Name: Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Erfahren Sie Pyrosequencing zur mikrobiellen Identifizierung durch 16S-rDNA-Analyse. Diese Methode ermöglicht die schnelle und präzise Bestimmung bakterieller Arten sowie die Detektion von Resistenzmutationen.

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Dieses Projekt war die Unterstützung teilweise durch Johns Hopkins University, Büro des Provost durch die Gateway-Initiative Wissenschaft im Dialog und Qiagen Inc.

Einleitung: Eine einzelne Bakterienkolonien sollte verwendet werden, um einen geeigneten Kulturmedium, das über Nacht inkubiert impfen werden. Eine bakterielle Pellet wird dann verarbeitet, um genomische DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen genomischen Isolierungskit reinigen. Das gereinigte genomische DNA sollte einen 260/280 (nm)-Verhältnis&gt; 1.8, um sicherzustellen, dass die Probe frei von Protein-Kontamination ist. Die Menge an genomischer DNA zur Erzeugung des Pyrosequenzierungs Schablone erforderlich ist 10-20 ng. A. Amplifikation der Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / Handbücher</a> 1) Einrichten der PCR-Reaktion Hinweis: Eine Grundierung muss an seinem 5&#39;-Ende biotinyliert werden, und es wird empfohlen, dass es HPLC gereinigt werden für die Template Vorbereitung. Wir empfehlen die PyroMark Assay-Design Software 2.0 für PCR und seSequenz Primer-Design, die für kurz-Lese-Sequenzierung optimiert sind, jedoch Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> Dose) von NCBI auch für die Primer-Design verwendet werden. <ol><li> Tauen Sie alle erforderlichen Lösungen (aufgeführt in Tabelle 1) und mischen Sie gründlich. Richten Sie die Reaktion gemäß Tabelle 1. Alle Arbeiten können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li></ol> Hinweis: Die PCR Master Mix enthält MgCl 2 für eine endgültige Konzentration von 1,5 mM, die zufriedenstellende Ergebnisse liefert in den meisten Fällen. Wenn eine höhere Mg 2 +-Konzentration benötigt wird, kann bis zu 3,5 ul 25 mM MgCl 2 zu einer Reaktion zugegeben werden. <ol start="2"><li> Mischen Sie die Reaktion Mischung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, dann verzichtet werden entsprechende Volumina in PCR-Röhrchen. </li><li> In template DNA zu jedem PCR-Röhrchen. Wir empfehlen 10 ng genomischer DNA. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 2. Eine abschließende Halten bei 4 ° C wird der Einfachheit halber empfohlen. Wenn Sie einen Thermocycler ohne beheizte Deckel Reaktionen Overlay mit 100 ul Mineralöl. </li><li> Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Cycler und starten Sie das Programm. </li></ol> B. Vacuum Workstation Protocol Immobilisierung des biotinylierten PCR-Produkte <ol><li> Machen Sie einen Master-Mix nach Abbildung 4. </li></ol> Hinweis: Vor dem Pipettieren, schütteln die Flasche Streptavidinbeschichteten Sepharosekügelchen um eine homogene Suspension zu gewährleisten. <ol start="2"><li> Abhängig vom Volumen des PCR-Produkts verwendet wird, verzichtet 60-75 ul Master-Mix in jede Vertiefung einer PCR-Platte, um ein Gesamtvolumen von 80 ul pro Vertiefung geben. </li><li> In 5-20 ul biotinylierten PCR-Produkt in jede Vertiefung. </li><li> Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifen ca.ps und rühren die PCR-Platte bei 1.400 rpm für 5-10 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C) mit einem Schüttler. </li></ol> Denaturierung von DNA und Zugabe von Sequenzierungsprimer <ol><li> Verdünnen Sie die Sequenzierungsprimern bis 0,3 um mit Annealingpuffer