Name: Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie, wie ungerichtetes Metabolomics biologische Proben mit Flüssig-Flüssig-Extraktion und UPLC-HRMS analysiert. Diese Methode ermöglicht umfassende metabolische Profile für Forschung und Biomarker-Entdeckung.

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Wir danken für die Unterstützung der NIH Zuschüsse P30ES013508 und 5T32GM008076. Wir danken auch Thermo Scientific für den Zugang zu SIEVE 2.0 und Drs. Eugene Ciccimaro und Mark Sanders von Thermo Scientific für hilfreiche Diskussionen.

1. Beispiel Extraktion aus Zellen <ol><li> Für eine 10 cm Platte von Zellen: collect 1,5 ml angehoben Zellsuspension in Medien in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Für Anhänger Linien sollten die Zellen mit sanften Schaben in 1,5 ml Medium auf Eis gehalten angehoben werden. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt. Kommentar: Abschrecken des Zellstoffwechsels ist entscheidend für bestimmte Metaboliten. Für die Analyse von Zeit-und Kleinschreibung Metaboliten sollten Verfahren wie kalte Methanolextraktion Betracht gezogen werden. 17 </li><li> 6 ml Chloroform (CHCl 3) / Methanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) zu jedem der 10 ml Glasröhrchen mit den Proben. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. Nach dem Schütteln werden die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, um die Phasen vollständig zu trennen. Wahlfrei </em&gt;: Um zu vermeiden, unter Verwendung von CHCl 3, Extraktionen mit Dichlormethan durchgeführt werden (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. Weiter zu 2.6.2 für wässrige Phase Entsalzung oder weiter auf 4,1 für die direkte Analyse. </li></ol> 2. Beispiel Extraktion aus Serum <ol><li> Übertragen Sie 20 ul Serum in einem Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt. </li><li> In 190 ul CH 3 OH und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In 380 ul CHCl 3 und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In 120 ul H 2 O, um eine Phasentrennung zu induzieren. Vortex die Proben für 10 sec und damit bei RT für 10 äquilibrierenmin. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 8000 g für 10 min bei 4 ° C, um die Phasen zu trennen. </li><li> Übertragen Sie die untere organische Phase in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. </li><li> Re-suspend die Probe in 200 ul H 2 O. Säure oder Base Reagenzien (0,1% Essigsäure, Ameisensäure oder 0,1% Ammoniumhydroxid) verwendet werden, um bevorzugt extrahieren pH-empfindliche Metaboliten werden. Ultraschallbad für 20 min auf Eis, um erneut zu suspendieren die Probe vollständig. </li><li> Aktivieren Sie die C18-Spin-Säulen mit 500 ul CH 3 OH. </li><li> Equilibrieren die Spin-Säule mit zwei Waschungen von 500 ul H 2 O und laden Sie dann die Probe. Wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. </li><li> Waschen mit 500 ul H 2 O, um die Probe zu entsalzen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in der WäscheSchritte. </li><li> Eluieren mit zwei Volumen von 200 ul 80% CH 3 OH in H 2 O in ein beschriftetes sauberes 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. Weiter zum 4.1. </li></ol> 3. Beispiel Extraktion aus Gewebe <ol><li> Je nach Gewebe zwischen 10-100 mg von gefrorenem Gewebe verwenden. Fügen Sie das ganze Stück Gewebe zu einer pre-markierten 2 ml low retention Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) in einem Eisbad. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie es in den Puffer, bevor das Gewebe. </li><li> Homogenisieren des Gewebes im Eis mit einer elektrischen Schleifmaschine Gewebe für 30 sec in jedem Eppendorf. Zwischen Proben, reinigen das Gewebe Mühle in zwei getrennten Röhren mit CH 3 OH und H 2 O auf. </li><li> Übertragen Sie die Gewebehomogenat mit einer Kunststoff-Pipette in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Nach der Übertragung, spülen jedes Eppendorf-Röhrchen2x mit 1 ml CH 3 OH und fügen Sie die Waschungen der Gewebehomogenat in den Glasröhren. </li><li> 4 ml CHCl 3 zu jeder der 10 ml-Röhrchen, die das Gewebe-Homogenat und CH 3 OH wäscht. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. </li><li> Nach dem Schütteln, zentrifugieren Sie die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min vollständig zu trennen die Phasen Optional:. Um zu vermeiden, mit Chloroform, haben Extraktion mit CH 2 Cl 2 entwickelt worden. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1. </li><li> Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die wässrige Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Gehe zu 2.6.2 für Entsalzung oder weiter auf 4,1. </li></ol> 4. Re-Suspension und Filtration von Proben für UPLC <ol><li> Man dampft das samples unter Stickstoffgas. </li><li> Den Inhalt herabgetrocknetes Proben in einem geeigneten Volumen der Ausgangslösung für die gewünschte UPLC Methode (siehe Tabelle 1). 50-100 ul ist in der Regel eine wünschenswerte Resuspension Volumen. Vortexen und / oder einer Pipette die Probe nach oben und unten, um das Lösen der Analyten zu unterstützen. </li><li> Übertragen Sie die Probe in einen 0,22 um Nylon-Rohr-Filter und drehen sich mit bis zu 14.000 xg, bis die Probe vollständig durch den Filter (ca. 5 Min.) geleitet. Stellen Sie sicher, dass es keine sichtbare Partikel in der Probe verbleibt. </li><li> Den Überstand des gefilterten Probe in ein beschriftetes UPLC Fläschchen mit Einsatz. Cap Fläschchen, dann streichen Sie das Fläschchen, um alle Blasen aus dem Boden der Probe Fläschchen entfernen. Legen Sie die Probe in der gekühlten Autosampler (4-5 ° C). </li></ol> 5. UPLC-Setup <ol><li> Mit der Steuer-Software für die Flüssigkeitschromatographen, erstellen Sie einen Lauf für die organischen Probe aus der genannten Bedingungen in der Basis <strong&gt; Tabelle 1. Dann erstellen Sie eine Methode für die wässrige Phase aus den in Tabelle 1 aufgelistet. Optional: Wenn ein bekannter Satz von Analyten von großem Interesse sind, optimieren die UPLC Bedingungen mit den schweren markiertes Analogon dieser Verbindungen und erzeugen ein Verfahren unter Verwendung dieser Bedingungen . </li><li> Lassen Sie die UPLC angemessen auszugleichen. Dies sollte eine vollständige Grundierung von Lösungsmitteln, bevor Sie eine Spalte, und nach den Anweisungen des Herstellers für die Äquilibrierung