Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung der korrelativen fluoreszenzmikroskopischen und kryoelektronenmikroskopischen Methode anhand der Abbildung dynamischer kleiner HIV-1-Partikel zu demonstrieren, die mit Wirt-HeLa-Zellen interagieren. Dies wird erreicht, indem zunächst HeLa-Zellen auf einem Goldfinder-EM-Gitter in einer Kulturschale mit Glasboden ausgesät und kultiviert werden und anschließend die HeLa-Zellen mit GFP-markierten HIV-1-Partikeln infiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, zeitraffende, schnelle 3D-Bilder lebender Zellen mittels konfokaler Mikroskopie von HIV-1-infizierten Zellen aufzunehmen und die Bilder nach der Vitrifizierung mithilfe automatisierten 3D-Partikel-Trackings auf einzelne Partikeldynamiken zu analysieren.

Die Probe, dieselben viralen Partikel aus den Live-Cell-Imaging-Daten, werden in kryofluoreszenten Bildern für eine anschließende hochauflösende 3D-Kryoelektronentomographie-Analyse lokalisiert. Der letzte Schritt besteht darin, gekippte Kryo-EM-Projektionsreihen für alle identifizierten Positionen, die HIV-1-Partikel enthalten, aufzuzeichnen und die 3D-Toms mithilfe eines gewichteten Rückprojektionsalgorithmus mit der IMOD-Software zu rekonstruieren. Letztendlich werden fortschrittliche 3D-korrelative Live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie und hochauflösende Kryoelektronentomographie eingesetzt, um dynamische, beugungsbegrenzte virale Partikel sowie deren Wechselwirkungen mit Wirtszellen direkt sichtbar zu machen.

Unsere Arbeit zielt darauf ab, eine Korrelationsmethode zu entwickeln, die eine direkte Visualisierung ausschließlich von Ereignissen einer HIV-1-Infektion ermöglicht. Durch die Kombination von fluoreszenzbasierter Mikroskopie an lebenden Zellen, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie lässt sich die Probenahme in der Kryo-Elektronentomographie gezielt durch Signale aus der lebenden Zelle und der Kryo-Fluoreszenz steuern. Darüber hinaus können die strukturellen Informationen aus der Kryo-Elektronentomographie mit dynamischen Funktionsdaten ergänzt werden, die durch die Live-Imaging-Beobachtung fluoreszenzmarkierter Zielstrukturen gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass eine fortschrittliche korrelative, schnelle 3D-Live-Imaging-Methode mit einem hochauflösenden 3D-Kryo-Elektronentomographie-Ansatz kombiniert wird, um dynamische Vorgänge zu untersuchen, die von Natur aus schwer zu erfassen sind, wie beispielsweise die Wechselwirkungen zwischen HIV-1 und Wirtszelle in einem frühen Stadium der Infektion.

Um das Objekträuchlein für die Zellkultur vorzubereiten, die Kohlenstoffseite eines 200-Maschen-R-2-über-2-Quanti-Foil-Gold-EM-Finder-Gitters 25 Sekunden lang bei 25 Milliampere mit einer Glühentladung behandeln. Das EM-Gitter mit Fibronektin beschichten, indem es mit der Kohlenstoffseite nach unten auf einen 40-Mikroliter-Tropfen einer 50-Mikrogramm-pro-Milliliter-Fibronektin-Lösung aufgelegt wird. Zur Desinfektion zwei Stunden lang in einer Zellkulturschutzschicht unter UV-Licht belassen. HeLa-Zellen in einer Dichte von zwei mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter in eine Kulturschale mit Glasboden säen.

In DMEM mit geeigneten Supplementen die Zellen vor der HIV-Infektion etwa 18 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Vor der HIV-Infektion einen fluoreszierenden Zelltracer zu den Hela-Zellen in der Glasbodenkulturschale hinzufügen und die Schale 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Aufnahme des fluoreszierenden Farbstoffs zu ermöglichen. Die Zellen mit PBS waschen und 50 µL vorgewärmtes frisches Medium hinzufügen. Die Schale in die Live-Zellkammer eines Swept-Field-Konfokalmikroskops bei 37 Grad Celsius stellen. Da die Kryo-EM relativ dünne Proberegionen erfordert.

