Name: Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Erfahren Sie die multimodale optische Bildgebung zur Analyse der zielgerichteten Lieferung von HerDox-Nanopartikeln in HER2-positive Tumore. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung der Tumorpenetration in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu LKM-K von den National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 und R01CA140995) finanziert. Dr. Medina-Kauwe dankt C. Rey, M. M-Kauwe und D. Revetto für anhaltende Unterstützung.

1. Systemische Lieferung In vivo <ol><li> Mischen genug mit steriler Kochsalzlösung HerDox bis 0,2 ml einer 0,004 mg / kg Dosis HerDox pro Injektion eine 6-8 Wochen alten nu / nu-Maus, die subkutan bilateral Flanke Xenograft gleichzusetzen. </li><li> Vorsichtig ziehen die HerDox Mischung in eine 3/10 cc Insulinspritze mit einer 29G Nadel ausgestattet Blasenbildung vermeiden. </li><li> 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) Anästhesie wird durch kurze Exposition Isofluran in einer Induktion Kammer mit einem Gas Spülsystem (Oxygen Flussraten ausgestattet induziert. </li><li> Injizieren Sie die gesamte Mischung in die Schwanzvene einer narkotisierten Maus (0,2 ml pro Injektion). IV Injektion kann auch in einer zurückhaltenden, narkotisierten Maus durchgeführt werden. </li><li> Wiederholen Injektionen am selben Maus für sechs aufeinander folgenden Tagen, einmal pro Tag. </li></ol> 2. Fluorescence Imaging in vivo Die Anhäufung von HerDox Fluoreszenz in Tumorenwerden bis zum letzten Tag der Injektion (Tag 7) mit einem Multimode-Imager nachweisbar. Die folgenden Verfahren beinhalten die Verwendung eines kundenspezifischen Makro-Beleuchtung und Detektion (Abbildung 1) 8. <ol><li> Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager. </li><li> Wählen Sie eine Emission Bandpassfilter (590 nm ± 30 nm) für Doxorubicin Fluoreszenz-Detektion geeignet. </li><li> Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang. </li><li> Schalten Sie den Anästhesie-System und legen Sie dann eine Maus in die betäubende Kammer (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) mit einem Gas-Spülung ausgestattet. </li><li> Übertragen Sie die Maus aus der betäubende Kammer zur Bildgebung Kammer des Multimode Optical In-vivo-Imager, wenn die Maus narkotisiert ist. </li><li> Legen Sie eine nosecone über die Nase der Maus und öffnen Sie den Durchfluss auf kontinuierliche Narkosemitteln verwaltensia während der Bildaufnahme (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 2-3% (oder weniger). </li><li> Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec. </li><li> Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast. </li></ol> 3. Ex vivo Fluoreszenz-Imaging HerDox Fluoreszenz in Tumoren und bestimmte Organe abgebildet werden (einschließlich der Leber, Niere, Milz, Herz-und Skelettmuskel) von eingeschläfert Mäuse nach 24 Stunden geerntet nach der letzten (Tag 7) Injektion von HerDox. <ol><li> Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager. </li><li> Wählen einer Emission Bandpassfilter (580 nm ± 20 nm) für Doxorubicin Fluoreszenzdetektion. </li><li> Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang. </li><li> Platz Tumoren und bestimmten Organen auf einer Petri-Schale in die Kammer o imaging angeordnetf die Multimode Optical In vivo Imager. </li><li> Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen von Geweben mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec. Ein Beispiel für anfängliche Fluoreszenz Bildaufnahme ist in Abbildung 2a dargestellt. Wiederholen Sie das gleiche mit einem leeren