und verzichten 25 ul in jede Vertiefung einer Reaktion Platte. Positionieren Sie die Platte auf der Arbeitsstation. </li><li> Füllen Sie die Workstation Mulden nach der Abbildung 5 Diagramm. </li><li> Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, und stellen Sie sicher, dass der Schalter auf der Vakuum-Werkzeug, um auf (Abbildung 6). Spülen Sie die Filter-Sonden mit hochreinem Wasser (Milli-Q 18,2 MW x cm oder gleichwertig) in Wanne 5 (Abbildung 5). Füllen Sie die Wanne mit frischem hochreinem Wasser für die Verwendung in Schritt 12. </li><li> Arbeiten schnell, positionieren Sie den PCR-Platte mit Perlen auf der Arbeitsstation. Stellen Sie sicher, dass die beiden Platten in der gleichen Richtung sind, wenn die Proben geladen. </li><li> Mit dem Vakuum-Schalter ON, senken das VakuumWerkzeug in die Vertiefungen des PCR-Platte für 20 Sekunden oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. Die Perlen werden durch das Vakuum-Werkzeug (Abb. 7) erfasst werden. </li><li> Mit dem Vakuum noch auf, spülen Sie das Tool mit 70% Ethanol (Trog 1) für 20 Sekunden oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li><li> Mit Vakuum-ON, spülen Sie das Werkzeug mit Denaturierungslösung (Wanne 2) für 20 sec oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li></ol> Hinweis: Die Denaturierungsreagenz enthält Natriumhydroxid, das eine Auge und Haut reizend ist. Tragen Sie immer einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrille tragen. <ol start="8"><li> Mit Vakuum-ON, spülen Sie das Tool mit Waschpuffer (Trog 3) für 20 sec oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li><li> Mit Vakuum-ON, heben Sie den Vakuum-Tool, über 90 ° vertikal für 5 Sekunden, damit alle Flüssigkeit abtropfen aus dem Vakuum-Tool. Schalten Sie die Pumpe AUS, und richten Sie die Vakuum-Tool mit der Reaktion Platte. Senken Sie den Vakuum-Werkzeug in derBrunnen und sanft hin und her zu schütteln, um die Kügelchen in die Vertiefungen, die Sequenzierungsprimer freizugeben. </li><li> Um das Vakuum Werkzeug reinigen, schüttelt die Filter Sonden in Reinstwasser (Wanne 4) für 10 Sekunden. </li><li> Schalten Sie das Vakuum ON und spülen Sie das Tool mit hochreinem Wasser (Wanne 5) für 20 sec oder bis alle Volumen angesaugt worden ist. </li><li> Heben Sie das Vakuum Werkzeug, um mehr als 90 ° C für 5 sec vertikal, dann schalten Sie das Vakuum ab und lagern in der &quot;Parking&quot;-Position. </li></ol> Glühen Sequenzierungsprimer um DNA-Stränge <ol><li> Legen Sie die Reaktion Platte in einer vorgewärmten Platte Inhaber. </li><li> Anschließend wird die Platte auf einem Heizblock bei 80 ° C für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die Platte aus der Halterung und auf dem Zähler bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen. </li></ol> PyroMark Q24 Betrieb Hinweis: Schalten Sie das Gerät über den Netzschalter über das Netzkabel entfernt. Sterntup kann bis zu 1 min. <ol><li> Füllen Sie eine Patrone gemäß den Anweisungen in der PyroMark Gold-Q24 Reagenzien Handbook 2 vorgesehen. Um Volumina benötigt, bis eine run-Datei in der Gerätesoftware eingestellt zu bestimmen, und unter dem Menü Extras wählen Pre Run Informationen </li><li> Wenn das Gerät bereits auf, sicherzustellen, dass sie nicht auf der Bühne einen Lauf und dann den Deckel öffnen. Ein akustisches Warnsignal wird ausgegeben, wenn der Deckel geöffnet wird, wenn es nicht sicher ist, dies zu tun. </li><li> Öffnen Sie die Patrone Gate und setzen Sie die Patrone mit dem Etikett nach vorne (Abbildung 8). Stellen Sie sicher, dass die Patrone richtig eingelegt ist (eine Linie sichtbar sein soll an der Front) und schließen Sie die Tür. </li><li> Öffnen Sie die Platte-Halterahmen und positionieren Sie die Platte mit Proben im Inneren des Gerätes. </li><li> Schließen Sie die Platte-Halterahmen und das Instrument Deckel (Abbildung 9). </li></ol> Ab einen Lauf <ol><li> Stecken Sie den USB-Stick mit dem run-Dateis erstellt mit der Gerätesoftware in den USB-Port an der Vorderseite des Gerätes. