Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Momentaufnahmen der Stoffwechselprofile verschiedener Gruppen biologischer Proben zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem eine flüssige, flüssige Extraktion verwendet wird, um organische und polare Moleküle zu trennen. In einem zweiten Schritt werden die Moleküle durch Flüssigkeitschromatographie weiter getrennt und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert, die Daten zur Retentionszeit, zum Verhältnis von Masse zu Ladung und zur Intensität für die weitere Analyse liefert.

Die nächsten Flüssigkeitschromatographie-Läufe werden ausgerichtet und Merkmale erkannt, quantifiziert und sortiert. Um unterschiedlich häufige Merkmale zwischen Gruppen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen die Unterschiede in den Merkmalen zwischen den Behandlungsbedingungen, basierend auf der unterschiedlichen Häufigkeit von Analyten, wie sie durch Flüssigchromatographie und hochauflösende Massenspektrometrie nachgewiesen wurden.

Obwohl diese Methode zur Untersuchung des Zellstoffwechsels verwendet werden kann, kann sie auch Einblicke in die Entdeckung von Biomarkern oder den biotischen Stoffwechsel von Zeno-Biotikern geben. Für adhärente Linien geben Sie 1,5 Milliliter Medium in einer 10 Zentimeter großen Platte zu den Zellen. Legen Sie die Platte auf Eis und kratzen Sie vorsichtig ab, um die Zellen anzuheben.

Übertragen Sie die 1,5 Milliliter der angehobenen Zellsuspension in ein vorbeschriftetes 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen. Geben Sie anschließend sechs Milliliter zwei bis eins Chloroform-Methanol in jedes der 10-Milliliter-Glasröhrchen mit den Proben. Schütteln Sie die Proben 30 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit Nach dem Schütteln zentrifugieren Sie die Proben mit einer niedrigen Beschleunigungsverzögerungseinstellung bei 1.935 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Phasen mit einer Weidepipette mit langem Stiel vollständig zu trennen.

Übertragen Sie die organische Schicht auf ein neues, vormarkiertes 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Glas. Übertragen Sie anschließend die wässrige Schicht in ein sauberes Einor-Röhrchen aus Kunststoff mit zwei Millilitern. Verdampfen Sie zu diesem Zeitpunkt die organischen und wässrigen Proben unter Stickstoffgas.

Rekonstituieren Sie die getrockneten Proben in 50 bis 100 Mikrolitern der Ausgangslösung für die gewünschte UPLC-Methode. Pipettieren Sie die Probe vorsichtig auf und ab, um das Auflösen der Analyten zu erleichtern. Füllen Sie dann jede Probe in einen 0,22-Mikron-Nylonschlauchfilter und drehen Sie sie etwa fünf Minuten lang auf das 14.000-fache G, bis die Probe den Filter vollständig durchlaufen hat.

Untersuchen Sie die Probe, um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Ausfällungen in der Probe verbleiben. Den Überstand der filtrierten Probe in ein vorbeschriftetes UPLC-Fläschchen mit Einsatzkappe des Fläschchens überführen. Schnippen Sie dann darüber, um Blasen vom Boden des Probenfläschchens zu entfernen.

Geben Sie die Probe in den gekühlten Autos-Probenehmer. Erstellen Sie nun einen Lauf für die organische Probe mit der Steuerungssoftware für den Flüssigkeitschromatographen. Erstellen Sie anschließend einen Lauf für die organische Probe basierend auf den optimierten UPLC-Bedingungen.

Verwenden Sie die optimierten UPLC-Bedingungen, um auch eine Methode für die wässrige Phase zu erstellen. Wenn ein bekannter Satz von Zielanalyten von hohem Interesse ist, optimieren Sie die UPLC-Bedingungen mit dem stark markierten Analogon dieser Verbindungen und generieren Sie eine Methode. Unter diesen Bedingungen kann sich der UPLC angemessen ausgleichen.

Dies sollte eine vollständige Ansaugung der Lösungsmittel beinhalten. Bevor Sie eine Säule anbringen und die Anweisungen des Herstellers für das Äquilibrierungsvolumen einer neuen Säule befolgen, führen Sie ein Protokoll über den Startgegendruck, um zukünftige Probleme mit der Steuerungssoftware für das hochauflösende Massenspektrometer diagnostizieren zu können. Erstellen Sie eine Methode im positiven Modus. Erstellen Sie dann unter den gleichen Bedingungen eine Methode im negativen Modus.

Reinigen und kalibrieren Sie das Instrument. Etablieren Sie ein stabiles Spray in das Spektrometer und lassen Sie der Kalibrierlösung Zeit, sich ausreichend von der Quelle und der Optik abzuleiten. Eine akzeptable Stabilität des Sprays sollte eine relative Standardabweichung der Intensität von drei bis 5 % über mindestens 100 Scans mit Injektion von Kalibrierlösung bei der gleichen Flussrate wie bei der verwendeten LC-Methode ergeben.