Petrischale, die als Hintergrund (Abbildung 2b) dienen wird. </li><li> Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast. Ein Beispiel für eine korrigierte Bild wird in 2c dargestellt, aus der Subtraktion von 2b aus Figur 2a. </li></ol> 4. In situ konfokale Bildgebung von Tumoren In situ konfokale Abbildung ermöglicht die Erfassung und Analyse von HerDox Tumorakkumulation auf zellulärer Ebene. <ol><li> Schalten Sie eine Leica SPE konfokalen Mikroskop. </li><li> Wählen Sie 488 nm Laserlicht zur Anregung von Doxorubicin und Emissions-Wellenlängen (560-620 nm) für DoxorubicinFluoreszenzdetektion. </li><li> Wählen Sie einen 40X oder 63X objektiv und Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv. </li><li> Auszug frisch Tumoren von Mäusen, die eingeschläfert zuvor empfangenen HerDox und Mock Behandlungen wie in Verfahren 2 beschrieben. </li><li> Platz Tumoren auf einer Petrischale auf Eis zu vermeiden Gewebeabbau und übertragen dann die Tumoren zu einem Delta T Kammer für die konfokale Bildgebung. </li><li> Erwerben konfokale Bilder der Tumoren bei sequentiellen Fokustiefen (Schrittweite: 1 um, Dicke: 20 um). Ein Beispiel nacheinander aufgenommenen Bildern entlang der z-Achse ist in Fig. 3 linken Seite gezeigt. </li><li> Führen maximale Intensität z-Projektion der Bilder. Ein Maximum Intensity Projection der z-gestapelten Bilder ist in Fig. 3, rechte Tafel gezeigt. </li><li> Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensitäten der maximalen Intensität Z -. Projektion Bilder Mittlere Fluoreszenzintensitäten der Bilder über das gesamte Sichtfeld wurden berechnetd mit ImageJ. </li></ol> 5. Ratiometric Spectral Imaging and Analysis Ratiometric spektralen Bildgebung und Analyse ermöglicht Diskriminierung zwischen Dox Fluoreszenz und Autofluoreszenz. <ol><li> Leistung auf einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-konfokalen Mikroskop. </li><li> Erwerben 15 Bilder der HerDox-behandelten und unbehandelten Tumoren in einer bestimmten Tiefe im Spektralbereich von 510-650 nm, mit einer Schrittweite von 10 nm und Anregung bei 488 nm Licht unter Verwendung eines Leica SPE konfokalen Mikroskop. </li><li> Bereiten Sie eine 100 uM Lösung von Doxorubicin. </li><li> Führen spektralen Bildgebung des 100 pM Doxorubicin-Lösung, um das reine spektrale Signatur von Dox Fluoreszenz (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt Größe: 10 nm) zu erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Erwerben Sie die Autofluoreszenz spektrale Signatur von einem Bild cube (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt: 10 nm) von Spectral Imaging von unbehandelten Tumoren erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 5 dargestellt. </li><li> Generieren vier Referenz spektralen Signaturen (reine Autofluoreszenz 0.1.doxorubin +0.9. Autofluoreszenz, 0.2. Doxorubicin +0.8. Autofluoreszenz 0.3.doxorubin +0.7. Autofluoreszenz) mit dem Programm, das wir entwickelt 9. Eine typische Kurve vier Referenz spektralen Signaturen ist in Abbildung 6 dargestellt. </li><li> Führen spektrale Klassifizierung der Bilder durch den Verweis spektralen Signaturen durch Euklidische Distanzmaß mit dem Programm, das wir zuvor entwickelten 9 definiert. </li><li> Die lineare Entmischung dieser Bilder durch die Verwendung eines Entmischung Programm (Plug-in in ImageJ) entwickelten wir 7, 10, zum Vergleich mit der ratiometrischen Spectral Imaging und Analyse. Ein example der Trennung HerDox Fluoreszenz von Autofluoreszenz durch lineare Entmischung ist in Abbildung 7 dargestellt. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

