Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Identifizierung eines Bakteriums durch 16 s ribosomale DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung der Pyro-Sequenzierungsmethode. Dies wird erreicht, indem zunächst die Ziel-DNA durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines biotinylierten Primers amplifiziert wird. Das biotinylierte Amplikon wird dann mit Streptavidin-beschichteten Spheroskügelchen immobilisiert und mit Waschpuffern gereinigt.

Als nächstes wird das Amplikon denaturiert und 16 s ribosomale Sequenzierungsprimer werden mit ELL an die einzelnen DNA-Stränge gebunden. Ziel dieses Schritts ist es, die DNA für die Sequenzierung vorzubereiten. Schließlich erfolgt die DNA-Sequenzierungsreaktion durch Pyro-Sequenzierung, eine schnelle und genaue Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der Sequenzierung durch Synthese basiert.

Das biotinylierte Alizium wird von der DNA-Polymerase als Matrize verwendet, um DN TPS Base für Base einzubauen, was zur Bildung von Pyrophosphat führt. Ein TP-Sul-Urease wandelt Pyrophosphat proportional in A-T-P-A-T-P um und katalysiert die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luzifer in Luzifer, wodurch Licht erzeugt wird, das proportional zur Menge eines TP ist. Das Licht wird als Peak auf der Pyrospur aufgezeichnet und zeigt den Nukleotideinbau an. Die nicht inkorporierten DN-NTPs werden durch Apras abgebaut, bevor das nächste DNTP zur Fortsetzung der Synthese hinzugefügt wird.

Das auf dem Rogramm aufgezeichnete Chemilumineszenzsignal ermöglicht die Bestimmung der DNA-Sequenz. Bei den erhaltenen Ergebnissen handelt es sich um ribosomale 16 SDNA-Sequenzen, die zur Identifizierung des Bakteriums durch Vergleich mit einer ribosomalen DNA-Referenzdatenbank verwendet werden. Die Pyro-Sequenzierung ist eine vielseitige Technik, die die mikrobielle Genomsequenzierung erleichtert und zur Identifizierung von Bakterienarten, zur Unterscheidung von Bakterienstämmen und zum Nachweis genetischer Mutationen verwendet werden kann, die Resistenz gegen antimikrobielle Wirkstoffe verleihen.

In diesem Video wird das Verfahren zur Generierung von bakteriellen Amplikonen, zur Lampenpyrosequenzierung und zur DNA-Sequenzanalyse demonstriert: Um das Verfahren für die Template-Amplifikation zu beginnen, tauen Sie alle erforderlichen Lösungen auf und mischen Sie sie gründlich. Alle Arbeiten können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Richten Sie die PCR-Reaktion gemäß dieser Tabelle ein.

Beachten Sie, dass eine endgültige Magnesiumchloridkonzentration von 1,5 Millimolar in den meisten Fällen zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Ist jedoch eine höhere Magnesiumkonzentration bis zu 3,5 Mikroliter à 25 Millimolar erforderlich, kann Magnesiumchlorid zu einer Reaktion hinzugefügt werden. Ein Primer muss an seinen fünf Primzahlen biotinyliert werden, und es wird empfohlen, den Primer gründlich HPLC-zu reinigen.

Mischen Sie das Reaktionsgemisch durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren und geben Sie dann die entsprechenden Volumina in PCR-Röhrchen ab. Fügen Sie als Nächstes Template-DNA zu jedem PCR-Röhrchen hinzu. Empfohlen werden 10 Nanogramm genomische DNA pro Reaktion.

Legen Sie die PCR-Röhrchen in einen Cycler und starten Sie dieses Zyklusprogramm, bevor Sie den Mastermix herstellen. Schwenken Sie die Flasche mit Streptokokken-Avid- und beschichteten Seros-Kügelchen, um eine homogene Suspension zu gewährleisten. Erstellen Sie einen Mastermix gemäß diesem Flussdiagramm.

Kombination von Kügelchen, Bindungspuffer und hochreinem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Abhängig vom Volumen des verwendeten PCR-Produkts werden 60 bis 75 Mikroliter Mastermix in jede Vertiefung einer PCR-Platte dosiert, so dass das Gesamtvolumen 80 Mikroliter pro Vertiefung beträgt. Geben Sie fünf bis 20 Mikroliter biotinyliertes PCR-Produkt in jede Vertiefung

Das Volumen pro Vertiefung sollte nun 80 Mikroliter betragen. Verschließen Sie die Wells mit Streifenkappen und rühren Sie die PCR-Platte fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Orbitalschüttler bei 1.400 U/min. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Sequenzierprimer mit einem knienden Puffer auf 0,3 Mikromolar verdünnen und 25 Mikroliter in jede Vertiefung der Reaktionsplatte abgeben.

Positionieren Sie die Platte auf der Vakuumarbeitsstation. Füllen Sie die Mulden des Arbeitsplatzes gemäß diesem Diagramm. 50 Milliliter 70%iges Ethanol in der Wanne eins, 40 Milliliter Denaturierungslösung in der Wanne zwei, 50 Milliliter Waschpuffer in der Wanne drei, 50 Milliliter hochreines Wasser in der Wanne vier und 70 Milliliter hochreines Wasser in der Wanne fünf.

Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und vergewissern Sie sich, dass der Schalter am Vakuumwerkzeug auf ein Spülen, die Filtersonden mit hochreinem Wasser spülen steht. Positionieren Sie die PCR-Platte mit den Kügelchen auf der Workstation und stellen Sie sicher, dass sich sowohl die PCR- als auch die Reaktionsplatte in der gleichen Ausrichtung befinden. Senken Sie das Vakuumwerkzeug in die Vertiefungen der PCR-Platte ab.

