Graphene Coatings for Biomedical Implants

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Beschichtung einer metallisch geformten Memory-Legierung Nitinol mit Graphen zu demonstrieren, um die Hämokompatibilität in blutberührenden Implantatmaterialien zu verbessern. Dies wird erreicht, indem zunächst Graphen auf Kupferfolien mittels chemischer Gasphasenabscheidung gezüchtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kupferfolien wegzuätzen und das vorbereitete Graphen auf Nitinolsubstrate zu übertragen.

Als nächstes werden die mit Graphen beschichteten Nitinol-Substrate zur Kultivierung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen verwendet. Um die Zytokompatibilität zu quantifizieren, besteht ein weiterer Assay darin, die Hämokompatibilität zu überprüfen, indem beide Proteine, Fibrinogen und Albumin, auf die mit Graphen beschichteten Nitinolsubstrate kodiert werden. Letztendlich werden Mikro-Ramin-Spektroskopie, konfokale Mikroskopie in vitro Zytotoxizitätsassays und SDS-Seitenproteinanalysen verwendet, um eine erfolgreiche Graphenbeschichtung, eine verbesserte Zellmorphologie, eine verbesserte Zellviabilität und eine bessere Hämokompatibilität zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Techniken wie der Polymerbeschichtung besteht darin, dass Graphenbeschichtungen extrem langlebig und korrosionsbeständig sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Verbesserung der Herkunft von Stenttechnologien, da erwartet wird, dass die inhärenten Materialeigenschaften von Graphen die Proteinabsorption reduzieren und die Aktivierung von Gerinnungsfaktoren aufgrund von Proteinbestätigungsänderungen verringern. Diese Methode kann jedoch Einblicke geben: Mit Graphen beschichtete Nitinol-Stents können auch für andere Systeme wie Herzklappen oder Katheter verwendet werden.

Legen Sie zunächst einen Zentimeter mal einen Zentimeter großen Kupferfolien in einen 1-Zoll-Quarzrohrofen und erhitzen Sie ihn in Gegenwart von 50 SCCM Wasserstoff und 450 SCC CM Argonnen auf 1000 Grad Celsius. Als nächstes werden ein und vier SCCM Methan 20 bis 30 Minuten lang bei unterschiedlichen Durchflussraten in den 1000 Grad Celsius heißen Ofen gegeben. Kühlen Sie die Proben im Ofen unter strömendem Argonnenwasserstoff und Methan auf Raumtemperatur ab.

Nachdem Sie die Proben aus dem Ofen genommen haben, schneiden Sie sie in 4,5 Millimeter große Quadrate und verwenden Sie PMMA, verdünnt mit 4%Anol, um die Kupferfolien bei 4.000 U/min zu schludern, gefolgt von einer fünfminütigen Wärmebehandlung bei 150 Grad Celsius. Ätzen Sie die Kupferfolie mit CE 100 Ätzung, bis die Kupferfolie vollständig geätzt ist. 10 Minuten in 10%iger Salzsäure spülen, dann 10 Minuten in entionisiertem Wasser.

Um die Graphen-PMMA-Probe zu erhalten, werden die Graphenproben auf 4,5 Quadratmillimeter große Nitinol-Substrate übertragen. Weiter bei 450 Grad Celsius in 300 SCCM Argon und 700 SCCM Wasserstoff für zwei Stunden. Um das PMMA zu entfernen, waschen Sie abschließend die Nitinolsubstrate mit Aceton, um das restliche PMMA aufzulösen und die Graphen-Nickel-Titan-Probe zu erhalten.

Zu Beginn der Toxizitätstests geben Sie reines Nitinol, ein SCCM oder vier SCCM-Graphen-Nitinol-Substrate auf 96-Well-Platten, wobei der angegebene SCCM dem Methanfluss entspricht, der beim Wachstum der chemischen Gasphasenabscheidung von Graphen verwendet wird. Als nächstes säen Sie Ratten-Aorten-Endothelzellen in 10 bis fünf Zellen pro Vertiefung in einigen der Vertiefungen, die reines Nitinol, ein SCCM oder vier SCCM enthalten. Graphen-Nitinol-Substrate säen glatte Muskelzellen der Aorta von Ratten auf ähnliche Weise in einem anderen Satz von Vertiefungen.