Der Autor, Daniel Farkas, ist Vorsitzender des Spectral Molecular Imaging. Die übrigen Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Dox Fluoreszenz in vivo nachweisbar sein mit der Multimode-Imager, wenn Tumoren subkutane sind. Allerdings ist die therapeutisch wirksame Dosis von HerDox (0,004 mg / kg) unterhalb der Nachweisgrenze nach einer Einzeldosis. Im Gegensatz dazu, nach 7 tägliche Injektionen (1x/day für 7 Tage), ist der Tumor Akkumulation und Retention der Partikel ausreicht, um die Visualisierung von Dox Fluoreszenz ermöglichen. Es ist wichtig bei der Arbeit mit Dox oder einem anderen Fluorophor für <em...

Tumor-Targeting der Chemotherapie hat das Potenzial, Krebszellen zu niedrigeren Dosis im Vergleich zu beseitigen ungezielte Drogen, weil mehrere gelieferte Therapie am Bestimmungsort anstatt zu verteilen, um Nicht-Tumorgewebe ansammeln können. Da dieser Situation verdünnen sich die Wirksamkeit des Arzneimittels und somit höhere Dosen wirksam zu sein, hat Tumor-Targeting sowohl therapeutische als auch sicherheitstechnische Vorteile gegenüber herkömmlichen nicht-zielgerichtete Behandlung. Targeting Chemotherapie durch Verkapselung in selbstorganisierte Nanopartikel ermöglicht das Medikament zu bleiben chemisch im Gegensatz zu Medikamenten, die kovalent an Targeting-Moleküle gebunden sind unverändert. Als solche Verbindung hat das Potential, die Aktivität von sowohl dem Wirkstoff und dem Zielmolekül zu ändern; nichtkovalente Anordnung ermöglicht Arzneistoffwirksamkeit beibehalten werden. Wir haben bereits gezeigt, dass das neue Drei-Komponenten, self-assembled komplex, HerDox, HER2 + Tumoren zielt <em&gt; In vivo und entlockt Tumor-Wachstum Ablation unter Schonung gesunden Gewebes, einschließlich des Herzens 1. HerDox durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Rezeptor-Bindungs-Zelle Penetrationsprotein, HerPBK10 und des chemotherapeutischen Mittels gebildet, Doxorubicin (DOX), über eine kleine Nukleinsäure Linker. HerPBK10 bindet den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) und löst Rezeptor-vermittelte Endozytose 2-4, während endosomalen Membran Penetration durch Einbau des Adenovirus-abgeleiteten Pentonbasis Kapsidprotein 4-6 erreicht wird. Eine positiv geladene Domäne des Proteins ermöglicht Nukleinsäurebindung 4, 5, durch die DNA-interkalierten Dox zum gezielten Transport transportiert werden können. Elektrophile, Einlagerung und möglicherweise Protein-Interaktionen erleichtern Oligomerisierung Selbstorganisation zu rund 10-20 nm großen Partikeln, die stabil sind in Blut und unter längerer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen 1. Bevorzugte Targeting HER2 + Tumorzellen durch die erhöhte Ligandenaffinität erleichtert, wenn HER2 erhöht ist. Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass die systemische Verabreichung von HerDox Ausbeuten bevorzugte Anreicherung in Tumoren über Nicht-Tumorgewebe und im Vergleich zu Dox 1 und Eindringen in Tumorzellen ungezielte in vivo 7. Wir haben beobachtet, dass HerDox Veröffentlichungen Dox nach Tumorzelle Eintrag, so dass Dox Akkumulation in den Zellkern ein. Tumor-Akkumulation erscheint mit Rezeptor korrelieren, als relativ gering HER2-positive Tumoren anreichern weniger HerDox Vergleich zu denen mit vergleichsweise höheren HER2 Stufen 1. Darüber hinaus zeigt die effektive Konzentration Zelltod eine inverse Korrelation mit HER2 Anzeige auf Tumor-Zelllinien unterschiedlicher Zelloberfläche HER2-Stufen 1. HerDox zeigt eine therapeutische Sicherheit und Vorteil gegenüber ungezielte Dox, wie Tumorabtötung tritt bei über 10-mal niedriger Dosis im Vergleich zum entpackengeted Wirkstoff und zeigt keine nachweisbare negative Wirkung auf Herz (nachgewiesen durch Echokardiographie und histologische Färbung) oder Leber (nachgewiesen durch TUNEL-Färbung) Gewebe, im Gegensatz zu ungezielte Dox 1. Trotz seiner Herkunft aus einer Virushülle Protein weist HerPBK10 keine nachweisbare Immunogenität im therapeutischen Bereich 2. Während bereits vorhandenen Antikörper zu ganzen Adenovirus HerPBK10 erkennen können, sind sie nicht in der Lage Zellbindung 2 zu verhindern. Tumorvolumen über die Zeit gemessen wird, eine Standard-Methode zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Therapie erfolgen und ist für die Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von HerDox eingesetzt. Ergänzend diesen Ansatz mit in vivo und ex vivo Fluoreszenz Bildgebung hat uns erlaubt, besser zu beurteilen Targeting Effizienz 7. Wir haben insbesondere in situ konfokale Abbildung entfernten Tumoren mit Spektralanalyse Dox Fluoreszenz integriert, dass keine Verifizierung HerDoxt nur bei Tumoren in vivo angesammelt aber drang in Tumorzellen und geliefert Dox in das Zytoplasma und Zellkern 7. Spektralanalyse ermöglichte es uns, weiterhin Dox Fluoreszenz von Autofluoreszenz 7 unterscheiden. Hier zeigen wir näher unser Ansatz für die Beurteilung HerDox in vivo nach systemischer Lieferung, und vor allem für die Beurteilung durch Targeting Multimode bildgebende Verfahren und Analysen.

