Name: Graphene Coatings for Biomedical Implants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Beschichtung von Nitinol-Implantaten mit Graphen zur Verbesserung der Hämo-Kompatibilität. Diese Methode nutzt chemische Gasphasenabscheidung und Zellkultur-Experimente für biomedizinische Anwendungen.

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Ein. Graphen-Beschichtung von NiTi <ol><li> Die Graphen-Proben in dieser Studie verwendet wurden auf Kupfer (Cu)-Substraten unter Verwendung des chemischen Dampfabscheidungstechnik aufgewachsen, und anschließend zu 4,5 mm 2 NiTi Substrate übertragen. </li><li> Cu-Folien (1 cm x 1 cm) wurden in einer 1 in. Quarzrohrofen vorgelegt und auf 1000 ° C in Gegenwart von 50 sccm H 2 und 450 sccm Ar. </li><li> Weiter, Methan (1 und 4 sccm) wurde in den Ofen in verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten für 20-30 min eingeführt. Die Proben wurden schließlich auf Raumtemperatur unter strömendem H 2, Ar und CH 4 gekühlt. </li><li> Als nächstes wurden die Cu-Folien Schleuderbeschichtung mit PMMA (verdünnt mit 4% Anisol) bei 4.000 Umdrehungen pro Minute durch eine Wärmebehandlung für 5 min bei 150 ° C, gefolgt Graphen an PMMA-Schicht wurde durch Ätzen des Cu-Folie mit TRANSENE Inc., CE-100 Ätzmittel, und anschließendes Spülen in 10% HCl und deionisiertem Wasser für 10 min erhalten. </li><li> Die sBeispiele wurden auf NiTi Substrate (4,5 mm 2) überführt und getempert bei 450 ° C in Ar (300 sccm) und H 2 (700 sccm) für 2 Stunden, um die PMMA zu entfernen. Schließlich wurden die Substrate mit Aceton gewaschen, um das restliche PMMA löst, um den Gr-NiTi Probe zu erhalten. Ein XY Dilor Dreifach Gittermonochromator wurde für die Mikro-Raman-Charakterisierung (100X mit Objektiv) aller Gr-NiTisamples mit 514,5 nm Anregung von einem Ar +-Ionen-Laser verwendet. </li></ol> 2. In vitro-Toxizität von Gr-NiTi Ratte-Endothelzellen (Cell Anwendung Inc.) wurden auf einem 8 Kammern gelatinebeschichteten Schieber kultiviert. Für die Prüfung des Zellwachstums, makellos und Gr-NiTisubstrates wurden in Brunnen ohne Gelatineschicht platziert. Rasterelektronenmikroskopie-Bilder wurden mit einem Hitachi S-4800 SEM. Zusätzlich wurden Rattenaorta Glattmuskelzellen auch in Cellbind gezüchtet 96-Well-Platten als Kontrollgruppe (Corning) in Dulbecco-modifiziertes Eagle Medium (ATCC). <ol><li> Zum Testen Zelllebensfähigkeit wurden Zellen (sowohl Endothel-und glatten Muskelzellen) bei 10 5 Zellen / Vertiefung in Vertiefungen, die unberührten NiTi, 1 sccm oder 4 sccm Gr-NiTi Substraten, wobei die angegebenen sccm Methan entspricht der Strömung in der verwendete ausgesät CVD-Wachstum von Graphen. Die Zellen wurden für den gewünschten Zeitraum in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, den Austausch von Medien jeder andere Tag. </li><li> Am Ende Zeitpunkt wurde das Medium entfernt und frisches Medium, das 0,5 mg / ml Thiazolyl Blau tetrazoliumbromid (MTT oder von Sigma bezogen) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden dann für weitere 3 Stunden inkubiert. Für den MTS-Assay wurde das Medium in der letzten Zeitpunkt entfernt und durch 120 ul MTS Arbeitslösung (Cell 96 Grad wässrigen, Promega) und inkubiert für drei Stunden. </li><li> Weiter wurde das Medium vorsichtig entfernt und mit 100 ml Dimethylsulfoxid (Sigma) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach alloFlügel 10 min für die MTT-Kristalle aufzulösen, wurde die Lösung in ein anderes Well-Platte transferiert. Für den MTS-Assay wurde kein Dimethylsulfoxid in die