillengehäuse herausziehen.

Übertragen Sie die präparierte Puppe in eine saubere Sezierschale. Stechen Sie mit einer Pinzette ein kleines Loch in die Nagelhaut vor dem Auge-Hirn-Komplex. Verwenden Sie eine Glaspasti-Pipette mit einem Gummikolben.

Waschen Sie die PBS-Präparierlösung vorsichtig durch die teilweise präparierte Puppe, um das verbleibende Fett und Darmgewebe zu entfernen. Um die Pupillenflügel zu erhalten, halten Sie die Puppe mit einer Pinzette und einer zweiten Pinzette am Kopf fest. Fassen Sie die hinterste Spitze der Flügelkutikula an, ziehen Sie sie von der Seite des Schlachtkörpers und lösen Sie sie.

Schneiden oder ziehen Sie dann den Flügel am Scharnier ab, um ihn vom Körper zu entfernen, und legen Sie ihn auf einen Haufen, weg von den Kadavern und anderem Material, um die Pupille, die Augen oder das Gehirn zu erhalten. Waschen Sie die Puppe, bis sich der Augen-Hirn-Komplex gelöst hat und sich von der Puppe befreit hat. Ziehen Sie das Pupillenauge mit einer Pinzette vorsichtig vom Gehirn weg und bewahren Sie das gewünschte Gewebe auf. Übertragen Sie das präparierte Gewebe vorsichtig mit einer geschmierten Pipette.

Inkubieren Sie die Röhrchen unter Schütteln bei 23 Grad Celsius bei 500 U/min für 70 Minuten. Anschließend fünf Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit sanft vortexen und die Proben für weitere 15 bis 20 Minuten in den Schüttler zurückführen. Der Vortex probt erneut fünf Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit für Gehirn und Pupillenaugen.

Älter als 36 Stunden. Ein PF dissoziiert Gewebe in DNA-Färbelösung bei 23 Grad Celsius bei 500 U/min für 45 bis 60 Minuten. Dann werden große Gewebestücke nacheinander manuell dissoziiert, indem sie zusammen mit etwa 50 Mikrolitern DNA-Färbelösung in eine Präparierschale gegeben werden.

Pipettieren Sie schnell auf und ab mit einer manuell an Ihrer Pipette vorbeigezogenen Pipette mit einer Öffnung von etwa 100 bis 150 Mikrometern. Bündeln Sie die dissoziierten Proben in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie weitere 30 Minuten bei 23 Grad Celsius und schütteln Sie bei 500 U/min.

Überprüfen Sie visuell, ob die Proben vollständig dissoziiert sind. Beachten Sie, dass die azelluläre transparente Pupillenflügelkutikula nicht assoziiert wird. Beginnen Sie die Faxanalyse, indem Sie die Probe auf das Zytometer laden.

Wählen Sie dann Kanäle aus, um Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung zu erkennen, die die Zellgröße und Membrankomplexität anzeigen. Um die violette Färbung der DNA im D-Zyklus nachzuweisen, müssen Sie VL eine Höhe, Breite und Fläche von der violetten Laseranregung messen. Wählen Sie auch den blauen Laserkanal einen Bereich aus, um die GFP-Fluoreszenz zu messen.

Für die RFP-Analyse verwenden wir den blauen Laserkanal drei. Dieser Kanal auf der Einstimmung ist für die RFP-Erkennung optimiert. Legen Sie die Gates fest, um die Analyse auf die ausgewählte Population zu beschränken und Trümmer zu begrenzen und Klumpen aus der Analyse zu verkaufen, die Stop-Plots mit Gate eins generiert, Debris und Klumpen in der Plot von SSC im Vergleich zu FSC im Plot von VL eine Fläche gegenüber VL eins mit GA zwei verwenden, um ungefärbte Zellen sub G eins apoptotische Zellen und Zellklumpen basierend auf der Identifizierung von Singuletts auszuschließen.

GA drei umfasst Zellen innerhalb der Gates eins und zwei, die im Diagramm der Fluoreszenz gegenüber dem DNA-Gehalt basierend auf VE L eine Höhe GFP-negativ sind. Der nächste Gang vier umfasst Zellen innerhalb der Gates eins und zwei, die im Diagramm der Fluoreszenz gegenüber dem DNA-Gehalt GFP-positiv sind. Man kann auch die Gates fünf und sechs aus Punktdiagrammen der Zellengröße erzeugen, die durch GFP im Vergleich zur Vorwärtsstreuung gemessen wird.