Wählen Sie mehrere Felder aus, die ein bis drei Zellen pro Quadrat enthalten, wobei sich die Zellen zwischen zwei Mitosephasen befinden, wenn sie am stärksten ausgebreitet und flach liegen. Speichern Sie diese Positionen mit der NIS-Element-Software für die spätere Bildgebung. Danach infizieren Sie die Zellen mit VSVG-pseudotypisierten HIV-1-Partikeln, die G-F-P-V-P-R enthalten, und geben Sie die Viruspartikel in die untere Vertiefung der Schale, wobei Sie darauf achten, das EM-Gitter nicht zu stören. Da die Positionen für die Bildgebung bereits ausgewählt und gespeichert wurden, sammeln Sie unmittelbar nach der Zugabe der Viren zeitaufgelöste, schnelle 3D-Konfokalbilder an den zuvor ausgewählten Positionen über einen Zeitraum von 20 bis 40 Minuten.

Unmittelbar nach der konfokalen Live-Cell-Bildgebung die Kulturschale auf einen mit Eis gekühlten Kupferblock stellen und in den Raum zur Probenvorbereitung für die Kryo-EM überführen. Das EM-Gitter auf spezielle Pinzette auflegen, das restliche Kulturmedium rasch mit Filterpapier abtupfen und sofort Mikroliter einer Lösung mit 15 Nanometer großen Goldkügelchen, gemischt mit 0,2 Mikrometer großen fluoreszierenden Mikrokügelchen, auf das Gitter auftragen. Die fluoreszierenden Mikrokügelchen dienen der Korrelation zwischen Fluoreszenz- und Kryo-EM.

Laden Sie die Pinzette auf das Vitrifikationsgerät für das Eintauchgefrieren, wobei die Beprobungsparameter optimiert sind, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um mit der Prozedur für die Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie zu beginnen, schließen Sie eine trockene Stickstoffgasleitung an eine Hülse an, die über dem Objektiv angebracht ist, um das Objektiv warm zu halten und Frostbildung zu vermeiden; montieren Sie eine selbstgebaute Kryo-Fluoreszenz-Probenhalterung auf ein invertiertes Fluoreszenz-Lichtmikroskop. Schließen Sie den Flüssigstickstoff-Zulauf der Kryo-Probenhalterung an den selbstpressurisierten Behälter an und führen Sie den Überdruck-Überlauf des Flüssigstickstoffs in einen geeigneten Auffangbehälter.

Platzieren Sie das gefrorene, hydratisierte Probenraster in der EM-Probenkassette auf dem Kupferblock und setzen Sie einen vorgekühlten C-Clip-Ring darauf, um das Raster zu fixieren. Stellen Sie die Kassette in die innere Kammer des Kryo-Stages und suchen Sie dieselben Viruspartikel wie in den Live-Cell-Bilddaten. Da das EM-Raster über eine Indizierung verfügt, ist es einfach, dieselben Partikel auf dem Raster sowohl in den Live-Cell-Bildern als auch in den Kryo-Fluoreszenzbildern zu lokalisieren.

Erwerben Sie Kryo-DIC- und Fluoreszenzbilder an den identifizierten Positionen unter Kryo-Bedingungen mithilfe eines Lichtmikroskops mit einem Objektiv mit langem Arbeitsabstand. Während der Kryo-Fluoreszenzbildgebung überprüfen Sie periodisch den Flüssigstickstoffspiegel in der Kryo-Probennabe und füllen Sie ihn bei Bedarf mit einer selbstpressurisierten Dose nach, um die Probenstufe für die Kryo-Elektronentomographie unter minus 170 Grad Celsius zu halten. Laden Sie das Probengitter in die Kryo-Transferstation eines Elektronenmikroskops mit Feldemissionskanone im Niedrigdosis-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 140 x ein.

Identifizieren Sie die Bereiche oder Gitterfelder, in denen Kryo-Fluoreszenzbilder aufgenommen wurden. Erstellen Sie ein Kryo-EM-Bild mit niedriger Vergrößerung des korrelierten Bereichs und speichern Sie die Position in einer Stufen-Datei unter einem Niedrigdosis-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 3.500 x. Fügen Sie eine 100-Mikron-Objektivblende für die Suche ein und speichern Sie alle mit GFP-Signalen korrelierten Positionen in einer zweiten Stufen-Datei.

Richten Sie die Tomographie-Parameter für die Aufnahme einer Kippserie ein, einschließlich des Kippwinkelbereichs, der Elektronendosis, des Defokussierwerts und der Kipp-Schemata. Nehmen Sie Kippserien für alle gespeicherten Positionen auf, um dieses Verfahren zu beginnen. Konfigurieren Sie das Hauptfenster so, dass mehrere Schritte der Tomo-Graham-Berechnung gleichzeitig angepasst oder verfolgt werden können, passen Sie die erforderlichen Parameter an und führen Sie die spezifischen Programme aus, die für jeden Verarbeitungsschritt erforderlich sind.