Volumen von einer neuen Spalte (in der Regel 3-5 Säulenvolumen) umfassen. Pflegen Sie ein Protokoll ab Rückdrücke zur Diagnose zukünftige Probleme. </li></ol> 6. Massenspektrometer-Setup <ol><li> Mit der Steuersoftware für den hochauflösenden Massenspektrometer, erstellen Sie eine positive Mode-Verfahren unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführt. Dann unter den gleichen Bedingungen, einen negativen Modus Verfahren Optional:. Wenn ein bekannter Satz von Analyten sind von hoher intERest, zu optimieren und eine Optik, mit der schweren Bedingungen markiertes Analogon dieser Verbindungen enthält, und eine Methode unter Verwendung dieser Bedingungen. </li><li> Reinigen und kalibrieren Sie das Gerät, eine stabile Spray in das Spektrometer und genügend Zeit für die Kalibrierung Lösung angemessen von der Quelle und Optik abzuleiten. Akzeptabel Stabilität der Spray sollte eine 3-5% der Intensität über mindestens 100 Scans RSD mit Einspritzung der Kalibrierlösung zur gleichen Durchfluss wie die LC-Methode verwendet wird. </li><li> Richten Sie die Sequenz für alle Proben, setzen entsprechende Injektionsvolumen, und führen Sie eine leere vor der ersten Probe. Wenn Verschleppung oder Matrix-Effekte zwischen den Proben vermutet werden, laufen angemessene Rohlinge / Wäschen. Die Proben sollten Einrichtung in einer randomisierten Weise unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators und eine Taste, um die Charge durch die Analyse eingeführt Wirkungen zu vermeiden. Kommentar: Qualitätskontrolle Proben einschließlich stabiler Isotope Normen oder Analysestandards wahrscheinliche Ziele können seinäußerst wertvoll bei der Fehlersuche und Sicherung zuverlässige, reproduzierbare und valide Ergebnisse. Ein technisches Replikat eines Standard nur Probe durch eine Blindlösung gefolgt kann verwendet werden, um Zugriff auf Abweichung von Signalintensität und Verweildauer sowie Verschleppung in die leere run werden. </li><li> Start-Sequenz und überwachen regelmäßig für Probleme wie Druckschwankungen oder Verlust der Signalstärke in der Flucht. Wenn eine schwere Probleme erkannt werden, stoppen den Lauf, und wiederholen von 6,2. </li></ol> 7. Differential Analysis <ol><li> Zwei Workflows werden für dieses Protokoll vorgestellt. Die erste ist durch SIEVE 2.0, proprietäre markierungsfreie Differential-Analyse-Software von Thermo Fisher verkauft. Der zweite Workflow ist durch XCMS Online, eine kostenlose Plattform durch Scripps Research Institute. 11. Vor Beginn Differentialanalyse, manuell überprüfen die Tics oder schauen gefiltert Chromatogramme für jede bekannte Verbindung in der Probe, um die Reproduzierbarkeit der Läufe zu gewährleistenund Einspritzung / UPLC / Aerosol Stabilität in allen Proben. </li><li> SIEVE <ol><li> Übertragen Sie die. Rohdaten aus dem Massenspektrometer auf die Festplatte der Workstation, SIEVE installiert ist. (Anmerkung: Laufen Sieb mit Daten auf einem vernetzten oder USB-Port angeschlossen Laufwerk gespeichert ist nicht ratsam, da sie die Geschwindigkeit der Analyse können zu begrenzen.) </li><li> Offene SIEVE, und beginnen ein neues Experiment. </li><li> Legen Sie die entsprechenden Dateien in SIEVE. </li><li> Weisen Vergleichsgruppen und wählen Sie eine einzelne Referenz-Datei, damit SIEVE, um die Parameter für die Analyse zu generieren. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen und stellen Sie alle Parameter pro Anforderungen jedes einzelnen Experiments. Oft ist es ratsam, mit strengen Parametern zu starten und dann gehen Sie zurück und lösen Sie die Parameter als großzügiger Einstellungen Analyse Zeit verlängern kann. </li><li> Legen Sie das richtige Addukt Liste für positive oder negative Modus in den Parametern. </li></ol></li><li> XCMS Online <ol><li> Konvertieren von Dateienin einem akzeptablen Format für XCMS Online. In unserem Fall, wandeln wir mzXML Format. 19 </li><li> Offene XCMS Online und E-Mail Job. </li><li> Upload und nennen Datensätzen. Nur zwei Datensätze (zB Steuerung vs Behandlung) können als Stand-alone-XCMS wird Kopf-an-Kopf-Vergleiche beschränkt hochgeladen werden. </li><li> Wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus der Dropdown-Liste. Pre-besiedelte Parameter sind für verschiedene Instrumente Setups zur Verfügung, und diese können weiter für experimentelle Bedürfnisse modifiziert werden. In unserem Fall nutzen wir die HPLC-Orbi2 Einstellungen. </li><li> Senden und bestätigen Job. </li></ol></li><li> Data Analysis <ol><li> Für SIEVE und XCMS eine Liste der Rahmen und Ausstattung, bzw. aufgefüllt wird, sobald die Analyse abgeschlossen sein. Stellen Sie sicher, dass die LC Ausrichtung keine Wahrzeichen Peaks überlagert. Wenn eine der unaligned LC läuft große Abweichung zeigen in Wahrzeichen Gipfel kann dies auf ein Problem mit der Probe. Optional: Für SIEVE, wenn interne Standards verwendet werden, findendie entsprechende Peakgruppe und zu normalisieren, um die ausgewählte Fassung. Für XCMS On-line können Normalisierung in einer Tabellenkalkulation nach der Ausfuhr durchgeführt werden. </li><li> Zeichnen Sie die Daten, die von der Variationskoeffizient (CV) innerhalb einer Probe wie Bevölkerung (zB Kontrollproben). Alle großen CV-Werte kann auf ein Problem mit einem oder mehreren Probe. Sortieren Sie die Liste auf die gewünschten Eigenschaften (z. B. p-Wert &lt;0,05, Fold Change&gt; 1.5, niedrige Standardabweichung innerhalb einer Gruppe, etc.) basiert. </li><li> Untersuchen Sie jeden Peak für Peak entsprechende Ausrichtung über Gruppen, Peak-Integration, Gauß-Peak-Form, Signalintensität, Isotope und Addukt Zuordnung. </li><li> Exportieren von Daten als für die weitere Analyse gewünscht oder gezielt Masse Listen zur Bestätigung und MS n Experimente zu generieren. </li></ol></li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Untargeted metabolomics bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endogenen oder xenobiotischen Biotransformationen, oder die Erfassung eines metabolischen Profils aus einer Probe von Interesse. Der Ausgang der Technik skaliert mit der Auflösung und Empfindlichkeit der verwendeten Technologie zu trennen und analysieren die Probe, die Fähigkeit, mit der große Datenmengen erzeugt umzugehen, und die Fähigkeit, um die Datenmenge für nützliche Informationen (zB genaue Masse Datenbanksuche) abzuba...

Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte auf dem Gebiet der HRMS haben ungezielte, Hypothesen-Generierung metabolomics Ansätze werden eine praktikable Ansatz zur Analyse von komplexen Proben. 1-Massenspektrometer zur Auflösung 100.000 erleichtert Routine niedrigen Teil pro Million (ppm) Massegenauigkeit haben sich weitgehend von verschiedenen Herstellern. 2,3 Diese Masse Genauigkeit ermöglicht eine größere Spezifität und Vertrauen in eine vorläufige Zuordnung der Analyten Identität Isotopen Mustererkennung und Addukt Identifikation. 4 Wenn mit einem geeigneten Extraktionsverfahren und High-Performance-LC oder UPLC, komplexe Mischungen gekoppelt kann mit zusätzlichen Spezifität von Verweilzeit Daten abgeleitet analysiert werden. 5 UPLC besitzt größere chromatographische Effizienz und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit, Auflösung und Analyse Zeit macht eine größere Abdeckung des Metaboloms möglich. 6 Die entstehenden großen Datenmengen können in einem integriert werdenmehrerer Differential-Analyse-Software und abgebaut für brauchbare Muster oder einzelne Analyten von Interesse. 7,8,9,10,11 Putative Treffern zunächst identifiziert werden mit einer Kombination aus Spitze Algorithmen, genaue Masse basierte chemische Formel Vorhersage, Fragmentierung Vorhersage und chemische Datenbank suchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Priorisierung von Zielen für zeitaufwändige vollständige strukturelle Identifizierung oder für die Entwicklung von empfindlicher und präziser Isotopenverdünnungsanalyse UPLC / ausgewählte oder multiple reaction monitoring / MS-Studien, dass die derzeitige Goldstandard Methoden zur Quantifizierung sind. 12 Die unterschiedliche Art von biologischen Proben ist die Optimierung der Extraktion Protokolle für Urin 13 Zellen 14, 15 Serum oder Gewebe 16 geführt. Dieses Protokoll bietet Extraktionen für Zellen, Serum und Gewebe. Gegebenenfalls haben Kommentare und weitere Referenzen für Modifikationen einbezogengen des Verfahrens zur Bewältigung Einbeziehung von stabilen Isotopen, oder für die Aufnahme von besonders instabilen Metaboliten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Acetonitril (CH3CN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Methanol (CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Chloroform (CH3Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>Hazard</td></tr><tr><td>Dichlormethan (CH2Cl2)</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>Als Ersatz für Chloroform</td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td>Zum Ersatz von Chloroform-Ameisensäure</td></tr><tr><td>(FA)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(optima)</td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Ammoniumformiat (HCOONH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78314</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin C18 Säulen</td><td>Nest Group Inc</td><td>SS18V</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Zentrifugenröhrchen aus Glas</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>aus Kunststoff CellTreat</td><td>CLS-4301-015</td><td></td></tr><tr><td>LC Fläschchen (Glas)</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LC Einsätze (Glas)</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr><tr><td>LC Fläschchen (Kunststoff)</td><td>Wasser</td><td></td><td></td>186002640</tr><tr><td>0,22 μm m Filters</td><td>Corning</td><td>8169</td><td>nylon</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td>Low Retention</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>High Resolution Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL-Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/UPLC</td><td>Wasser</td><td>nanoACQUITY UPLC</td><td></td></tr><tr><td>Quelle</td><td>Michrom</td><td>Thermo Thermo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>SIEVE 2.0</td><td></td></tr><tr><td>nanoACQUITY C18 BEH130</td><td>Wasser</td><td>186003546</td><td>1,7 &mu; M Partikelgröße, 150 mm x 100 &mu; m</td></tr><tr><td>Acentis Express C8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54262</td><td>2.7 &mu; M Korngröße, 15 cm x 200 &mu; m</td></tr></tbody></table>

