Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anwendung der korrelativen Fluoreszenzlicht- und Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode zu demonstrieren, indem dynamische kleine HIV-Eins-Partikel abgebildet werden, die mit den Helazellen des Wirts interagieren. Dies wird erreicht, indem Heela-Zellen zunächst auf dem EM-Gitter des Goldfinders in einer Kulturschale mit Glasboden plattiert und gezüchtet und Heela-Zellen mit GFP-markierten HIV-1-Partikeln infiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, konfokale 3D-Lebendzellbilder von HIV-infizierten Zellen im Zeitraffer zu sammeln und die Bilder durch automatisierte 3D-Partikelverfolgung auf Einzelpartikeldynamik nach der Vitrifizierung zu analysieren.

Die Probe, die gleichen Viruspartikel aus den Bildgebungsdaten der lebenden Zellen, werden in Kryo-Fluoreszenzbildern für weitere hochauflösende 3D-Kryo-Elektronentomographie-Analysen lokalisiert. Der letzte Schritt besteht darin, gekippte Kryo-EM-Projektionsserien für alle identifizierten Positionen zu sammeln, die HIV-1-Partikel enthalten, und 3D-Toms mit einem gewichteten Rückprojektionsalgorithmus unter Verwendung der imad-Software zu rekonstruieren. Letztendlich werden fortschrittliche 3D-korrelative Fluoreszenzmikroskopie für lebende Zellen und hochauflösende Kryo-Elektronentomographie verwendet, um dynamische beugungsbegrenzte Viruspartikel und ihre Wechselwirkungen mit Wirtszellen direkt sichtbar zu machen.

Unsere Arbeit zielt darauf ab, eine Korrelationsmethode zu entwickeln, die es ermöglicht, nur Ereignisse einer HIV-Infektion direkt sichtbar zu machen. Durch die Kombination von Lebendzellfluoreszenz wie Mikroskopie, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie auf diese Weise können lebende Zell- und Kryo-Fluoreszenzsignale verwendet werden, um die Probenahme in der Kryo-Elektronentomographie stark zu steuern. Darüber hinaus können die aus der Kryo-Elektronentomographie gewonnenen Strukturinformationen durch die dynamischen funktionellen Daten ergänzt werden, die durch die Lifestyle-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Zielen verfügbar sind. Der Hauptvorteil dieser Technik oder der bestehenden Methode besteht darin, dass fortschrittliche korrelative Hochgeschwindigkeits-3D-Lifestyle-Bildgebung mit hochauflösendem 3D-Korallen-Elektronentomographie-Ansatz angewendet wird, um dynamische Ereignisse zu untersuchen, die von Natur aus schwer zu erfassen sind, wie z. B. HIV Typ 1 und Wirtszellinteraktionen im frühen Stadium der Infektion.

Um das Gitter für das Glühen der Zellkultur vorzubereiten, entladen Sie die Kohlenstoffseite eines 200 Mesh R zwei über zwei Quanti Folie, Gold EM Suchergitter unter 25 Milliampere für 25 Sekunden. Beschichten Sie das EM-Gitter mit Faser-Nin, indem Sie es mit der Kohlenstoffseite nach unten auf ein 40-Mikroliter-Tröpfchen mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Faser-Nin-Lösung schwimmen lassen. Lassen Sie es in einer Gewebekulturhaube unter UV-Licht für zwei Stunden zur Desinfektion auf dem Gitter mit einer Dichte von zweimal 10 bis den vierten Zellen pro Milliliter in einer Kulturschale mit Glasboden.

In DMEM mit geeigneten Nahrungsergänzungsmitteln inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für etwa 18 Stunden vor der HIV-Infektion, fügen Sie den Hela-Zellen in der Kulturschale mit Glasboden einen fluoreszierenden Zelltracker hinzu und inkubieren Sie die Schale 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffs zu ermöglichen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 50 Mikroliter vorgewärmtes Frischmedium hinzu. Platzieren Sie die Schale in der Lebendzellkammer bei 37 Grad Celsius über einem konfokalen Swept-Field-Scannermikroskop. Da Kryo-EM relativ dünne Bereiche der Probe erfordert.