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; im Hauptmenü und drücken Sie &quot;OK&quot;. </li><li> Verwenden Sie die Scroll-Pfeile, um die gewünschte Datei auszuwählen run und drücken Sie &quot;Select&quot;. </li></ol> Hinweis: Das Gerät beginnt Abgabe Reagenzien, wenn alle vorgegebenen Druck-und Temperaturniveaus erreicht werden (dies kann einige Minuten dauern). Während eines Laufs, zeigt das Gerät den Bildschirm des ausgewählten Pyrogramm auch in Echtzeit. Verwenden Sie die Scroll-Pfeile, um die Pyrogramm anderer Brunnen zu sehen. Abschließen einer run <ol><li> Wenn das Instrument bestätigt, dass der Lauf beendet ist und die run-Datei auf USB-Stick gespeichert wurden, drücken Sie auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Entfernen Sie den USB-Stick. Wenn es entfernt wurde, bevor der Lauf beendet ist, stecken Sie den USB-Stick. Wählen Sie &quot;Verwaltung&quot; und dann &quot;Copy gespeicherte Runs&quot;. </li><li> Die run-Datei kann nun geöffnet und analysiert werden mit der Gerätesoftware und verglichenzu einer Bibliothek von bekannten Mikroben mit der Identifire Software. </li></ol>

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Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel von der Firma Qiagen gesponsert. Autoren Ahmed, Durocher, Jessen und Vardi sind Mitarbeiter von Qiagen Inc., die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Mehrere neue Next Generation Sequencing Methoden wurden kommerzialisiert. Drei der am häufigsten verwendeten Methoden sind Ionen-Halbleiter-Sequenzierung, einzelnes Molekül Echtzeit-Sequenzierung und Sequenzierung durch Synthese (SBS). 3-11 Jede dieser Methoden hängt Sequenzierung durch Synthese, sondern beschäftigen neuartige Plattformen für den Nachweis der eingebauten Nukleotide. In Ion Halbleiter-Sequenzierung, dient ein einzelner DNA-Strang als Vorlage für die Sequenzierung Strang. Polymerase und 12 Nukleotide nacheinander wie in pyrosequencing aufgenommen. Wenn ein Nukleotid auf die wachsende DNA-Strang hinzugefügt wird, wird ein Wasserstoffion freigegeben. Die Wasserstoffionenkonzentration wird durch einen Feldeffekttransistor Basis erfasst. Einzel-Molekül Echtzeit-Sequenzierung abhängig von der Null-Modus Wellenleiter (ZMW). 13 Die ZMW ist eine kleine Struktur, wo ein einzelnes Molekül der Polymerase Boden des Schachtes befestigt ist. Es wird in einer solchen Weise, dass ein Flore beleuchtetDuft-Molekül erkannt werden können. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert. Als fluoreszierend markierten Nukleotid eingebaut identifiziert ein Detektor die Nukleotidsequenz. Wenn die nächste Nukleotid hinzugefügt wird, wird das fluoreszierende Molekül abgespalten. 14 Sequenzierung durch Synthese (SBS) nutzt eine einzigartige Methode zur Amplifikation der Ziel-DNA, so dass Cluster einzigartige Sequenzen erzeugt werden. 15 Einzel-Matrizen erzeugt werden und dann der komplementäre Strang synthetisiert wird. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert ist und nach jeder Basenzugabe die Fluoreszenz des zugesetzten Base wird aufgezeichnet.