<table><tbody><tr><td>Konfokales Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Optical Imager</td><td>Spectral Molecular Imaging</td><td>Multimode In Vivo Optischer Imager</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Nackte (NU/NU) Maus, weiblich, 6-8 Wochen</td><td>Charles River</td><td>Stammcode 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 humane HER2+-Tumorzellen</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor-/Zelllinien-Repository</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulinspritze U-100 mit 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanent befestigter Nadel</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T-Kammer </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

gezielte analyse von viralen proteins nanopartikel her2 + tumoren lieferung

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Der HER2 + Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox weist Tumor-und Tumor-Akkumulation bevorzugte Wachstum Ablation in einem Tiermodell der HER2 + Krebs. HerDox durch nichtkovalente Selbstorganisation eines Tumors Zielzelle Penetrationsprotein mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin ausgebildet ist, über eine kleine Nukleinsäure Linker. Eine Kombination von elektrophilen, Einlagerung und Oligomerisierung Interaktionen erleichtern self-assembly in runde 10-20 nm großen Partikeln. HerDox aufweist Stabilität im Blut sowie einer längeren Lagerung bei verschiedenen Temperaturen. Systemische Abgabe HerDox in tumortragenden Mäusen zur Tumor-Zelltod ohne feststellbare nachteilige Auswirkungen auf Nicht-Tumor-Gewebe, einschließlich des Herzens und der Leber (der unterziehen gekennzeichnet Schäden durch ungezielte Doxorubicin). HER2 Höhe erleichtert Targeting von Zellen, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, damit Tumoren Anzeige erhöhten HER2 Ebenen größere Ansammlung von HerDox weisen im Vergleich zu Zellen, Expressionsingen unteren Ebenen, sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzintensität Bildgebung mit in situ konfokalen und Spektralanalyse kombiniert hat uns erlaubt, in vivo Tumor-Targeting und Tumorzelle Eindringen von HerDox nach systemischer Lieferung überprüfen. Hier haben wir ausführlich unsere Methoden zur Beurteilung der Tumor-Targeting über Multimode-Bildgebung nach systemischer Lieferung.

Abbildung 1 zeigt die in vivo optische Scanner-Prototyp, der für die Zwecke der Bildaufnahme unter mehreren Modalitäten, einschließlich Fluoreszenz-Intensität, spektrale, Lebensdauer, 2-Photonen-, intra-vital konfokalen und Biolumineszenz-Bildgebung gebaut wurde. Darüber hinaus liefert die gekühlte hochempfindliche Kamera und Hochleistungslaser Linien in diesem System eingebaut höheren Kontrast Fluoreszenzbilder Vergleich zu kommerziellen optischen Abbildungssystemen 11, insbesondere...

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren für die optische Bildgebung Analyse der Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox. Insbesondere wird eine detaillierte Verwendung der Multimode-Bildaufnahmevorrichtung zum Erfassen Tumor-Targeting und Bewertung Tumorpenetration beschrieben.

Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die systemische In-vivo-Abgabe des tumorzielgerichteten Nanopartikels HeroX mittels multimodaler optischer Bildgebung nachzuweisen und zu analysieren. Zunächst wird der Nanopartikel in die Schwanzvene einer tumorbehafteten Maus injiziert, und Fluoreszenzbilder werden mithilfe eines multimodalen optischen Bildgebungssystems aufgenommen. Nach der Tötung werden der Tumor und die Organe entnommen und erneut abgebildet, um fluoreszierende Partikel innerhalb der Tumorzellen nachzuweisen.Anschließend wird eine in-situ-Konfokalabbildung durchgeführt. Die Analyse der resultierenden Bilder zeigt eine quantifizierbare gezielte Ansammlung und Penetration der Herdocs in Tumore nach systemischer Applikation. Ein Vorteil multimodaler Bildgebungsverfahren gegenüber bestehenden Techniken wie der alleinigen Bildgebungsmethode liegt darin, dass sie mehrere und komplementäre Informationen bereitstellen, die die Analyse und Quantifizierung der Tumoransammlung verbessern können.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelfreisetzung zu beantworten, beispielsweise, ob ein gezielt verabreichtes Medikament nicht nur an Tumore abgegeben wird, sondern tatsächlich in Tumorzellen eindringt. Die Durchführung der Methode demonstrieren Dr. J. Yun Wang, ehemalige Postdoktorandin in meinem Labor, und Janet Markman, derzeitige Doktorandin in diesem Protokoll. Sechs bis acht Wochen alt.Es werden neue Mäuse mit subkutanen bilateralen Flankentumoren im Xenotransplantatmodell verwendet. Bereiten Sie die systemische Applikation vor, indem Sie ausreichend HeroX mit steriler Kochsalzlösung mischen, um pro Injektion 0,2 Milliliter einer Dosis von 0,004 Milligramm pro Kilogramm HeroX zu erhalten. Ziehen Sie vorsichtig 0,2 Milliliter der HeroX-Mischung in eine 3/10-ccm-Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel auf.Achten Sie darauf, dass nach der Anästhesie keine Blasen vorhanden sind. Injizieren Sie die gesamte Mischung in die Schwanzvene nach der Injektion. Drücken Sie den Schwanz zusammen, um Blutverlust an der Injektionsstelle zu verhindern.Nachdem die Blutung gestoppt ist, reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem sterilen Tupfer und bringen Sie das Tier in den Käfig zurück. Wiederholen Sie die Injektion an derselben Maus an sechs weiteren aufeinanderfolgenden Tagen. Einmal täglich kann die Akkumulation der HeroX-Fluoreszenz in Tumoren bis zum letzten Injektionstag nachgewiesen werden.Tag sieben, unter Verwendung eines Multimodaldetektors. Die hier beschriebenen Verfahren nutzen ein optisches Abbildungssystem mit Fluoreszenzintensitäts-, spektralen Fluoreszenz-, Lebensdauer- und intravitale konfokale Bildgebungsfunktionen. Gezeigt ist hier der Prototyp eines in-vivo-Optikabbildungssystems.Die in dieses System integrierte gekühlte Hochempfindlichkeitskamera und die Hochleistungslaserlinien liefern im Vergleich zu kommerziellen optischen Bildgebungssystemen fluoreszenzbildgebende Aufnahmen mit höherem Kontrast, insbesondere für die In-vivo-Detektion der Doxorubicin-Fluoreszenz. Schalten Sie den Multimodus-In-vivo-Optikbildgeber in der Software ein. Wählen Sie einen Emissions-Wellenlängenfilter, der für die Detektion der Doxorubicin-Fluoreszenz geeignet ist.Schalten Sie den Laser ein und platzieren Sie einen Exzitations-Wellenlängenfilter in den Laserstrahlengang. Nachdem eine Maus in der Betäubungskammer mit Isofluran anästhesiert wurde, überführen Sie sie in die Bildgebungskammer des multimodalen in-vivo-Optik-Imagers. Setzen Sie eine Nasenkappe über die Nase der Maus und öffnen Sie den Durchfluss, um eine kontinuierliche Anästhesie bereitzustellen.Während der Bildaufnahme fluoreszenzbildgebende Verfahren mit einer Belichtungszeit von fünf bis 15 Sekunden verwenden. Die Fluoreszenz von Her doc kann in Tumoren und spezifischen Organen, einschließlich