Wählen Sie mehrere Felder aus, die ein bis drei Zellen pro Quadrat enthalten, wobei die Zellen zwischen zwei Mitosephasen liegen, wenn sie am weitesten verteilt sind, und speichern Sie diese Positionen mit der NIS-Elementsoftware für die zukünftige Bildgebung. Infizieren Sie als Nächstes die Zellen mit VSVG, pseudotypisierten HIV-1-Partikeln, die G-F-P-V-P-R und die Viruspartikel enthalten, in die untere Vertiefung der Schale, wobei Sie darauf achten, das EM-Gitter nicht zu stören. Da die Positionen für die Bildgebung bereits ausgewählt und unmittelbar nach der Zugabe der Variane gespeichert wurden, werden an den zuvor ausgewählten Positionen 20 bis 40 Minuten lang konfokale 3D-Bilder mit hoher Geschwindigkeit im Zeitraffer aufgenommen.

Stellen Sie die Kulturschale unmittelbar nach der konfokalen Lebendzellbildgebung auf einen eisgekühlten Kupferblock und bringen Sie sie in den Kryo-EM-Probenvorbereitungsraum. Laden Sie das EM-Gitter auf die spezielle Pinzette, tupfen Sie das restliche Kulturmedium schnell mit Filterpapier ab und legen Sie sofort auf das Gitter für Mikroliter einer 15-Nanometer-Goldperlenlösung, die mit 0,2 Mikron fluoreszierenden Mikrosphären gemischt ist. Die fluoreszierenden Mikrosphären werden verwendet, um die Korrelation zwischen Fluoreszenz und Kryo-EM zu unterstützen.

Laden Sie die Pinzette auf das Vitrifikationsgerät, um sie einzufrieren, wobei die Blotting-Parameter optimiert sind, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um das Verfahren für die Kryo-Fluoreszenzlichtmikroskopie zu beginnen, schließen Sie eine trockene Stickstoffgasleitung an eine Hülse an, die über der Objektivlinse platziert wird, um die Linse warm und frostfrei zu halten, montieren Sie einen selbstgebauten Kryo-Fluoreszenz-Probentisch auf ein inverses Fluoreszenzlichtmikroskop. Verbinden Sie den Flüssigstickstoffeinlass des Kryo-Probentisches mit dem Selbstdruckdoer und platzieren Sie den Auslass des Flüssigstickstoff-Überlaufschutzes in einem geeigneten Behälter.

Legen Sie das gefrorene hydratisierte Probengitter in die EM-Probenkartusche auf dem Kupferblock und platzieren Sie einen vor dem Abkühlen befestigten C-Clip-Ring darauf, um das Gitter an Ort und Stelle zu halten. Platzieren Sie die Kartusche in der Innenkammer des Kryotisches, suchen Sie und finden Sie die gleichen Viruspartikel aus den Bildgebungsdaten der lebenden Zellen. Da das EM-Gitter über einen Index verfügt, ist es einfach, dasselbe Partikel auf dem Gitter sowohl in lebenden Zellbildern als auch in Kryo-Fluoreszenzbildern zu lokalisieren.

Erfassen Sie Kryo-DIC- und Fluoreszenzbilder an den identifizierten Positionen unter Kryobedingungen mit einem Lichtmikroskop mit einer lang arbeitenden Objektivlinse. Überprüfen Sie während der Kryo-Fluoreszenzbildgebung regelmäßig den Flüssigstickstoffgehalt im Kryotisch und füllen Sie ihn bei Bedarf mit einem Selbstdruckdoer auf, um den Probentisch für die Kryo-Elektronentomographie unter minus 170 Grad Celsius zu halten. Laden Sie das Probengitter in die Kryo-Transferstation eines Elektronenmikroskops, das mit einer Feldemissionskanone ausgestattet ist, im Niedrigdosis-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 140-fach.

Identifizieren Sie die Bereiche oder Gitterquadrate, in denen Kryo-Fluoreszenzbilder aufgenommen wurden. Nehmen Sie ein Kryo-EM-Bild des korrelierten Bereichs mit geringer Vergrößerung auf und speichern Sie die Position in einer Tischdatei unter einem Suchmodus mit niedriger Dosis bei einer Vergrößerung von 3.500 x. Fügen Sie eine 100-Mikron-Objektiv-Apertursuche ein und speichern Sie alle Positionen, die mit GFP-Signalen korreliert sind, in einer Datei der zweiten Stufe.

Richten Sie die Tomografieparameter für die Erfassung einer Neigungsreihe ein, einschließlich des Neigungswinkelbereichs, der Elektronendosis, des Unschärfewerts und der Kippschemata. Erfassen Sie die Neigungsreihe für alle gespeicherten Positionen, um diesen Vorgang zu starten. Konfigurieren Sie das Hauptfenster so, dass mehrere Stufen der Tomo Graham-Berechnung gleichzeitig angepasst oder verfolgt werden können, ändern Sie die erforderlichen Parameter und führen Sie die spezifischen Programme aus, die für jeden Verarbeitungsschritt erforderlich sind.