Pyrosequencing ist eine schnelle und genaue Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; basiert. &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; beinhaltet die Verwendung einer Einzelstrang-DNA-Vorlage, um den komplementären Strang einer Basisstation zu einer Zeit zu synthetisieren, und Erfassen der eingebaute Base (A, T, G oder C) bei jedem Schritt durch die Erfassung eines Chemilumineszenz-Signals. Die Reaktion umfasst Pyrosequenzierungs Matrizen-DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferin, Luciferase und Apyrase. Die Synthesereaktion wird durch die Zugabe von einer der vier dNTPs und DNA-Polymerase an den biotinylierten einzelsträngigen Matrizen-DNA initiiert. DNA-Polymerase enthält die komplementären dNTP auf die Schablone, mit der anschließenden Freisetzung von Pyrophosphat (Abbildung 1). ATP Sulfurylase anteilig wandelt das Pyrophosphat zu ATP. ATP wirkt als Katalysator für die Luciferase vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, dasLicht erzeugt (Abbildung 2). Die Intensität des Lichts ist proportional zu der Anzahl von Nucleotiden enthalten und bestimmt, ob ein oder mehrere spezifische dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP oder) ist auf dem Template-Strang sequentiell (Abbildung 3). Jede unincorporated dNTP abgebaut Apyrase vor der Zugabe der nächsten dNTP für die Fortsetzung der Synthesereaktion. Dieses &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; Reaktion wird unter Zusatz von jedem der vier dNTPs wiederholt, bis die DNA-Sequenz der einzelsträngigen DNA-Matrize bestimmt. Um eine Animation der Pyrosequencing Reaktion sehen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Konzentrat, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Lösung, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freie Wasser</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Qiagen</td><td>978776 oder 978777</td><td>Primer sollten von einem etablierten Oligonukleotidhersteller erworben werden (d. h. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT usw.). Lyophilisierte Primer sollten in TE gelöst werden, um eine Stammlösung von 100 μM zu erhalten.</td></tr><tr><td>Pyromark Gold Q24 Reagenzien</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Hochreines Wasser (Milli-Q 18,2 M&Omega; x cm oder gleichwertig)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose Hochleistungsperlen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Glühpuffer</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Denaturierungslösung</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Wash Buffer</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Kartusche</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS Spitzenhalter Box</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Vakuum Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Plattenhalter</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pyrosequencing für mikrobielle identifizierung und charakterisierung

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies zu identifizieren, zu unterscheiden und zu erkennen Bakterienstämme genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. Die Vorteile für die Mikrobiologie Pyrosequenzierungs Anwendungen sind schnelle und zuverlässige Hochdurchsatz-Screening und genaue Identifizierung der Mikroorganismen und mikrobielle Genmutationen. Pyrosequencing betrifft die Sequenzierung von DNA durch Synthetisieren des komplementären Strangs einer einzigen Basisstation zu einer Zeit, bei der Ermittlung der spezifischen Nukleotids während der Synthesereaktion eingearbeitet. Die Reaktion erfolgt an immobilisierten einzelsträngigen Matrizen-DNA, wo die vier Desoxyribonukleotide (dNTP) nacheinander zugegeben und nicht-eingebauten dNTPs enzymatisch abgebaut werden vor der Zugabe der nächsten dNTP der Synthesereaktion. Nachweis der spezifischen Base in der Vorlage enthalten ist durch Erzeugung chemilum überwachtinescent Signale. Die Reihenfolge der dNTPs, die die Chemilumineszenz zu erzeugen bestimmt die DNA Sequenz der Matrize. Die Echtzeit-Sequenzierung Fähigkeit Pyrosequenzierungstechnologie ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Mikroorganismen in einem einzigen Assay. Darüber hinaus ist die Pyrosequencing Instrument, analysieren die volle genetische Vielfalt der antimikrobiellen Resistenzen, einschließlich Typisierung von SNPs, Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und sowie Quantifizierung mehrerer Genkopien, die in irgendeiner Antibiotikaresistenz auftreten können Mustern.