In der letzten Phase wird ein vollständig ausgerichteter Stapel mit einem Hauptrestfehler von weniger als 0,6 erstellt und die Tomogramme mittels eines gewichteten Rückprojektionsalgorithmus rekonstruiert. In der Bildgebung zur Charakterisierung des dynamischen Verhaltens von Viruspartikeln wurden mit HIV-1 infizierte Hela-Zellen mittels schneller konfokaler Live-Cell-Mikroskopie abgebildet, und die Bewegungen der Partikel wurden durch automatisiertes 3D-Partikel-Tracking analysiert.

In dieser repräsentativen Abbildung wurde ein einzelnes grün fluoreszierendes Viruspartikel, das durch den gelben Pfeil markiert ist, in 3D-Konfokal-Stapeln mit einem Zeitintervall von drei Minuten zwischen den Einzelbildern verfolgt, um den Zeitraum von mehreren Minuten zu vermeiden, der zwischen der Aufnahme des letzten konfokalen Live-Cell-Bildes und dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff liegen kann. Eine Kryo-Fluoreszenzmikroskopie-Stufe wurde entwickelt und aufgebaut, um gefrorene, wasserhaltige Proben innerhalb von Kryo-EM-Kassetten abzubilden.

Bei Lichtmikroskopen zeigt Panel A eine selbstpressurisierte Dose, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist und zum Abkühlen der Kupfer-Cryos-Probenhalterung verwendet wird. Panel B zeigt die obere Innenansicht der Cryos-Probenhalterung mit der inneren Kammer, die durch den weißen Pfeil markiert ist. Das Probengitter wird auf die EM-Probenkassette aufgesetzt, die in der Mitte einer aus Kupfer bestehenden Plattform angeordnet ist, die durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet ist.

Diese Plattform wurde für die Verwendung mit nicht-polarisierten Elektronenmikroskopen hinzugefügt. Nachdem das Probengitter geladen wurde, werden die Kartuschen in die innere Kammer für die Kryofluoreszenzmikroskopie überführt. Die Mikroskopie-Abbildungen C und D zeigen jeweils die Probekartusche vor und nach dem Einsetzen eines Kupferringes, um das Gitter für die Verwendung mit einem nicht-polarisierten Kryo-Elektronenmikroskop zu fixieren.

Die Anwendung des Verfahrens für die fortgeschrittene korrelative Lebenszellmikroskopie und die Kryo-Elektronentomographie wird anhand der direkten Visualisierung fluoreszenzmarkierter HIV V1-Partikel veranschaulicht, die mit einer Wirtszelle vom Typ HeLa interagieren. Ein DIC-Bild, das mit einem Kryo-Lichtmikroskopie-Objektträger aufgenommen wurde und in Abbildung A dargestellt ist, wurde mit einem Kryo-Fluoreszenzbild der GFP-markierten Partikel, die in Abbildung B gezeigt werden, überlagert. Die markierten Partikel sind eingefärbt. Die roten Abbildungen C, D und E zeigen niederdosiert aufgenommene Kryo-EM-Bilder des Bereichs, der ein fluoreszierendes Partikel enthält, das in den Abbildungen B und C markiert ist, bei 140 × 3, 500 × bzw. 27.500 ×.

Der Ausschnitt in Panel E zeigt eine vergrößerte Ansicht, die nach der Aufnahme der tomographischen Kippreihen aufgezeichnet wurde; die Panels F, G und H zeigen drei tomographische Schnitte mit einer Dicke von jeweils vier Nanometern, die in Z-Richtung um jeweils 21 Nanometer voneinander entfernt liegen. Verbindungen zwischen dem Partikel und der Halo-Zellmembran sind durch Pfeile sowohl im Projektionsbild im Ausschnitt und Panel E als auch in den tomographischen Schnitten in den Panels F und G gekennzeichnet.

Wir haben einen einfachen Satz von Protokollen vorgestellt, um einen erweiterten korrelativen Ansatz zur Analyse dynamischer Virus- und steriler Interaktionen mithilfe von zeitraffenden konfokalen Lipozell-Fluoreszenzbildgebungen in Kombination mit Kryo-Elektronentomographie bereitzustellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass eine präzise und zuverlässige Korrelation zwischen Fluoreszenzbild und Elektronenmikroskopiebild entscheidend für die erfolgreiche Gewinnung von Kryo-Elektronentomographiedaten ist. Die hier beschriebenen Daten werden für zahlreiche Anwendungen nützlich sein, die dynamische zelluläre Prozesse in der Zellbiologie betreffen, wie beispielsweise die Zellsignaltransduktion oder die Internalisierung von Oberflächenrezeptoren.