Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem Ex vivo Menschliche Plazentaperfusion Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Transport von Nanopartikeln oder Xenobiotika durch die Plazenta unter Verwendung des ex vivo humanen Plazenta-Profusionsmodells zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fetale Arterie und eine fetale Vene der Plazenta unmittelbar nach der Entbindung kanüliert werden. Im zweiten Schritt wird die Plazenta in der Perfusionskammer fixiert.

Anschließend wird eine stumpfe Kanüle in den intervillösen Raum auf der mütterlichen Seite eingeführt und ein einzelner Schlauch wird installiert, um die venöse Drainage zurückzuführen. Anschließend wird das gesamte System mit Perfusionsmedien in einem offenen Kreislauf gespült, um das restliche Blut auszuspülen und dem Gewebe zu ermöglichen, sich nach der Entbindung von der ischämischen Phase zu erholen. Im letzten Schritt werden die beiden Kreisläufe geschlossen und die fluoreszenzmarkierten Nanopartikel oder das interessierende Xeno-Biotikum dem mütterlichen Kreislauf zugeführt.

Letztendlich können die während der sechsstündigen Perfusion gewonnenen Proben des fetalen und mütterlichen Kreislaufs durch Messung der Fluoreszenz auf die Konzentration der interessierenden Nanopartikel oder des Xeno-Biotikums analysiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Tierversuchen oder Zellkulturmodellen besteht darin, dass Plazentatransportstudien in einem kompletten Organ und direkt an menschlichem Gewebe durchgeführt werden können, was besonders für die Plazenta wichtig ist, da die Anatomie des Gewebes zwischen verschiedenen Spezies sehr stark ausgeprägt ist. Nach dem Aufbau des Profusionssystems, bestehend aus einem Wasserbad, einer Profusionskammer, zwei Säulen für die Sauerstoffversorgung, zwei Schlauchpumpen, zwei Blasenfallen, zwei Durchlauferhitzern und einem Drucksensor.

Verbinden Sie diese Komponenten mit Schlauchabschnitten, die aus Polyvinylchlorid nach diesem Schema bestehen. Schalten Sie dann das Wasserbad, die Durchlauferhitzer und die Heizung für die Perfusionskammer ein. Da das Perfusionsmedium nacheinander im Wasserbad vorgewärmt wird, spülen Sie das arterielle System des fetalen und mütterlichen Kreislaufs mit einer Durchflussrate von 15 bis 20 Millilitern pro Minute.

Verbinden Sie dann die fetale Kanüle mit dem fetalen arteriellen Schlauch und spülen Sie die arteriellen Systeme des fetalen und mütterlichen Kreislaufs mit vorwarmem Perfusionsmedium, bis alle Schläuche Medien enthalten. Während sich die Schläuche füllen, füllen Sie die Blasenfallen, entfernen Sie alle Blasen hinter der Falle und stoppen Sie dann die Pumpen. Schalten Sie nun den Gasfluss ein und starten Sie die Aufzeichnung des Drucksensors.

Die Kanülierung der Plazenta ist ein kritischer Schritt während der Perfusion. Jede noch so kleine Störung im Gewebe kann zu einem Leck zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kreislauf führen. Gehen Sie also vorsichtig vor, nachdem Sie eine intakte Plazenta aus unkomplizierten Schwangerschaften erhalten haben.

Nach dem primären Kaiserschnitt ist ein intaktes Co-Leadin in der Marginalzone der Plazenta ohne sichtbare Störungen auf der mütterlichen Seite zu wählen. Finden Sie das gleiche Co-Leadin auf der fetalen Seite. An der Chorionplatte werden beide Äste der Nabelarterie und der Vene zusammengebunden, die das gewählte Co-Leadin stromaufwärts der späteren Kanülenstelle liefern.

Beginnen Sie damit, eine Naht um die fötale Arterie an der Chorionplatte zu legen. Halten Sie dann das Gefäß mit einer Pinzette fest. Schneiden Sie die Arterie vorsichtig auf und setzen Sie die kleine Kanüle in die Arterie ein.

Binden Sie die Naht mit zwei Knoten mit einer größeren Kanüle. Gehen Sie mit der fetalen Vene auf die gleiche Weise vor. Schalten Sie dann die fetale Pumpe ein und erhöhen Sie den Durchfluss langsam auf bis zu vier Milliliter pro Minute.

Das Blut sollte aus der Venenkanüle des Fötus austreten, und der Druck in der Arterie des Fötus sollte 70 Millimeter Quecksilbersäule nicht überschreiten. Legen Sie dann die Plazenta mit der fötalen Seite nach oben auf den Gewebehalter und ziehen Sie die Plazentamembran und das Gewebe über die Spikes. Das perfundierte Co-Leadin sollte sich in der Mitte des Lochs im Gewebehalter befinden.