Züchten Sie die Zellen drei Tage oder sieben Tage lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei Sie jeden zweiten Tag Medien austauschen. Entfernen Sie zum Endzeitpunkt das Medium aus den Vertiefungen mit den glatten Muskelzellen und fügen Sie jeweils frische Medien mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT hinzu. Inkubieren Sie die Zellen weitere drei Stunden lang.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Medium und geben Sie 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, bis sich die MTT-Kristalle aufgelöst haben, übertragen Sie die Lösung auf eine andere Well-Platte. Entfernen Sie für den MTS-Assay das Medium zum Endzeitpunkt aus den Vertiefungen mit Endothelzellen.

Durch 120 Mikroliter MTS-Lösung ersetzen und drei Stunden inkubieren. Übertragen Sie dann den Inhalt der Vertiefung auf eine neue Platte. Lesen Sie das Absorptionsmittel bei 490 Nanometern ab und bestimmen Sie die prozentuale Viabilität, indem Sie die Absorption auf die durchschnittliche Absorption der unberührten Nitinolprobe normalisieren.

Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens fünfmal für jede Probe. Für die konfokale Bildgebung von glatten Muskelzellen der Aorta von Ratten legen Sie die Substrate in einen Objektträger mit acht Kammern, wobei eine Kammer als Kontrolle leer bleibt. Als nächstes säen Sie die Zellen in allen Kammern mit 25.000 Zellen pro Kammer aus und inkubieren drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nachdem Sie das Medium von den Objektträgern entfernt haben, kleben Sie die Zellen 20 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd in PBS-Puffer auf das Substrat. Mit PBS waschen, dann eine Minute lang mit 0,1 % Triton X einweichen. Nach dem Waschen mit PBS 100 Mikroliter der LOR 4 88 HIN-Lösung zu 1,9 Millilitern PBS-Puffer hinzufügen.

Um Akton zu visualisieren, färben Sie die Zellen 45 Minuten lang mit 250 Mikrolitern LOR 4 88 Phin und waschen Sie sie dann zweimal mit PBS-Puffer. Als nächstes färben Sie die Zellkerne mit einem fluoreszierenden Einbettmedium, das dpi enthält. Erfassen Sie konfokale Bilder mit einer konfokalen Nikon-Ti.

Bevor Sie mit den Experimenten zur Absorption von Albumin- und Fibrinogenproteinen beginnen, messen Sie die Substratabmessungen mit Messschiebern. Nehmen Sie drei Messungen für jede Seite der annähernd quadratischen Proben vor und mitteln. Um die Länge und Breite zu erhalten, platzieren Sie die unberührte Nitinol-Probe, die eine SCCM Graphen-Nitinol-Probe und die vier SCCM Graphen-Nitinol-Proben in zwei 12.

Well-Platten fügen PBS-Puffer hinzu, der ein Milligramm pro Milliliter Albumin enthält. Geben Sie Raumtemperatur in eine der Platten und inkubieren Sie sie separat drei Stunden lang. Inkubieren Sie die drei Probentypen mit PBS-Puffer, der ein Milligramm pro Milliliter enthält.

Fibrinogen drei Stunden lang bei Raumtemperatur Nach dem Waschen der Proben mit PBS werden die gleichen Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern reduzierendem Probenpuffer kombiniert und fünf Minuten lang zum Kochen gebracht. Verdünnen Sie die Proben in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von ein bis neun Volumen-zu-Volumen-Puffer mit deionisiertem Wasser und lassen Sie sie 100 Minuten lang durch ein vier bis 15 %iges Polyacrylamid-Elektrophoresegel bei 90 Volt laufen. Verdünnen Sie die gespröte Stammlösung im Verhältnis eins zu 5.000 in 7,5%iger Essigsäure.

Anschließend färben Sie die Gele 60 Minuten lang mit der verdünnten sproroten Lösung. Wickeln Sie es mit einem Fluor chem SP in Aluminiumfolie ein, um das Spro-Rot vor leichten Bildgelen zu schützen, und quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität mit der Image J-Software. Normalisieren Sie dann die Fluoreszenzintensität jeder Probe um die Gesamtfläche des Substrats und vergleichen Sie die Fibrinogenabsorption mit der Albuminabsorption.