untargeted metabolomics aus biologischen quellen mit ultraperformance flüssigkeits-chromatographie-hochauflösender massenspektrometrie (uplc-hrms)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Hier präsentieren wir einen Workflow, um die metabolische Profile für biologische Proben des Interesses einschließlich analysieren; Zellen, Serum oder Gewebe. Die Probe wird zunächst in polaren und nicht-polaren Fraktionen durch eine Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt und teilweise gereinigt, um stromabwärts Analyse zu erleichtern. Sowohl wässrige (polare Metaboliten) und organischen (nicht-polaren Metaboliten) Phasen der ersten Extraktion verarbeitet werden, um eine breite Palette von Metaboliten zu überblicken. Stoffwechselprodukte werden von verschiedenen Flüssigkeits-Chromatographie-Methoden auf ihre Eigenschaften Partition Basis getrennt. Bei diesem Verfahren stellen wir Mikroströmungsfühler ultra-Leistung (UP) LC-Methoden, aber das Protokoll ist skalierbar, um höhere Ströme und niedrigere Drücke. Einführung in das Massenspektrometer kann entweder durch allgemeine oder Verbindung optimierte Quelle Bedingungen. Erkennung von einem breiten Spektrum von Ionen erfolgt im Full-Scan-Modus in positive und negative Modus durchgeführt über einen breiten m / z-Bereich mit hoher Auflösung auf einem kürzlich calibrated Instrument. Markierungsfreie Differentialanalyse wird auf Bioinformatik-Plattformen durchgeführt. Anwendungen dieses Ansatzes umfassen Stoffwechselweg Screening zur Entdeckung von Biomarkern und Entwicklung von Arzneimitteln.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ausgewählte Daten aus einer 6-stündigen Behandlung von SH-SY5Y Glioblastom-Zellen mit dem Pestizid und mitochondrialer Komplex I-Inhibitor Rotenon. Der Kürze halber werden nur die organische Phase positive Mode-Daten dargestellt. Die Proben wurden aufgearbeitet und analysiert, wie oben beschrieben (Abbildung 1, Tabelle 1, Tabelle 2) geladen und auf zwei Differentialanalyse Plattformen für Label-freie Quantifizierung SIEVE und XCMS online. Obwohl eine große Anzahl von ...