Vertiefungen gegeben. Nun Inhalte wurden auf eine neue Platte bewegt. </li><li> Absorption wurde bei 490 nm abgelesen, und die prozentuale Lebensfähigkeit wurde durch Normalisierung der durchschnittlichen Absorption Extinktion der unberührten NiTi Probe bestimmt. Mindestens fünf Wiederholungen wurden für jede Probe gemacht Typs. </li></ol> 3. Konfokale Mikroskopie Studium der Zellmorphologie <ol><li> Für die konfokale Abbildung der Rattenaorta Glattmuskelzellen, wurden Substrate in einer 8-Kammer Schieber (Thermo Scientific) platziert. Die Zellen wurden bei 25.000 Zellen / Kammer ausgesät und 3 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Zellen wurden auf dem Substrat mit 4% Formaldehyd in Phosphat gepuffertem Kochsalz 20 min. </li><li> Permeabilisiert mit 0,1% Triton-X für 1 min. </li><li> Actin wurde mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (Lif gefärbte Technologies). 100 ul AlexaFluor 488 Phalloidin bei 200 Einheiten / ml in Methanol wurde auf 1,9 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Zellen wurden mit 250 ul AlexaFluor 488 Phalloidin für 45 min gefärbt und dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. </li><li> Zellkerne wurden mit fluoreszierenden Vectashield Eindeckmedium enthaltenden DAPI (Vector Laboratories) montiert ist. Konfokale Bilder wurden unter Verwendung eines Nikon Konfokale TI. Eine Kammer mit Zellen ohne Substrat ausgesät wurde als Kontrolle verwendet. </li></ol> 4. Proteinadsorptionsstudien <ol><li> Substrat Dimensionen wurden mit einer Schieblehre, bevor Sie die Proteinadsorption Experimenten gemessen. Drei Messungen wurden für jede Seite der etwa quadratischen Proben genommen und gemittelt, um die Länge und Breite erhalten. </li><li> Jede Probe, unberührte NiTi, 1sccm und 4sccm Gr-NiTiwere mit 1 mg / ml Albumin in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert (PBS) oder 1 mg / ml Fibrinogen in PBS bei Raumtemperatur temperatur für 3 Stunden. </li><li> Proben wurden unter gleichen Bedingungen in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 ul reduzierenden Probenpuffer versetzt und für 5 min gekocht. </li><li> Proben wurden dann in einem Tris / Glycine / SDS Puffer (Bio-Rad) verdünnt und durch eine 4-15% Tris Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel (Bio-Rad) bei 90 V für 100 min. </li><li> Die Gele wurden dann mit SYPRO Red angefärbt. Verdünnen SYPRO Red (Life Technologies) Stammlösung bei 1:5.000 in 7,5 v / v% Essigsäure. Stain Gele für 60 min. </li><li> Bild Gele mit einem Flourchem SP (Alpha Innotech). Fluoreszenzintensität quantifiziert wurde mit ImageJ Software. Fluoreszenzintensität jeder Probe wurde durch die Gesamtfläche des Substrats normalisiert und Fibrinogen-Adsorption wurde Adsorption an Albumin verglichen. </li></ol> 5. Western Blot für die Protein-Expression <ol><li> Western-Blot wurde durchgeführt, um insgesamt Aktin in Rattenaorta glatten Muskelzellen zu analysieren. Die Zellen wurden mit 10.000 Zellen / Substrat in einer 96-Gew ausgesätell Platte. </li><li> Die Zellen wurden drei Tage vor dem Entfernen Medium gezüchtet. Gesamtprotein wurde extrahiert mit RIPA-Puffer und ein Standard-BCA-Assay (Lamda) wurde durchgeführt, um Gesamtprotein quantifizieren. </li><li> Proben wurden auf die gleiche Konzentration in RIPA verdünnt und dann in einer reduzierenden Probenpuffer für 5 min gekocht. </li><li> Proteine ​​wurden durch einen 4-15% Tris Polyacrylamidgel über Elektrophorese bei 90 V für 100 min getrennt. Ein Kaleidoskop Proteinstandard (Bio-Rad) wurde verwendet, um