Die Ergebnisse eines typischen pyrosequencing Lauf mit der Software zeigt die Lage der Vorwärts-und Rückwärtsprimer Amplikons für Generation verwendet wird, und der Sequenzierungsprimer die pyrosequencing Reaktion innerhalb der 16S ribosomalen Sequenz (10). Die hypervariable Sequenz zwischen dem Primer Verbindungsstellen ermöglicht Identifizierung von Bakterien aus einer Vielzahl von Bakterienarten mit dem konservierten Sequenzierung (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Als interne Qualitätskontrolle, die DNA-Sequenz Klammerung der variable Bereich überprüft werden, um sicherzustellen, dass die korrekte DNA-Bereich analysiert wurde . Die Pyrosequenzierungs Software ermöglicht den Vergleich und Ausrichtung der erzeugten Sequenz in einer internen Datenbank der bakteriellen ribosomalen Sequenzen für Identifizierung von Bakterien. Darüber hinaus kann eine zu analysierende Sequenz von Mutationen, die Antibiotikum-Resistenz verleihen bestimmen. Beispielsweise Analyse von Mutationen in der 23S ribosomalen Gene HelicobActer pylori zeigt zwei Mutationsmuster (GAA oder AGA), die Antibiotika-Resistenz (Abbildung 11). Die Analyse der verschiedenen Isolate vom gleichen Patienten können gleichzeitig getestet werden, um die Entstehung von Resistenzen im Laufe der Zeit in epidemiologischen Untersuchungen von Resistenzen gegen antimikrobielle Arzneimittel Ausbrüche helfen zu verfolgen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Abbildung 1. Biotinylierte PCR-Produkt wird als Vorlage dNTPs durch DNA-Polymerase enthalten, was zur Erzeugung von Pyrophosphat (PPi) verwendet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Abbildung 2. ATP Sulfurylase anteilig wandelt Pyrophosphat zu ATP. ATP wirkt als Katalysator für die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, das Licht, das Pro ist erzeugtproportional zu der Menge an ATP. Das Licht wird als Höhepunkt am Pyrogramm Trace aufgezeichnet und zeigt Nucleotideinbaus. Nicht-eingebauten dNTPs abgebaut von Apyrase, bevor die nächste dNTP für die Fortsetzung der Synthese zugegeben wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Intensität des Lichts generiert wird, wenn eine oder mehrere spezifische dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP oder) auf dem Template-Strang eingebaut wurde nacheinander. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ablaufschema für die Vorbereitung der Master-Mix, um die biotinylierten PCR-Produkt zu fixieren. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Abbildung 5. PyroMark Workstation mit PCR-Platte, Platte PyroMark und Trog Standorten. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Abbildung 6. Standorte der Vakuum-Schalter ON und OFF Positionen. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Abbildung 7. Vacuum-Tool. Richtige Handhabung der Vakuum-Tool. <img alt="Fig. 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Abbildung 8. Cartridge Tor geöffnet mit Patrone im Ort. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Abbildung 9. Cartridge richtig eingesetzt mit geschlossenem Tor. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Abbildung 10. Pyrosequencing basierte Identifizierung von Bakterien führt. PCR-Primer für konservierte Regionen der DNA-Matrize ausgebildet ist und der Sequenzierprimer unmittelbar stromaufwärts eines gut charakterisierten Identifizierung hypervariablen DNA-Sequenz innerhalb des Amplikons (blau) angeordnet ist. <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Abbildung 11. Nachweis von Antibiotika-Resistenzen in Helicobacter pylori mit pyrosequencing. Analyse von Mutationen in den Genen, die 23S antibakterielle Resistenz in Helicobacter pylori mit GAA oder AGA-Sequenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Komponente </td><td> Volumen pro Reaktion </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Konzentrat, 10x </td><td> 2,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 (optional) </td><td> Variable </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Lösung, 5x (optional) </td><td> 5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variable / Variable </td><td> 0,2 μM/0.2 uM </td></tr><tr><td> RNase-freies Wasser </td><td> Variable </td><td> - </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen (nach Zugabe von DNA) </td><td> 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. PCR-Reaktionsgemisch. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Initial PCR Aktivierung Schritt </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA Polymerase aktiviert </td></tr><tr><td> 3 Schritt Radfahren: Denaturierung </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Glühen </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Für genomische DNA Für Bisulfit-konvertierter DNA </td></tr><tr><td> Erweiterung </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Anzahl der Zyklen </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Abschließende Verlängerung </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. PCR-Zyklus Spezifikationen.