Leber, Niere, Milz, Herz und Skelettmuskel, die 24 Stunden nach dem letzten Injektionstag von euthanasierten Mäusen entnommen wurden, abgebildet werden. Den Multimodus-In-vivo-Optik-Imager einschalten.Wie zuvor werden die Tumore und spezifischen Organe anschließend auf einer Petrischale angeordnet. Im Inneren der Bildgebungskammer des multimodalen in-vivo-Optik-Imagers werden Fluoreszenzbilder der Gewebe mit einer Belichtungszeit von fünf bis 15 Sekunden aufgenommen. Danach werden dieselben Aufnahmen mit einer leeren Petrischale wiederholt, die nach der Aufnahme als Hintergrund dienen wird.Führen Sie die Bildanalyse und -verarbeitung durch, einschließlich Hintergrundkorrektur oder Kontrastanpassung. Die in-situ-Konfokalmikroskopie ermöglicht die Detektion und Analyse der Tumoransammlung im Herd auf zellulärer Ebene. Unter Verwendung eines Konfokalmikroskops.Wählen Sie Laserlicht mit einer Wellenlänge von 488 Nanometern zur Anregung von Doxorubicin und Emissionswellenlängen von 560 bis 620 Nanometern. Zur Detektion der Doxorubicin-Fluoreszenz wählen Sie ein 40x- oder 63x-Objektiv und geben einen Tropfen Immersionsöl darauf. Legen Sie die Tumore der euthanasierten Maus zur Vermeidung von Gewebeabbau in eine Petrischale.Überführen Sie dann die Tumore in eine Delta-T-Kammer für die konfokale Bildgebung. Erwerben Sie konfokale Aufnahmen der Tumore bei sequenziellen Fokaltiefen mit einer Schrittgröße von einem Mikrometer und einer Dicke von 20 Mikrometern. Ein Beispiel für sequenziell entlang der Z-Achse aufgenommene Bilder ist hier dargestellt.Erstellen Sie Z-Projektionen mit maximaler Intensität der Bilder. Berechnen Sie anschließend mithilfe von ImageJ oder einem ähnlichen Programm die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Z-Projektionen mit maximaler Intensität für das gesamte Bildfeldverhältnis. Die metrische spektrale Bildgebung und Analyse ermöglicht die Unterscheidung zwischen Doxorubicin-, Fluoreszenz- und Autofluoreszenzsignalen.Erwerben Sie mithilfe eines laserbasierten Fluoreszenz-Konfokalmikroskops 15 Bilder der mit HeroX behandelten und unbehandelten Tumore in einer festgelegten Tiefe innerhalb des Spektralbereichs von 510 bis 650 Nanometern mit einer Schrittgröße von 10 Nanometern und Anregung bei 488 Nanometer Licht unter Verwendung eines Leica-SPE-Konfokalmikroskops. Bereiten Sie anschließend eine 100-Mikromolar-Lösung von Doxorubicin in physiologischer Kochsalzlösung vor. Führen Sie die spektrale Bildgebung der 100-Mikromolar-Doxorubicin-Lösung durch.Um die reine spektrale Signatur der Doxorubicin-Fluoreszenz zu erhalten, erfassen Sie die Autofluoreszenz-Spektralsignatur aus dem Bildwürfel durch Abbildung unbehandelter Tumore. Sobald alle Daten gesammelt wurden, erzeugen Sie Referenz-Spektralsignaturen, führen eine spektrale Klassifizierung der Bilder durch und führen eine lineare spektrale Entmischung dieser Bilder durch, um eine quantitative Bewertung der Akkumulation von Her Doks in Tumoren zu erhalten.Konfokale Fluoreszenzbilder wurden bei verschiedenen Fokaltiefen in situ aufgenommen, gefolgt von einer Maximum-Intensitäts-Z-Projektion der Bilder und der Erfassung der mittleren Fluoreszenzintensität des projizierten Bildes. Die starke Tumorsignalfluoreszenz in diesem Bild ist typisch nach systemischer Applikation von her docs und weist auf eine tumorspezifische Anreicherung hin. Die in der quergestreiften Muskulatur nachgewiesene Fluoreszenz ist atypisch und könnte auf Anomalien während des Injektionsvorgangs zurückzuführen sein.Qualitativ weist dieses Bild ein niedriges Hintergrundsignal auf. Für die quantitative Analyse wird eine Hintergrundkorrektur mithilfe einer leeren Schale durchgeführt, wie hier gezeigt. Das resultierende, hintergrundkorrigierte Bild weist am Bildrand ein höheres Hintergrundsignal im Vergleich zum Original auf, da das Hintergrundbild an