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Momentaufnahmen der metabolischen Profile verschiedener Gruppen biologischer Proben zu vergleichen. Dies wird durch eine Flüssig-Flüssig-Extraktion erreicht, mit der organische und polare Moleküle getrennt werden. In einem zweiten Schritt werden die Moleküle anschließend mittels Flüssigkeitschromatographie weiter aufgetrennt und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert, wodurch Retentionszeit, Masse-zu-Ladung-Verhältnis sowie Intensitätsdaten für die weitere Auswertung bereitgestellt werden.Im Anschluss werden die Flüssigkeitschromatographieläufe ausgerichtet, und die Merkmale werden erfasst, quantifiziert und sortiert, um unterschiedlich stark vorhandene Merkmale zwischen Gruppen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen die Unterschiede in den Merkmalen über verschiedene Behandlungsbedingungen hinweg basierend auf der differenziellen Abundanz von Analyten, wie sie mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie mit hoher Auflösung erfasst wurden.Obwohl diese Methode zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels verwendet werden kann, ermöglicht sie auch Einblicke in die Biomarker-Entdeckung o

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Chemistry

Chemie

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels.  In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Ein Protokoll zur umfassenden Extraktion von Lipiden, Metaboliten und Proteinen aus biologischen Geweben mit einer Probe wird vorgestellt.

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten Chromatographie-Massenspektrometrie-Methode nachzuweisen.

Semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrie Analyse von phenolischen Metaboliten im Plasma älterer Erwachsener

Wir haben einen ungezielten metabolomischen Workflow entwickelt, der XY-Meta und metaX zusammen integriert. In diesem Protokoll zeigten wir, wie XY-Meta verwendet werden kann, um eine Lockvogel-Spektralbibliothek aus der Open-Access-Spektrenreferenz zu generieren, und führten dann eine FDR-Kontrolle durch und verwendeten das metaX, um die Metaboliten nach der Identifizierung der Metabolomik-Spektren zu quantifizieren.

Ein integrierter Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung von FDR-Kontroll-basierten, ungezielten Metabolomen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Erfahren Sie, wie ungerichtetes Metabolomics biologische Proben mit Flüssig-Flüssig-Extraktion und UPLC-HRMS analysiert. Diese Methode ermöglicht umfassende metabolische Profile für Forschung und Biomarker-Entdeckung.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS) (Video) | JoVE Journal

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

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