Protein-Molekulargewicht zu beurteilen. </li><li> Proteine ​​wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und blockiert mit einer 1% fettfreier Trockenmilch (Bio-Rad)-Lösung. </li><li> Insgesamt Aktin wurde mit einem Kaninchen-anti-Ratte Aktin-Antikörper (Sigma) markiert. Eine chemilumineszente BM Kits (Roche) wurde verwendet, um den primären Antikörper erkennt. Membranen wurden unter Verwendung FlourChem SP bildgebenden Geräten und Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ Software. Fluoreszenzintensität wurde durch Vergleich mit der pri normalisiertstine NiTisample. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Biokompatibilität und Zytotoxizität: Die chemische Gasphasenabscheidung (CVD)-Verfahren ergab polykristallinen Graphenproben die Cu Kristallkörner, wie in 1a gezeigt nachgeahmt. Wir beschäftigten Raman-Spektroskopie, um das Vorhandensein von Monolayer (wenige Schicht) Graphen auf 1 sccm (4 sccm) Proben (siehe Abbildung 1b) bestätigen. Offensichtlich weisen 1 sccm (4 sccm) Proben intensiv (relativ schwächere) G &#39;band Hinweis auf Monoschicht (wenige Schicht) Graphen. ...

Die letzten drei Jahrzehnte haben Entdeckung neuartiger Materialien-basierten Therapien und Geräte für die Erkrankung von Medikamenten und diagnostischen erlebt. Neuartige Legierungen wie Nitinol (NiTi) und Edelstahl sind oft in der biomedizinischen Implantate Herstellung aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften verwendet. 1-3 jedoch zahlreiche Herausforderungen durch exogene Material Zytotoxizität bleiben, Bio-und Hämokompatibilität. Die Natur dieser metallischen Legierungen führt zu schlechter Bioverfügbarkeit und Hämokompatibilität durch Metall Auslaugen, mangelnde Zell-Adhäsion, Proliferation und Thrombose, wenn es in Kontakt mit strömenden Blutes (wie Katheter, Transplantaten Blutgefäß, vaskulären Stents, künstliche Herzklappen etc.). 1, 4, 5 Das Zusammenspiel von Proteinen oder lebenden Zellen mit der Oberfläche des Implantats kann zu einer starken Immunantwort und der anschließenden Kaskade von biochemischen Reaktionen führen kann negative Auswirkungen auf die Gerätefunktionen. Daher wird pertinENT, um die Kontrolle über die Wechselwirkungen zwischen biomedizinischen Implantaten und Umgebung biologischen Umgebung zu erreichen. Oberflächenmodifizierung wird oft verwendet, um Reduktion oder Prävention der nachteiligen physiologischen Reaktion, die aus dem Implantatmaterial. Eine ideale Oberflächenbeschichtung soll hohe Haftfestigkeit, chemische Trägheit hohe Glätte und gute Hämo-und Bioverträglichkeit aufweisen. Bisher wurden zahlreiche Materialien einschließlich diamantartigem Kohlenstoff (DLC), SiC, TiN, TiO 2 und viele Polymermaterialien als biokompatiblen Implantats Oberflächenbeschichtungen getestet. 1, 6-23 Jedoch sind diese Materialien noch nicht alle treffen die funktionalen Kriterien für ein geeignetes Implantat Oberflächenbeschichtung. Die Entdeckung-dicke Schicht von sp 2 Kohlenstoff als Graphen bekannt, hat Türen für die Entwicklung neuartiger Multifunktionsmaterialien geöffnet. Graphene wird erwartet, dass ein idealer Kandidat für Implantat Oberflächenbeschichtung sein, da esist chemisch inert, atomar glatt und sehr langlebig. In diesem Brief, untersuchen wir die Lebensfähigkeit von Graphen als Oberflächenbeschichtung für biomedizinische Implantate. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Graphen beschichteten Nitinol (NiTi-Gr) alle funktionellen Kriterien erfüllt, und unterstützt zusätzlich ausgezeichnete glatte Muskelzellen und Endothelzellen Zellwachstum führt zu besseren Zellproliferation. Wir finden auch, dass die Serum-Albumin Adsorption auf Gr-NiTi höher als Fibrinogen ist. Wichtig ist, dass (i) unsere detaillierte spektroskopische Messungen bestätigten das Fehlen von Ladungstransfer zwischen Graphen und Fibrinogen darauf hindeutet, dass Graphen Beschichtung hemmt Thrombozytenaktivierung durch Implantate, (ii) Graphen Beschichtungen zeigen keine signifikante in vitro Toxizität für Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelllinien bestätigt ihrer Biokompatibilität, und (iii) Graphen Beschichtungen sind chemisch inert, robust und undurchlässigen im fließenden Blut Umwelt. Diese Hämo-und biokompatiblen Eigenschaften, zusammen mit hoher strength, chemische Beständigkeit und Langlebigkeit, machen Graphen Beschichtungen als ideale Oberflächenbeschichtung.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Dulbeccos Modified Eagle Medium </td><td> ATCC </td><td> 30-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Thiazolylblau tetrazoliumbromid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter 96 Aqueous Eine Lösung Zellproliferationsassay (MTS) </td><td> Promega </td><td> G3582 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> 36,5% Formaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8775 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor 488 Phalloidin </td><td> Life Technologies </td><td> A12379 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield Eindeckmedium mit DAPIch </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Humanserumalbumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9511 </td><td></td></tr><tr><td> Humanes Fibrinogen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris / Glycin / SDS </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0732 </td><td></td></tr><tr><td> Ready Gel Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1158 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45726 </td><td></td></tr><tr><td> SYPRO Red </td><td> Life Technologies </td><td> S-6653 </td><td></td></tr><tr><td> Protein Low BCA-Assay </td><td> Lamda Biotech </td><td> G1003 </td><td></td></tr><tr><td> Precision Plus Protein Kaleidoscope Norm </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0375 </td><td></td></tr><tr><td> Immun-Blot PVDF-Membran </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0177 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Grade Blocker fettfreie Trockenmilch </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404XTU </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Aktin-Antikörper in Kaninchen produziert </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2066 </td><td></td></tr><tr><td> BM Chemilumineszenz Western Blot Kit (Maus / Kaninchen) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11520709001 </td><td></td></tr><tr><td> RIPA Puffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R0278 </td><td></td></tr><tr><td> NiTi (51% Ni, 49% Ti) </td><td> Alfa-Aesar </td><td> 44953 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Horiba JobinYvon </td><td> Raman-Spektrometer </td><td> Dilor XY 98 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon </td><td> Konfokalmikroskop </td><td> Eclipse-TI-Mikroskop </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Thermoscientific </td><td> Plattenlesegerät </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad </td><td> Stromversorgung </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac grundlegende Versorgung </td></tr><tr><td> Bio-Rad </td><td> Elektrophoresezelle </td><td> 165-8004 </td><td> Mini-PROTEAN Tetra Zelle </td></tr><tr><td> Bio-Rad </td><td> Gelhalterung Kassette </td><td> 170-3931 </td><td> Mini-Kassette Gelhalterung </td></tr></tbody></table>