den Rändern geringere Intensitäten aufweist.Die gestapelten Bilder auf der linken Seite sind repräsentativ für die konfokalen Aufnahmen von Tumorgewebe, die in aufeinanderfolgenden Tiefen von jeweils einem Mikrometer gewonnen wurden. Das Bild auf der rechten Seite zeigt die Zusammensetzung der gestapelten Bilder auf der linken Seite. Das Zusammengesetzte Bild enthält die HeroX-Anreicherungsinformation über die angegebenen Z-Tiefen für jedes Pixel, sodass der Durchschnitt der Fluoreszenzintensitäten die quantitative Gesamtansammlung von herd doc in Tumoren in unterschiedlichen Tiefen widerspiegelt.Um die Fluoreszenz von Doxorubicin von der Autofluoreszenz in Tumoren zu unterscheiden und die beiden mit hoher Spezifitätsratiometrik quantitativ zu differenzieren, wird eine spektrale Bildgebung und Analyse durchgeführt. Dieses Bild zeigt die reinen Spektralsignaturen für Doxorubicin.Die Fluoreszenzintensität des markierten gepunkteten Bereichs bei den angegebenen Emissionswellenlängen ergibt ein Histogramm, das das Profil von Doxorubicin über das Wellenlängenspektrum von 510 bis 650 Nanometer zeigt. Hier sind die reinen Spektralsignaturen der Autofluoreszenz dargestellt. Die von einem unbehandelten Tumor bei den angegebenen Emissionswellenlängen emittierte Fluoreszenz erzeugt eine Steigung, die das Emissionsprofil der Autofluoreszenz darstellt. Referenz.Spektrale Signaturen wurden außerdem durch Mischen verschiedener Verhältnisse der reinen Spektralsignaturen erzeugt. Mithilfe des Programms erstellten wir jeden Referenzwert. Die spektrale Signatur stellt hier die relative Fluoreszenz von in Tumoren angereicherten Her-Docks in Bezug auf die Autofluoreszenz dar.Nach der Erfassung der spektralen Signaturen von Docks und Autofluoreszenz werden die Docks-Signale durch lineare spektrale Entmischung getrennt. Die Abbildung zeigt das gemischte Bild aus Autofluoreszenz und ihren Docks vor der spektralen Entmischung sowie das getrennte Bild ihrer Docks nach der spektralen Entmischung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Fluoreszenzintensität, Comfort Car und spektrale Bildgebungstechniken kombiniert werden können, um die Analyse und Quantifizierung der Tumoraufnahme zu verbessern.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Doxorubicin gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Doppelhandschuhen und das häufige Wechseln der Handschuhe, während Sie dieses Verfahren durchführen.

analysis-targeted-viral-protein-nanoparticles-delivered-to-her2

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln.

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einem starken magnetischen Moments und einer starken Nah-Infrarot (NIR)-Absorption. Das Protokoll schließt auch Antikörper-Konjugation in den Nanopartikeln durch die Fc-Teil für verschiedene biomedizinische Anwendungen, die Molekular spezifisches Targeting erforderlich.

Synthese von Immunotargeted Magneto-Plasmonen Nanocluster

Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Diese Arbeit zielt darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung und Kultur von primären krebsassoziierten Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von dreifach negativem Brustkrebs und deren Anwendung für die präklinische Untersuchung neuartiger Nanopartikel bereitzustellen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.

Isolierung primärer krebsseziensässiger Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von Brustkrebs zur Untersuchung gezielter Nanopartikel

Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Erfahren Sie die multimodale optische Bildgebung zur Analyse der zielgerichteten Lieferung von HerDox-Nanopartikeln in HER2-positive Tumore. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung der Tumorpenetration in vivo.

Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung

Weitere Videos entdecken