Um die Phaseneinteilung des Zellzyklus zu untersuchen, verwenden Sie die beiden Histogramme, die den DNA-Gehalt auf der x-Achse und die Zellzahl auf den Y-ais für die Populationen darstellen, die durch Gatter drei und vier definiert sind. Für die Zellengröße legen Histogramme die Populationen auf die Gates fünf und sechs fest und plotten FSC auf der x-Achse und counts auf der Y-Achse, wenn Stichproben ausgeführt werden, und legen die Aufzeichnung so fest, dass sie bei 10.000 stoppt. GFP-positive Ereignisse setzten auch das Akquisitionsvolumen auf 300 Mikroliter.

Die entsprechenden Schwellenwert- und Spannungseinstellungen sind in den bereitgestellten Vorlagen enthalten. Führen Sie die Proben mit Standard- oder Hochempfindlichkeit von 100 Mikrolitern pro Minute durch und zeichnen Sie sie auf. Die von der Attune-Software erzeugten aufgezeichneten Datendateien liegen im FCS-Format vor, das mit den meisten Zellzyklus-Modellierungsprogrammen kompatibel ist.

Dieser repräsentative Arbeitsbereich mit vier Punktdiagrammen und zwei Histogrammen zeigt eine Larvenflügelprobe, die GFP und Cyclin D im hinteren Flügel exprimiert, angetrieben von einem Grailed Gal 4-Transgen. Das erste Punktdiagramm der Zellgröße mit Gang eins schließt Ablagerungen und Klumpen aus. Das zweite Punktdiagramm unterscheidet Einzelzellen mit Gang zwei, um ungefärbte Zellen mit einem Sub-G-1D-NA-Gehalt auszuschließen, und Klumpen im Diagramm des GFP- gegenüber dem DNA-Gehalt.

Die negativen und positiven GFP-Zellen können unterschieden werden, und der Gehalt von zwei N und vier NDNA ist anhand der Position entlang der x-Achse erkennbar. Dieses Diagramm der Zellgröße, gemessen durch GFP im Vergleich zur Vorwärtsstreuung, wird verwendet, um die Gates fünf und sechs zu generieren. Die daraus resultierenden Analysen führen zu Histogrammen des DNA-Gehalts im Vergleich zu den Zählungen für die GFP- oder RFP-negative Population sowie für GFP- oder RFP-positive Zellen.

Verwenden der bereitgestellten RFP-Vorlage. Ähnliche Ergebnisse werden mit dem gleichen Gewebetyp und Expressionsmuster erzielt. Für RFP eignen sich die bereitgestellten Vorlagen und Spannungen für die Analyse von Larvenaugen, Gehirnen und Flügeln sowie von Pupillenaugen, Gehirnen und Flügeln.

In der abgestimmten Software. Die Verwendung der Autoscale-Funktion für die Histogramme des Zellzyklus oder der Zellgröße ermöglicht die Bestimmung des globalen Maximums für jede Population. Diese Zellzyklusprofile repräsentieren GFP-positive und -negative Zellen in Larvenaugen, die GFP im hinteren Bereich exprimieren.

Unter Verwendung der GMR GAL vier U-A-S-G-F-P Transgene zeigt das Overlay die Unterschiede in der Zellzyklusphasen der posterioren GFP-exprimierenden Zellen. Die relative Änderung der Zellgröße zwischen GFP-positiven und -negativen Zellen kann ebenfalls dargestellt werden. Dieses Zellzyklusprofil wurde aus Pupillengehirnen bei 46 Stunden A PF abgeleitet. Bei den GFP-positiven Zellen handelt es sich um Klone, die die Abstammungslinie verfolgen, die den G one S Regulator, Cyclin D und E two F exprimieren, die die Ruhe stören und zum Eintritt in die S-Phase führen.

Dies steht im Gegensatz zu den nicht exprimierenden GFP-negativen Zellen, die in diesem Stadium normalerweise arretiert werden. In G one generiert die Attune-Software benutzerdefinierte Bereiche in den Histogrammen, die G eins s und G zwei Phasen abgrenzen. Eine Statistiktabelle für jeden Durchlauf bestimmt die absolute Anzahl der Zellen innerhalb der benutzerdefinierten Bereiche und Prozentsätze.

Alternativ kann Modellierungssoftware wie mod fit verwendet werden, um Prozentsätze in jeder Phase sowie apoptotische Zellen zu schätzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Gewebe aus Drosophila für die Zellzyklusanalyse isolieren und markieren können.