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein Bakterium durch Analyse der 16S-ribosomalen DNA-Sequenz mithilfe der Pyrosequenzierungsmethode zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem die Ziel-DNA zunächst mittels Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines biotinylierten Primers amplifiziert wird. Der biotinylierte Amplifikat wird anschließend mit Streptavidin-beschichteten Sphäro-Beads immobilisiert und mittels Waschpuffern gereinigt.Anschließend wird das Amplikon denaturiert und die 16S-ribosomalen Sequenzierungsprimer an die einzelsträngigen DNA-Moleküle angeheftet. Das Ziel dieses Schritts besteht darin, die DNA für die Sequenzierung vorzubereiten. Abschließend erfolgt die DNA-Sequenzierungsreaktion mittels Pyrosequenzierung, einer schnellen und genauen Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der Sequenzierung durch Synthese beruht.Die biotinylierte Alicon dient als Vorlage für die DNA-Polymerase, um DNTPS einzeln Base für Base einzubauen, wodurch Pyrophosphat entsteht. ATP Sul Urease wandelt das Pyrophosphat proportional in ATP um, und ATP katalysiert die luciferasevermittelte Umwandlung von Lucifer in Lucifer, wodurch Licht erzeugt wird, das proportional zur Menge an ATP ist. Das Licht wird als Peak in der Pyrosequenzierungskurve registriert und zeigt die Nukleotideinlagerung an. Die nicht eingebauten dNTPs werden durch Apras abgebaut, bevor das nächste dNTP hinzugefügt wird, um die Synthese fortzusetzen.Das chemilumineszente Signal, das auf dem Programm aufgezeichnet wird, ermöglicht die Bestimmung der DNA-Sequenz. Die erhaltenen Ergebnisse sind ribosomale 16S-DNA-Sequenzen, die durch Vergleich mit einer Referenzdatenbank ribosomaler DNA zur Identifizierung des Bakteriums verwendet werden. Die Pyrosequenzierung ist eine vielseitige Technik, die die Sequenzierung mikrobieller Genome erleichtert und zur Identifizierung bakterieller Arten, zur Unterscheidung bakterieller Stämme sowie zum Nachweis genetischer Mutationen, die Resistenz gegen antimikrobielle Wirkstoffe vermitteln, eingesetzt werden kann.In diesem Video wird das Verfahren zur Erzeugung bakterieller Amplikone, die Amplikon-Pyrosequenzierung und die DNA-Sequenzanalyse demonstriert. Um mit der Vorlagenvermehrung zu beginnen, tauen Sie alle benötigten Lösungen auf und mischen Sie jede gründlich. Die gesamte Arbeit kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Richten Sie die PCR-Reaktion gemäß dieser Tabelle ein.Beachten Sie, dass eine endgültige Konzentration von Magnesiumchlorid von 1,5 Millimolar in den meisten Fällen zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Falls jedoch eine höhere Magnesiumkonzentration erforderlich ist, können bis zu 3,5 µL einer 25 mM-Magnesiumchloridlösung zu der Reaktion hinzugefügt werden. Ein Primer muss an seinem 5'-Ende biotinyliert sein, und es wird empfohlen, den Primer gründlich mittels HPLC zu reinigen.Mischen Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und geben Sie anschließend geeignete Volumina in PCR-Röhrchen. Fügen Sie danach Template-DNA zu jedem PCR-Röhrchen hinzu. Es werden 10 Nanogramm genomische DNA pro Reaktion empfohlen.Die PCR-Röhrchen in einen Cycler geben und dieses Zyklenprogramm starten, bevor die Master-Mix-Zubereitung erfolgt. Die Flasche mit Strep Avid und beschichteten Seros-Beads sanft schwenken, um eine homogene Suspension zu gewährleisten. Einen Master-Mix gemäß diesem Flussdiagramm herstellen.Beaden, Bindungspuffer und hochreines Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. Abhängig vom verwendeten Volumen des PCR-Produkts 60 bis 75 Mikroliter Master-Mix in jedes Loch einer PCR-Platte dosieren, sodass das Gesamtvolumen pro Loch 80 Mikroliter beträgt. Fünf bis 20 Mikroliter biotinyliertes PCR-Produkt zu jedem Loch hinzufügen.Das Volumen pro Vertiefung sollte nun 80 Mikroliter betragen. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifendeckeln und schütteln Sie die PCR-Platte fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur mit 1.400 U/min mithilfe eines Rotationsschüttlagers. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Sequenzierungsprimer mit einem Kniepuffer auf 0,3 Mikromolar verdünnen und 25 Mikroliter in jede Vertiefung der Reaktionsplatte abgeben.Platzieren Sie die Platte auf der Vakuum-Workstation. Füllen Sie die Rinnen der Workstation gemäß diesem Diagramm: 50 Milliliter 70 % Ethanol in Rinne eins, 40 Milliliter Denaturierungslösung in Rinne zwei, 50 Milliliter Waschpuffer in Rinne drei, 50 Milliliter hochreines Wasser in Rinne vier und 70 Milliliter hochreines Wasser in Rinne fünf.Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie sicher, dass der Schalter am Vakuumwerkzeug auf „Ein“ steht, um die Filterproben mit hochreinem Wasser zu spülen. Positionieren Sie in Rinne fünf die PCR-Platte mit den Kügelchen auf der Arbeitsstation, wobei sowohl die PCR- als auch die Reaktionsplatte dieselbe Ausrichtung haben müssen. Senken Sie das Vakuumwerkzeug in die Vertiefungen der PCR-Platte ab.Die Perlen werden für 20 Sekunden oder bis das gesamte Volumen aspiriert wurde mit eingeschaltetem Vakuum durch das Vakuumwerkzeug erfasst. Spülen Sie das Werkzeug 20 Sekunden lang oder bis das gesamte Volumen aspiriert wurde mit 70 % Ethanol. Als Nächstes spülen Sie das Werkzeug 20 Sekunden lang oder bis das gesamte Volumen aspiriert wurde mit Denaturierungslösung.Anschließend spülen Sie das Werkzeug mit Waschpuffer für 20 Sekunden oder bis die gesamte Flüssigkeitsmenge unter weiterhin eingeschaltetem Vakuum abgesaugt wurde. Heben Sie das Vakuumwerkzeug für fünf Sekunden auf mehr als 90 Grad zur Vertikalen an, um das vollständige Abfließen der Flüssigkeit aus dem Werkzeug zu ermöglichen. Schalten Sie nun die Pumpe aus und richten Sie das Vakuumwerkzeug an der Drei-Reaktionsplatte aus.Senken Sie das Vakuumwerkzeug in die Vertiefungen ab. Schütteln Sie es dann etwa 10 Sekunden lang vorsichtig von Seite zu Seite, um die Kügelchen in die Vertiefungen mit Sequenzierungsprimer freizusetzen. Legen Sie das Vakuumwerkzeug zur Reinigung in die Wasserwanne, um den Sequenzierungsprimer an die DNA zu binden.Stellen Sie die Reaktionsplatte in einen vorgewärmten Plattenhalter. Erhitzen Sie die Platte auf 80 Grad Celsius für zwei Minuten. Entfernen Sie die Platte aus dem Halter und stellen Sie sie zur Abkühlung auf Raumtemperatur fünf Minuten lang auf die Arbeitsfläche.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Gerät mit dem Netzschalter über dem Netzkabel einschalten, um die benötigten Volumina zu bestimmen. Richten Sie eine Laufdatei in der Instrumentensoftware ein und wählen Sie im Menü „Werkzeuge“ die Option „Vorlauf-Informationen“. Füllen Sie eine Kartusche gemäß der Anleitung auf der Seite „Vorlauf-Informationen“.Bringen Sie die Pipettenspitze so weit wie möglich in die Ecke jedes Wells, und vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Öffnen Sie das Fach für die Kartusche und setzen Sie die Kartusche mit dem Etikett nach vorne ein. Stellen Sie sicher, dass die Kartusche korrekt eingesetzt ist, und schließen Sie das Fach.