graphene coatings for biomedical implants

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomar glatten Graphen als Oberflächenbeschichtung hat Potential Implantat zu verbessern. Dies zeigt ein Verfahren zur Beschichtung Nitinollegierungen mit Nanometer dicke Schichten aus Graphen für Anwendungen als Stentmaterial. Graphen wurde auf Kupfer Substrate durch chemische Dampfabscheidung gezüchtet und dann auf Nitinolsubstraten übertragen. Um zu verstehen, wie die Graphen Beschichtung könnte biologische Reaktion zu ändern, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen von Ratten-Endothelzellen und Rattenaorta glatten Muskelzellen untersucht. Außerdem wurde die Wirkung von Graphen-Beschichtungen auf Zelladhäsion und Morphologie mit fluoreszierendem konfokale Mikroskopie untersucht. Zellen wurden für Actin und Kerne angefärbt, und es waren deutliche Unterschiede zwischen unberührten Nitinol Proben verglichen, um Graphen-beschichteten Proben. Insgesamt Aktin Expression von Rattenaorta glatten Muskelzellen gefunden wurde mittels Western Blot. Proteinadsorption Eigenschaften, ein Indikator für potenzielle Thrombogenität, were für Serumalbumin und Fibrinogen mit Gelelektrophorese bestimmt. Darüber hinaus wurde die Übertragung von Ladung von Fibrinogen an das Substrat hervorgerufen, die mittels Raman-Spektroskopie. Es wurde festgestellt, dass Graphen Beschichtung auf Nitinolsubstraten die funktionalen Anforderungen für eine Stent-Material erfüllt und verbessert die biologische Reaktion im Vergleich zu unbeschichteten Nitinol. So ist Graphen-beschichteten Nitinol ein brauchbarer Kandidat für einen Stent Material.

<img src="/files/ftp_upload/50276/50276fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> . Abbildung 1 a) CVD gewachsen polykristallinen Graphen auf Cu-Folien imitiert die Metall-Kristallkörner (Maßstab: 10 um). b) Raman-Spektrum von 1 sccm (4 sccm) Graphen zeigt intensive (relativ schwächer) G &#39;Bande, die Monoschicht (wenige Schicht) Art des so hergestellten Graphen. c) AFM-Bild von Graphen auf NiTi übertragen zeigt eine Rauheit von ~ 5 nm. Maßstab = 500 nm. <p class="jov...

Graphene bietet Potenzial als Beschichtungsmaterial für biomedizinische Implantate. In dieser Studie zeigen wir, ein Verfahren zur Beschichtung Nitinollegierungen mit Nanometer dicken Schichten von Graphen und bestimmen, wie Graphen kann Implantat Reaktion beeinflussen.

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Beschichtung von metallischen Formgedächtnislegierungen aus Nitinol mit Graphen zur Verbesserung der Hämokompatibilität bei implantierbaren Materialien, die mit Blut in Kontakt kommen, zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Graphen zunächst mittels chemischer Gasphasenabscheidung auf Kupferfolien abgeschieden wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kupferfolien wegzusäuern und das so hergestellte Graphen auf Nitinol-Substrate zu übertragen.Anschließend werden die mit Graphen beschichteten Nitinol-Substrate zur Kultivierung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen verwendet. Zur Quantifizierung der Biokompatibilität dient ein weiterer Test, bei dem die Hämokompatibilität überprüft wird, indem beide Proteine, Fibrinogen und Albumin, auf die mit Graphen beschichteten Nitinol-Substrate aufgebracht werden. Letztendlich kommen Mikro-Raman-Spektroskopie, konfokale Mikroskopie, In-vitro-Zytotoxizitätsassays und die Proteinanalyse mittels SDS-Page zum Einsatz, um eine erfolgreiche Graphenbeschichtung, verbesserte Zellmorphologie, erhöhte Zellviabilität und eine bessere Hämokompatibilität nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Polymerbeschichtung liegt darin, dass Graphenbeschichtungen äußerst langlebig und korrosionsbeständig sind. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Verbesserung der Stent-Technologien, da die inhärenten Materialeigenschaften von Graphen voraussichtlich die Proteinaufnahme verringern und die Aktivierung von Gerinnungsfaktoren aufgrund konformationeller Proteinveränderungen reduzieren. Obwohl diese Methode Einblicke in graphenbeschichtete Nitinol-Stents ermöglicht, kann sie auch für andere Systeme wie Herzklappen oder Katheter verwendet werden.Als Erstes ein mal ein Zentimeter große Kupferfolien in einen ein Zoll langen Quarzrohrofen geben und unter Zusatz von 50 SCCM Wasserstoff und 450 SCCM Argon auf 1000 Grad Celsius erhitzen. Anschließend ein bis vier SCCM Methan mit unterschiedlichen Durchflussraten für 20 bis 30 Minuten in den auf 1000 Grad Celsius erhitzten Ofen einleiten. Die Proben im Ofen unter fließendem Wasserstoff, Argon und Methan auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Nach dem Entnehmen der Proben aus dem Ofen schneiden Sie diese in 4,5 Millimeter große Quadrate und verwenden PMMA, das mit 4 % Anole verdünnt wurde, um die Kupferfolien bei 4.000 U/min zu beschichten, gefolgt von einer Wärmebehandlung für fünf Minuten bei 150 Grad Celsius. Ätzen Sie die Kupferfolie mit CE 100-Ätzmittel, bis die Kupferfolie vollständig geätzt ist. Spülen Sie 10 Minuten lang mit 10 %iger Salzsäure, danach 10 Minuten lang mit entionisiertem Wasser.Um die Graphen-PMMA-Probenübertragung durchzuführen, übertragen Sie die Graphenproben auf 4,5 Quadratmillimeter große Nitinol-Substrate. Anschließend zwei Stunden bei 450 Grad Celsius in 300 SCCM Argon und 700 SCCM Wasserstoff ausheizen. Um das PMMA zu entfernen, spülen Sie die Nitinol-Substrate abschließend mit Aceton, um das verbleibende PMMA aufzulösen, und erhalten so die Graphen-Nickel-Titan-Probe.Zur Durchführung der Toxizitätsprüfungen werden zunächst reine Nitinol-Substrate mit einem SCCM oder vier SCCM Graphen in 96-Well-Platten gegeben, wobei die angegebenen SCCM-Werte dem Methanfluss entsprechen, der beim chemischen Gasphasenabscheidungsverfahren (CVD) zur Graphenherstellung verwendet wurde. Anschließend werden in einigen der Wells mit reinem Nitinol, einem SCCM oder vier SCCM Graphen-Nitinol-Substraten Ratten-Aortenendothelzellen mit einer Dichte von 105 Zellen pro Well ausgesät. In einem anderen Satz von Wells werden Ratten-Aorten-Smooth-Muskelzellen in ähnlicher Weise ausgesät.Züchten Sie die Zellen drei oder sieben Tage im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Zum Ende des Zeitpunkts entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen mit glatten Muskelzellen und geben frisches Medium mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT hinzu. Inkubieren Sie die Zellen weitere drei Stunden.Als Nächstes entfernen Sie vorsichtig das Medium und geben 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung. Nach einer 10-minütigen Inkubation zur Auflösung der MTT-Kristalle überführen Sie die Lösung in eine andere Mikrotiterplatte. Für den MTS-Assay entfernen Sie das Medium von den Vertiefungen mit Endothelzellen zum Endezeitpunkt.Ersetzen Sie durch 120 Mikroliter MTS-Lösung und inkubieren Sie drei Stunden lang. Danach überführen Sie den Inhalt der Vertiefung in eine neue Platte. Messen Sie die Absorption bei 490 Nanometern und bestimmen Sie die prozentuale Vitalität, indem Sie die Absorption auf die durchschnittliche Absorption der unveränderten Nitinol-Probe normalisieren.Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Probe mindestens fünfmal. Für die konfokale Bildgebung von glatten Muskelzellen der Aorta von Ratten geben Sie die Substrate in eine Acht-Kammer-Schiebe und lassen dabei eine Kammer als Kontrolle leer. Anschließend säen Sie die Zellen in alle Kammern mit 25.000 Zellen pro Kammer aus und inkubieren sie drei Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Nachdem das Medium von den Objektträgern entfernt wurde, fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd in PBS-Puffer. Waschen Sie mit PBS und permeabilisieren Sie anschließend eine Minute lang mit 0,1 % Triton X. Nach dem Waschen mit PBS geben Sie 100 Mikroliter der LOR 4 88 PHIN-Lösung zu 1,9 Millilitern PBS-Puffer hinzu.Um das Aktin sichtbar zu machen, färben Sie die Zellen mit 250 µL LOR 4 88 Phin für 45 Minuten und waschen Sie anschließend zweimal mit PBS-Puffer. Danach färben Sie die Zellkerne mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium, das dpi enthält. Sammeln Sie konfokale Bilder mit einem Nikon-Konfokalmikroskop ti.Bevor Sie mit den Albumin- und Fibrinogen-Proteinabsorptionsversuchen beginnen, messen Sie die Substratmaße mit einem Messschieber. Nehmen Sie für jede Seite der annähernd quadratischen Proben drei Messungen vor und bilden Sie den Durchschnitt. Um Länge und Breite zu erhalten, legen Sie die intakte Nitinol-Probe, die eine SCCM-Graphen-Nitinol-Probe und die vier SCCM-Graphen-Nitinol-Probe in zwei 12.Geben Sie in die Wells Platten Puffer mit Phosphat-gepufferter Kochsalzl&ouml;sung (PBS), der ein Milligramm pro Milliliter Albumin enth&auml;lt. Geben Sie Puffer mit Raumtemperatur in eine der Platten und inkubieren Sie diese separat drei Stunden lang. Inkubieren Sie die drei Probenarten mit PBS-Puffer, der ein Milligramm pro Milliliter Albumin enth&auml;lt.Fibrinogen bei Raumtemperatur drei Stunden lang, nachdem die Proben mit PBS gewaschen wurden; anschließend die ähnlichen Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer vereinigen und fünf Minuten lang kochen. Die Proben im Volumenverhältnis 1 zu 9 mit T-Glycin-SDS-Puffer zu entionisiertem Wasser verdünnen und 100 Minuten lang bei 90 Volt durch ein 4–15 % Tris-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel laufen lassen. Die Spro-Rot-Standardlösung im Verhältnis 1 zu 5.000 in 7,5 %iger Essigsäure verdünnen.Färben Sie die Gele anschließend 60 Minuten lang mit der verdünnten Spro-Rot-Lösung. Wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein, um die Spro-Rot-Färbung vor Licht zu schützen, und dokumentieren Sie die Gele mit einem FluorChem SP. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität mithilfe der Image-J-Software. Normalisieren Sie dann die Fluoreszenzintensität jeder Probe anhand der Gesamtfläche des Substrats und vergleichen Sie die Fibrinogen-Absorption mit der Albumin-Absorption.Die chemische Gasphasenabscheidung ergab polykristalline Graphenproben, die Kupferkristallkörner nachahmen. Mithilfe der Ramanspektroskopie wurde die Anwesenheit von einlagigem Graphen in Proben mit einem SCCM und vier SCCM bestätigt. Die Probe mit einem SCCM weist ein intensives GPR-Band auf, das die einlagige