Durch die Verwendung eines Zufallszahlengenerators und eines Schlüssels wurden Stichproben nach dem Zufallsprinzip erstellt, um Batch-Effekte zu vermeiden, die durch die Analyse verursacht werden. Richten Sie die Sequenz für alle Samples ein. Stellen Sie das geeignete Injektionsvolumen ein und führen Sie vor der ersten Probe einen Blindwert durch.

Wenn der Verdacht auf Verschleppungs- oder Matrixeffekte zwischen den Proben besteht, führen Sie geeignete Blind- oder Waschvorgänge durch, beginnen Sie mit der Sequenz und überwachen Sie sie regelmäßig auf Probleme wie Druckschwankungen oder Verlust der Signalintensität während des Laufs. Wenn schwerwiegende Probleme festgestellt werden, stoppen Sie den Lauf. Reinigen und kalibrieren Sie das Instrument.

Etablieren Sie ein stabiles Spray in das Spektrometer und lassen Sie der Kalibrierlösung Zeit, sich ausreichend von der Quelle und der Optik abzuleiten. Bevor Sie mit der Differenzialanalyse beginnen, überprüfen Sie manuell die Gesamtionenströme oder sehen Sie sich gefilterte Chromatogramme für bekannte Verbindungen in der Probe an. Um die Reproduzierbarkeit der Läufe und die Stabilität des UPLC-Slash-Sprays in allen Proben zu gewährleisten, übertragen Sie die RAW-Datendateien vom Massenspektrometer auf die Festplatte der Workstation, auf der das Sieb installiert ist.

Offenes Sieb. Starten Sie ein neues Experiment, und laden Sie die entsprechenden Dateien in das Sieb. Weisen Sie Vergleichsgruppen zu und wählen Sie eine einzelne Referenzdatei aus, damit SIE V die Parameter für die Analyse generieren kann.

Befolgen Sie die Anweisungen und passen Sie alle Parameter an die Anforderungen eines einzelnen Experiments an. Laden Sie die korrekte Adduktliste für den positiven oder negativen Modus in die Parameter. Überprüfen Sie nach Abschluss der Analyse, ob eine Liste von Frames auf dem Bildschirm angezeigt wurde.

Stellen Sie sicher, dass die lc-Ausrichtung alle Orientierungspunkte überlagert. Wenn einer der nicht ausgerichteten lc-Läufe eine große Abweichung bei den Landmark-Peaks aufweist. Dies kann auf ein Problem mit der Probe hinweisen.

Plotten Sie die Daten nach Variationskoeffizient innerhalb einer ähnlichen Stichprobenpopulation. Sortieren Sie die Liste nach den gewünschten Eigenschaften. Untersuchen Sie als Nächstes jeden Peak auf eine geeignete Peakausrichtung in den Gruppen.

Peakintegration, Gauß, Signalintensität der Peakform, Isotope und Adduktzuordnung. Exportieren Sie die Daten nach Belieben für die weitere Analyse oder zur Generierung gezielter Massenlisten für die Bestätigung und MS bis zum Ende von Experimenten. Eine große Anzahl von Treffern wurde von den beiden Programmen identifiziert, die für differentiell verwendet wurden. Grüne Punkte sind Merkmale, die in der Kontrolle häufiger vorkommen, während rote Punkte in der Behandlung häufiger vorkommen.

Eine größere Punktgröße zeigt eine größere Größe der Faltenänderung zwischen den Gruppen an, und die Intensität der Farbe zeigt einen abnehmenden P-Wert mit zunehmender Sättigung der abgebildeten Farbe. Hier sind die Chromatogramme, die den positiven Ionenmodus der organischen Phase zeigen: UPLC MS-Analysefenster A zeigt den Gesamtionenstrom von S Civ 2.0. Das extrahierte Ionenchromatogramm für das Merkmal, das von XCMS als D-Bereich identifiziert wurde, wird in Fenster B angezeigt. Fenster C zeigt das extrahierte Ionenchromatogramm für das Merkmal, das als Rot identifiziert wurde, das von sve bekannt ist.

Fenster D zeigt das extrahierte Ionenchromatogramm für das als Rot identifizierte Merkmal, das von sve auf den Gesamtionenstrom normiert wurde. Ein differentiell häufiges Merkmal, das in der bekannten behandelten Gruppe reduziert war, wurde durch eine genaue Massendatenbanksuche vorläufig als d panadin identifiziert. Die Identität des Analyten wurde mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie U-P-L-C-H-R bestätigt.

Hier ist ein Vergleich der Chromatogramme und Massenspektren der Probe und der reinen Verbindung zu sehen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und dass geeignete Vorsichtsmaßnahmen wie ein gut belüfteter Abzug befolgt werden sollten.