Öffnen Sie den Halterahmen für die Platte und positionieren Sie die Reaktionsplatte innerhalb des Geräts. Schließen Sie den Halterahmen für die Platte und den Gerätedeckel. Stecken Sie das USB-Stick mit den mithilfe der Instrumentensoftware erstellten Laufdateien in den USB-Anschluss an der Vorderseite des Geräts.Bestätigen Sie, um das Menü der gewünschten Laufdateien anzuzeigen. Wählen Sie mithilfe der Bildlaufpfeile die gewünschte Laufdatei aus und drücken Sie „Auswählen“. Sobald alle voreingestellten Druck- und Temperaturniveaus erreicht sind, beginnt das Gerät während eines Laufs mit der Zugabe der Reagenzien.Der Gerätebildschirm zeigt die Pyrosequenzierung des ausgewählten Wells in Echtzeit an. Verwenden Sie die Bildlaufpfeile, um die Pyrosequenzierungen anderer Wells anzusehen. Sobald das Gerät bestätigt, dass der Lauf beendet ist und die Laufdatei auf dem USB-Stick gespeichert wurde, drücken Sie „Schließen“.Entfernen Sie den USB-Stick. Die Ergebnisse eines typischen Pyrosequencing-Laufs sind hier dargestellt. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer werden für konservierte Bereiche der DNA-Vorlage, nämlich der 16S-ribosomalen Sequenz, entworfen.In diesem Beispiel befindet sich der Sequenzierungsprimer unmittelbar upstream einer gut charakterisierten, identifizierenden hypervariablen DNA-Sequenz innerhalb des in blau dargestellten Amplikons. Diese hypervariable Sequenz ermöglicht die bakterielle Identifizierung einer großen Anzahl bakterieller Arten unter Verwendung des konservierten Sequenzierungsprimers als interne Qualitätskontrolle; die die variable Region flankierende DNA-Sequenz kann überprüft werden, um sicherzustellen, dass der korrekte DNA-Bereich analysiert wurde. Die Pyrosequenzierungssoftware ermöglicht den Vergleich und die Alignierung der erzeugten Sequenz mit einer internen Datenbank bakterieller ribosomaler Sequenzen zur bakteriellen Identifizierung.Außerdem kann eine Sequenz analysiert werden, um Mutationen zu identifizieren, die eine Antibiotikaresistenz vermitteln. Beispielsweise zeigt die Analyse von Mutationen in den 23S-ribosomalen Genen von Helicobacter pylori zwei Mutationsmuster, GAA oder GA, die eine Antibiotikaresistenz verleihen. Die Pyrosequenzierung ist eine vielseitige Technik, die die Sequenzierung mikrobieller Genome erleichtert.Die Vorteile der Pyrosequenzierung für mikrobiologische Anwendungen umfassen eine schnelle und zuverlässige Hochdurchsatzanalyse sowie die genaue Identifizierung von Mikroorganismen und Mutationen im mikrobiellen Genom. Darüber hinaus kann die Pyrosequenzierungsmethode die gesamte genetische Vielfalt der antimikrobiellen Resistenz analysieren, einschließlich der Typisierung von SNP-Punktmutationen, Insertionen und Deletionen sowie der Quantifizierung mehrfacher Genkopien, die bei bestimmten antimikrobiellen Resistenzmustern auftreten können. Vielen Dank für das Ansehen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihren Sequenzierungsversuchen.

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Biologie

Pyrosequencing (R) ist eine der am gründlichsten dennoch einfache Methoden, um Datum verwendet werden, um Polymorphismen zu analysieren. Diese Methode hat eine schnelle und effiziente Single-Nukleotid-Polymorphismus Auswertung darunter viele klinisch relevante Polymorphismen geführt. Die Technik und Methodik der Pyrosequencing erklärt.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.

Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Über DNA Stable Isotope Probing Mit<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

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Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

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Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

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Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

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