Natur des hergestellten Graphens anzeigt. Im Gegensatz dazu zeigt die Probe mit vier SCCM ein relativ schwächeres GPR-Band, was die Anwesenheit mehrerer Graphenschichten bestätigt. Abgebildet ist hier ein Bild der Rasterkraftmikroskopie von Graphen, das auf Nitinol-Substrate übertragen wurde.Detaillierte Messungen der Probe ergaben einen Wert der Oberflächenrauheit von etwa fünf Nanometern. Gezeigt sind hier die konfokalen optischen Mikroskopiebilder von glatten Muskelzellen, die auf einer kontrollierten Glasrutsche, auf unveränderten Nitinol-Substraten, auf einem SCCM-Graphen-Nitinol-Substrat und auf vier SCCM-Graphen-Nitinol-Substraten kultiviert wurden. Die Zellen sind auf beiden Graphen-Nitinol-Oberflächen dicht und sphärisch, was eine verbesserte Zellmorphologie zeigt.Die MTT- und MTS-Assays zeigen, dass ein und vier SCCM Graphen-Nitinol-Substrate im Vergleich zu reinem Nitinol keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Lebensfähigkeit glatter Muskelzellen aufweisen. Die MTS-Assays zeigen, dass die Zelllebensfähigkeit der endothelialen Zellen nach drei Tagen nicht signifikant von der der Kontrollen abweicht. Die Rasterelektronenmikroskopie-Bilder zeigen, dass die auf reinen Nitinol-Substraten kultivierten endothelialen Zellen spärlich und gestreckt sind, während sie auf den ein und vier SCCM Graphen-Nitinol-Substraten ellipsoid und dicht angeordnet sind.Diese Ergebnisse zeigen, dass Graphenbeschichtungen zu einer besseren sphärischen Zellmorphologie von Endothelzellen führen; die eine SCCM und vier SCCM Graphen-Nitinol-Proben weisen im Vergleich zur reinen Nitinol-Probe ein niedriges Fibrinogen-Albumin-Verhältnis auf, was auf eine verbesserte Hämokompatibilität durch Graphen hindeutet. Die Gleichstellung des Fermi-Niveaus wird durch das Energieniveaudiagramm für Fibrinogen und die Dichte der elektronischen Zustände für Graphen veranschaulicht. Ein Elektronentransfer von Fibrinogen zu Graphen-Nitinol ist nur möglich von den besetzten elektronischen Zuständen des Fibrinogen-Moleküls in die unbesetzten elektronischen Zustände von Graphen-Nitinol auf dem gleichen Energieniveau.Sowohl ein- als auch mehrschichtiges Graphen sind bei Raumtemperatur Halbmetalle mit geringer Elektronendichte am Fermi-Niveau, was zu einer schwachen Ladungsübertragung von Fibrinogen auf Graphen führt. Graphen zeigt keine Veränderungen in der Linienform oder Frequenz des G-Bandes, was auf eine schwache Ladungsübertragung von den Plasmaproteinen hinweist. Die aus der Kurvenanpassung erhaltenen entfalteten D-Peaks sind in Schwarz dargestellt, um die Nützlichkeit und Eignung von Graphen als Implantatbeschichtung zu demonstrieren.Eine mit Graphen beschichtete Kupfermünze wurde 5 %iger Wasserstoffperoxidlösung ausgesetzt. Der mit Graphen beschichtete Bereich der Münze blieb unverändert, während der unbeschichtete Teil durch die Wasserstoffperoxidlösung verfärbt wurde. Zusätzlich zeigte Graphen-Nitinol, das in 70 %iger Salpetersäure eingetaucht wurde, keine Änderung der GB-Bandenfrequenz, was bestätigt, dass die Graphenbeschichtung äußerst langlebig ist.Außerdem verringerte die Graphenbeschichtung in Graphen-Nitinol die X-Rate des zugrunde liegenden Kupfers, was auf die Undurchlässigkeit von Graphenmembranen hinweist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Graphen auf biomedizinische Implantate überträgt, um deren Biokompatibilität zu verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Graphene Coatings for Biomedical Implants

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