Für 20 Sekunden oder bis das gesamte Volumen angesaugt wurde, werden die Kügelchen vom Vakuumwerkzeug erfasst, während das Vakuum noch eingeschaltet ist. Spülen Sie das Werkzeug 20 Sekunden lang mit 70 % Ethanol oder bis das gesamte Volumen abgesaugt ist. Spülen Sie das Werkzeug anschließend 20 Sekunden lang mit Denaturierungslösung oder bis das gesamte Volumen abgesaugt ist.

Spülen Sie danach das Werkzeug 20 Sekunden lang mit Waschpuffer oder bis das gesamte Volumen bei eingeschaltetem Vakuum abgesaugt wurde. Heben Sie das Vakuumwerkzeug fünf Sekunden lang auf über 90 Grad vertikal an, damit die gesamte Flüssigkeit aus dem Vakuumwerkzeug abfließen kann. Schalten Sie nun die Pumpe aus und richten Sie das Vakuumwerkzeug mit drei Reaktionsplatten aus.

Senken Sie das Vakuumwerkzeug in die Vertiefungen ab. Schütteln Sie dann etwa 10 Sekunden lang vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Kügelchen in die Vertiefungen mit dem Sequenzierungsprimer freizusetzen. Legen Sie das Vakuumwerkzeug zur Reinigung in den Wassertrog, um den Sequenzierungsprimer an der DNA zu befestigen.

Legen Sie die Reaktionsplatte in einen vorgewärmten Plattenhalter. Erhitzen Sie die Platte zwei Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus der Halterung und stellen Sie sie auf die Arbeitsplatte, um sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur abzukühlen.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Gerät mit dem Netzschalter über dem Netzkabel einschalten, um die erforderliche Lautstärke zu bestimmen. Richten Sie eine Ausführungsdatei in der Gerätesoftware ein und wählen Sie im Menü "Werkzeuge" die Option "Informationen vor dem Lauf" aus. Füllen Sie eine Kartusche gemäß den Anweisungen auf der Informationsseite vor dem Lauf.

Stecken Sie die Pipettenspitze so weit wie möglich in die Ecke jeder Vertiefung und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Öffnen Sie den Patronenverschluss und setzen Sie die Patrone mit dem Etikett nach vorne ein. Vergewissern Sie sich, dass die Kartusche richtig eingesetzt ist, und schließen Sie den Anschnitt.

Öffnen Sie den Plattenhalterahmen und positionieren Sie die Reaktionsplatte im Inneren des Geräts. Schließen Sie den Plattenhalterahmen und den Instrumentendeckel. Stecken Sie den USB-Stick mit den mit der Instrumentensoftware erstellten Run-Dateien in den USB-Anschluss an der Vorderseite des Instrumentendruckers.

Es ist in Ordnung, das Menü der gewünschten Ausführungsdateien zu sehen. Verwenden Sie die Bildlaufpfeile, um die gewünschte Ausführungsdatei auszuwählen, und drücken Sie Auswählen. Wenn alle voreingestellten Druck- und Temperaturniveaus erreicht sind, beginnt das Gerät während eines Laufs mit der Abgabe von Reagenzien.

Auf dem Instrumentenbildschirm wird die Pyro des ausgewählten Wells in Echtzeit angezeigt. Benutze die Scroll-Pfeile, um die Pyros anderer Bohrlöcher zu sehen. Wenn das Gerät bestätigt, dass der Lauf beendet ist und die Laufdatei auf dem USB-Stick gespeichert wurde, drücken Sie auf Schließen.

Entfernen Sie den USB-Stick. Hier sind die Ergebnisse eines typischen Pyro-Sequencing-Laufs dargestellt. Vorwärts- und Reverse-PCR-Primer sind für konservierte Regionen des DNA-Templates konzipiert, bei dem es sich um die ribosomale 16-s-Sequenz handelt.

In diesem Beispiel wird der Sequenzierungsprimer unmittelbar stromaufwärts einer gut charakterisierten hypervariablen DNA-Sequenz innerhalb des blau dargestellten Amplikons positioniert. Diese hypervariable Sequenz ermöglicht die bakterielle Identifizierung einer großen Anzahl von Bakterienarten unter Verwendung des konservierten Sequenzierungsprimers als interne Qualitätskontrolle, die DNA-Sequenz, die die variable Region umklammert, kann überprüft werden, um sicherzustellen, dass die richtige DNA-Region analysiert wurde. Die Pyro-Sequenzierungssoftware ermöglicht den Vergleich und die Ausrichtung der generierten Sequenz mit einer internen Datenbank bakterieller ribosomaler Sequenzen zur bakteriellen Identifizierung.

Darüber hinaus kann eine Sequenz analysiert werden, um Mutationen zu bestimmen, die eine Antibiotikaresistenz verleihen. Zum Beispiel zeigt die Analyse von Mutationen in den 23 s ribosomalen Genen von Helicobacter pylori zwei Mutationsmuster, GAA oder ein GA, die Antibiotikaresistenz verleihen. Die Pyro-Sequenzierung ist eine vielseitige Technik, die die mikrobielle Genomsequenzierung erleichtert.

Zu den Vorteilen der Pyrosequenzierung aus mikrobiologischen Anwendungen gehören ein schnelles und zuverlässiges Hochdurchsatz-Screening und die genaue Identifizierung von Mikroben und mikrobiellen Genommutationen. Darüber hinaus kann die Pyro-Sequenzierungsmethode die gesamte genetische Vielfalt der antimikrobiellen Arzneimittelresistenz analysieren, einschließlich der Typisierung von SNPs-Punktmutationen, Insertionen und Deletionen sowie der Quantifizierung mehrerer Genkopien, die in einigen antimikrobiellen Resistenzmustern auftreten können. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben, und viel Glück bei Ihren Sequenzierungsexperimenten.