Die chemische Gasphasenabscheidungsmethode lieferte polykristalline Graphenproben, die Kupferkristallkörner nachahmen. Die Ramen-Spektroskopie wurde verwendet, um das Vorhandensein von Monolayer-Graphen auf einer SCCM und vier SCCM-Proben zu bestätigen. Die eine SCCM-Probe weist eine intensive GPR-Bande auf, die auf die Monoschichtnatur des präparierten Graphens hinweist. Im Gegensatz dazu zeigen die vier SCCM-Proben eine relativ schwächere GPR-Bande, was das Vorhandensein einiger Graphenschichten bestätigt. Hier abgebildet ist eine Rasterkraftmikroskopie-Aufnahme von Graphen, das auf Nitinol-Substrate übertragen wurde.

Detaillierte Messungen der Probe ergaben einen Wert für die Oberflächenrauheit von etwa fünf Nanometern. Gezeigt. Hier sind die konfokalen optischen Mikroskopiebilder für glatte Muskelzellen, die auf einem kontrollierten Objektträger auf unberührten Nitinol-Substraten auf einem SCCM-Graphen-Nitinol-Substrat und auf vier SCCM-Graphen-Nitinol-Substraten gezüchtet wurden. Die Zellen sind auf beiden Graphen-Nitinol-Oberflächen dicht und kugelförmig, was eine bessere Zellmorphologie zeigt.

Die MTT- und MTS-Assays zeigen, dass ein und vier SCCM-Graphen-Nitinol-Substrate keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit der glatten Muskelzellen im Vergleich zu reinem Nitinol aufweisen. Die MTS-Assays zeigen, dass sich die dreitägige Zellviabilität der Endothelzellen nicht signifikant von der der Kontrollen unterschied. Die Rasterelektronenmikroskopie-Bilder zeigen, dass die Endothelzellen, die auf unberührten Nitinol-Substraten gezüchtet werden, spärlich und länglich sind, während sie auf den ein und vier SCCM-Graphen-Nitinol-Substraten ellipsoid und dicht sind.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Graphenbeschichtungen zu einer besseren sphärischen Zellmorphologie von Endothelzellen führen, wobei eine SCCM- und vier SCCM-Graphen-Nitinol-Proben ein niedriges Fibrinogenalbumin-Verhältnis im Vergleich zur ursprünglichen Nitinol-Probe aufweisen, was auf eine bessere Hämokompatibilität durch Graphen hindeutet. Die Äquilibrierung des Fermi-Niveaus wird durch das Energieniveaudiagramm für Fibrinogen und die Dichte der elektronischen Zustände für Graphen dargestellt. Ein Elektronentransfer von Fibrinogen zu Graphen-Nitinol ist nur von den besetzten elektronischen Zuständen des Fibrinogen-Moleküls in leere elektronische Zustände von Graphen-Nitinol bei gleichem Energieniveau möglich.

Sowohl Mono- als auch Vielschichtgraphen sind bei Raumtemperatur Halbmetalle mit geringer Elektronendichte auf der Wutebene, was zu einem schwachen Ladungstransfer von Fibrinogen zu Graphen führt. Graphen zeigt keine Veränderungen in der Form oder Frequenz der GB-Bande, was auf einen schwachen Ladungstransfer von den Plasmaproteinen hindeutet. Die gewundenen D-Peaks, die durch die Kurvenanpassung erhalten wurden, sind schwarz dargestellt, um die Nützlichkeit und Lebensfähigkeit von Graphen als Implantatbeschichtung zu demonstrieren.

Ein mit Graphen beschichteter Kupferpfennig wurde 5% Wasserstoffperoxid ausgesetzt. Der mit Graphen beschichtete Teil des Pennys blieb unverändert, während der unbedeckte Teil durch die Wasserstoffperoxidlösung verfärbt wurde. Darüber hinaus zeigte Graphen-Nitinol, das in 70%ige Salpetersäure getaucht war, keine Veränderung der GB-Bandfrequenz, was bestätigt, dass die Graphenbeschichtung extrem haltbar ist.

Darüber hinaus reduzierte sich die Graphenbeschichtung in Graphennitinol auf die X-Rate des darunter liegenden Kupfers, was auf die Undurchlässigkeit von Graphenmembranen hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Graphen und biomedizinische Implantate übertragen werden können, um ihre Biokompatibilität zu verbessern.