Erstellen Sie in der letzten Phase einen vollständig ausgerichteten Stack mit einem Hauptrestfehler von weniger als 0,6 und rekonstruieren Sie Toms mit einem gewichteten Rückprojektionsalgorithmus. Im mod zur Charakterisierung des dynamischen Verhaltens von Viruspartikeln. Hela-Zellen, die mit HIV infiziert waren, wurden durch konfokale Hochgeschwindigkeitsmikroskopie abgebildet und die Partikelbewegungen wurden durch automatisiertes 3D-Partikeltracking analysiert.

In dieser repräsentativen Abbildung wurde ein einzelnes grün fluoreszierendes Viruspartikel, das durch die gelbe Pfeilspitze gekennzeichnet ist, in konfokalen 3D-Stapeln mit einem Zeitintervall von drei Minuten zwischen den Bildern verfolgt, um den Zeitraffer von mehreren Minuten zu vermeiden. Dies kann zwischen der Aufnahme des letzten konfokalen Lebendzellbildes und dem Einfrieren im Eintauchen auftreten. Ein Kryo-Fluoreszenzlichtmikroskopietisch wurde für die Abbildung von gefrorenen hydratisierten Proben in Kryo-EM-Kartuschen entwickelt und gebaut.

Auf dem Lichtmikroskop zeigt Panel A einen selbstbeaufschlagten, mit flüssigem Stickstoff gefüllten Doer, der zur Abkühlung des Kupfer-Kryo-Probentisches verwendet wird. Feld B zeigt die Draufsicht auf den Kryo-Probentisch, wobei die innere Kammer durch die weiße Pfeilspitze gekennzeichnet ist. Das Probengitter wird auf die E EM-Probenkartusche aufgesetzt, die sich in der Mitte einer Kupferblockplattform befindet, die durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet ist.

Diese Plattform wurde für den Einsatz mit unpolaren Elektronenmikroskopen hinzugefügt. Nach dem Beladen mit dem Probengitter wurden die Kartuschen in die innere Kammer für das Fluoreszenzlicht übertragen. Die Mikroskopie-Panels C und D zeigen die Probenkartusche vor bzw. nach dem Platzieren eines Kupferrings, um das Gitter für die Verwendung mit einem unpolaren Kryo-Elektronenmikroskop an Ort und Stelle zu halten.

Die Nützlichkeit des Verfahrens für die fortgeschrittene korrelative Lebenszellmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie wird durch die direkte Visualisierung von fluoreszenzmarkierten HIV V 1-Partikeln demonstriert, die mit einer Wirts-Fersenzelle interagieren. Ein DIC-Bild, das mit einem Kryolichtmikroskopietisch aufgenommen wurde, das in Panel A gezeigt wird, wird mit einem Kryo-Fluoreszenzbild von GFP-markierten Partikeln überlagert, das in Panel B gezeigt wird. Die roten Panels C, D und E sind niedrig dosierte Kryo-EM-Bilder der Region, die ein fluoreszierendes Partikel enthält, das in den Panels B und C bei 140 x 3, 500 x bzw. 27, 500 x eingekreist ist.

Der Einschub in Feld E ist eine vergrößerte Ansicht, die nach der Aufnahme der tomographischen Neigungsserien aufgenommen wurde, FG und H zeigen drei vier Nanometer dicke tomographische Scheiben, die durch einen Abstand von 21 Nanometern in Z-Richtung getrennt sind. Die Verbindungen zwischen dem Partikel und der Helozellmembran werden sowohl im Projektionsbild im Einschub als auch in Panel E und in tomographischen Schichten durch Pfeile angezeigt. In den Paneelen F und g.

Wir haben einen einfachen Satz von Protokollen vorgestellt, um einen fortschrittlichen korrelativen Ansatz zur Analyse dynamischer Virus- und steriler Wechselwirkungen unter Verwendung der konfokalen Lipozell-Fluoreszenzbildgebung im Zeitraffer und der anschließenden Kryo-Elektronentomographie zu bieten. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine präzise und zuverlässige Korrelation zwischen dem Fluoreszenzbild und dem elektronenmikroskopischen Bild für eine erfolgreiche Erfassung der Krähenelektronentomographie entscheidend ist. Die Daten, die dieses Verfahren beschreibt, werden für zahlreiche Anwendungen mit dynamischen zellulären Prozessen in der Zellbiologie nützlich sein, wie z.B. die Internalisierung von Zellsignaloberflächenrezeptoren.