Stabilisieren Sie dann mit einer Silikonmembran das Gewebe, wo nur die Membran die Plazenta hält. Montieren Sie nun den kompletten Taschentuchhalter. Achten Sie darauf, dass die Venen- und Arterienkanüle nicht eingeklemmt werden, sondern in den kleinen Kanälen des Gewebehalters liegen.

Ziehen Sie dann die Schrauben fest und schneiden Sie überhängendes Taschentuch ab. Der Halter für Plazentagewebe ist nun vollständig montiert. Drehen Sie dann den Taschentuchhalter auf den Kopf.

Legen Sie es in die Perfusionskammer und decken Sie die Kammer ab. Vergewissern Sie sich, dass der fetale Kreislauf noch intakt ist und dass das Medium aus dem fetalen Venenschlauch fließt. Schalten Sie nun die mütterliche Pumpe ein.

Führen Sie dann die drei stumpfen Kanülen am Ende des mütterlichen Arterienrohrs in den intervillösen Raum ein, indem Sie in die Dezidualplatte eindringen. Um die Perfuse acht wieder in den mütterlichen Kreislauf zurückzuführen, platzieren Sie einen Schlauch, der mit der mütterlichen Pumpe verbunden ist, in der untersten Position im oberen Teil der Perfusionskammer, der als venöse Drainage dient. Verbinden Sie dann die Venenkanüle des Fötus mit dem Venenkanüle des Fötus, damit sich das Gewebe nach der Entbindung von der ischämischen Periode erholen und das Blut im Intervillösraum ausspülen kann.

Spülen Sie die mütterlichen und fetalen Gefäße 20 Minuten lang mit Perfusionsmedien und sammeln Sie den fetalen und mütterlichen venösen Abfluss in einer Flasche. Um die Integrität der Perfusion zu beurteilen, führen Sie eine weitere Vorphase von 20 Minuten in einem geschlossenen Kreislauf mit zwei separaten Reservoirs mit Perfusionsmedien für den fetalen und maternalen Kreislauf durch. Schließen Sie die Kreisläufe, indem Sie den venösen Abfluss des Fötus zurück in das fetale Reservoir und den venösen Abfluss der Mutter zurück in das mütterliche Reservoir führen.

Für das Hauptperfusionsexperiment werden zwei Kolben mit je 120 Millilitern Perfusionsmedium für das mütterliche Reservoir und das fetale Reservoir vorbereitet. Das radioaktiv markierte Anti-Pyren-Mittel und die gewünschten fluoreszenzmarkierten Xeno-Biotika oder Nanopartikel werden in den Kolben für das mütterliche Reservoir gegeben und die mütterliche Perfu eight gemischt. Nun, beginnen Sie endlich das Experiment, indem Sie das reine Perfusionsmedium mit den beiden vorbereiteten Kolben austauschen.

Das Volumen des fetalen und des mütterlichen Reservoirs sollte während der sechsstündigen Perfusion gleich bleiben. Ein fetaler Volumenverlust von mehr als vier Millilitern pro Stunde deutet auf ein Leck hin und die Perfusion muss gestoppt werden. Die Erfolgsrate einer sechsstündigen Perfusion ohne Leckage liegt bei etwa 15 bis 20 %In dieser ersten Grafik sind die Perfusionsprofile von kleinen 80 Nanometer Polystyrolpartikeln, die über die Plazenta transportiert wurden, im Vergleich zu größeren 500 Nanometer Polystyrolpartikeln, die nicht in das fötale Kompartiment übertragen wurden, für Polystyrol-Nanopartikel dargestellt.

Der Plazentatransfer ist größenabhängig: Nach dreistündiger Plazentaperfusion wurden bereits 20 bis 30% der ursprünglich zugegebenen 80 Nanometer Polystyrolpartikel vom mütterlichen in den fetalen Kreislauf übertragen, während die 500 Nanometer großen Polystyrolpartikel auch nach sechsstündiger Perfusion nicht im fetalen Kreislauf auftraten. Anti-Pyren ist ein kleines lipophiles Molekül, das durch passive Diffusion über die Plazentaschranke verteilt wird und als Kontrolle für die Integrität der Schaltkreise dient. Nach vier bis sechs Stunden Perfusion sollte ein Gleichgewicht zwischen der fetalen und der mütterlichen Anti-Pyre-Konzentration hergestellt werden, um die Plazentatransportrate von Xenobiotika zu beurteilen und zu vergleichen.

Hier wird in der Regel das Verhältnis der fetalen zur mütterlichen Arzneimittelkonzentration angezeigt. Ein charakteristisches Perfusionsprofil des radiomarkierten Anti-Pyne wird durch die Analyse der Plazentahormonproduktion sowie des Glukoseverbrauchs und der Laktatproduktion dargestellt. Die Lebensfähigkeit und Funktionalität des Plazentagewebes während der Perfusion kann überwacht werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine ex vivo Plazentaperfusion beim Menschen durchgeführt wird, die eine gültige und zuverlässige Methode zur Vorhersage der in vivo-Passage verschiedener endogener und exogener Substanzen ist.