Name: Tissue Engineering eines Menschen 3D In-vitro- Tumor-Testsystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von 3D-Tumorgeweben mit primären menschlichen Zellen auf dezellularisierten BioVaSc-Gerüsten unter statischen und dynamischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht realistischere In-vivo-Tumormodelle.

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Die Autoren bedanken sich bei Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) für seine technische Unterstützung danken zu Bioreaktoren und den Bioreaktor Inkubator entwickeln.

1. Dezellularisierung der BioVaSc <ol><li> Spülen Sie das Gefäßsystem des Schweine Jejunalsegment via Kanüle arteriellen Zugang und Darmlumen mit PBS -. Wiederholen, bis es ganz sauber ist. </li><li> Bereiten Sie eine 200 mm Durchmesser Glasbehälter mit 4 Adaptern und verbinden sie über Silikonschläuche an den Schlauchpumpe (Ismatec). Die Drucksteuereinheit kann über einen Drucksensor, der in ein steriles Einweghaube (siehe Fig. 1) verbunden ist, überwacht werden. </li><li> Füllen Vorratsflaschen mit Dezellularisierung (DZ) Lösung und überprüfen Sie die Schlauchsystem für mögliche Luftblasen. </li><li> Schließen Sie die Darmlumen mit Kabelbindern an den Glas Anschlüsse für Lumenfluss. Pumpe 500 ml DZ Lösung in die roten arteriellen Zugang (1B) des Gefäßsystems. Unterbrechen Sie den Pumpvorgang alle 15 Minuten kurz manuell drücken Sie die gesamte Darmlumen. </li><li> Während der decellularizati100 mm Hg, nach dem natürlichen Vorbild Blutdruck - auf Verfahren, sollte der Druck der Pufferlösung zwischen 80 sein. </li><li> Waschen Sie die BioVaSc mit PBS - bis es frei ist von Zellreste (&quot;ganz weiß&quot;). </li><li> Füllen Sie den BioVaSc vollständig mit der DZ-Lösung und Inkubation in DZ Lösung tauchen über Nacht bei 4 ° C auf Schüttler. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.6. </li><li> Legen Sie die BioVaSc in DNase-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf Schüttler. </li><li> DNase-Lösung entfernen und spülen mit Waschpuffer. </li><li> γ-Sterilisation mit 25 kGy </li></ol> 2. Die verschiedenen Zelltypen 2.1 Isolation von primären humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (MVECs) und Fibroblasten <ol><li> Schneiden Hautbiopsie (vorzugsweise preputium) in Streifen von 2 - 3 mm Breite mit Skalpell und spülen Sie sie mit PBS 3x - Lösung. </li><li> Decken Sie das Gewebe mit Dispase-Lösung, Inkubation es für 16-18 h bei 4 ° C. </li><li> Separate Epidermis von der Dermis mit 2 Pinzetten und übertragen sowohl getrennt in Petrischalen mit PBS + gefüllt. </li><li> Rinse Dermis Streifen 1x mit Versene. </li><li> 10 ml Trypsin / EDTA-Lösung in die Dermis Streifen und bebrüten es im Brutschrank für 40 min. </li><li> Stoppen Sie die Enzymreaktion sofort mit 1% FCS. </li><li> Übertragen Hautstreifen in eine Petrischale mit VascuLife gefüllt und auskratzen jeden Streifen mit dem Skalpell 8x jeder Seite, mit ein wenig Druck. </li><li> Übertragen des hergestellten Zellsuspension über eine Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen und spülen Zellsieb 3x mit VascuLife. </li><li> Zentrifugieren bei 1.200 xg für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets mit VascuLife. </li><li> Um die Fibroblasten zu isolieren, Streifen hacken Dermis in kleine Stücke mit dem Skalpell. </li><li> 10 ml Kollagenase-Lösung zur Lederstücke. </li><li> Inkubieren Sie es für 45 Minuten in den Inkubator, dann zentrifugiert und es vorsichtig supernatant. </li><li> Waschen Pellet 1x mit DMEM + 10% FCS +% PenStrep, Zentrifuge und es vorsichtig Stand. </li><li> Das Pellet in Kulturmedium und überträgt es auf einer T75 Kulturflasche, damit Zellen aus dem Gewebe zu wachsen. </li></ol> 2.2 Tumorzelllinie S462 Die Tumorzelllinie S462 (freundlicherweise von Dr. Nikola Holtkamp, ​​Charité Universitätsmedizin Berlin zur Verfügung gestellt) wurde aus einer malignen peripheren Nervenscheidentumor eines weiblichen Patienten mit der erblichen Veranlagung Tumor-Syndrom Neurofibromatose Typ 1 9 erzeugt. S462 werden in DMEM mit 10% FCS kultiviert. Medium muss alle 2 geändert werden - 3 Werktagen. Einmal in der Woche müssen die Zellen aufgeteilt werden. 3. Tumor-Testsystem: Statische Kulturbedingungen im Vergleich mit Dynamic Kultur Im Bioreaktor-Systeme <ol><li> Schneiden Sie die Rohr SIS-Muc öffnen auf der einen Seite und befestigen Sie es zwischen zwei Metallringe (Zell Kronen, 10 mm Durchmesser, selbst constructed). Decken Sie die SIS-Muc in Zellkulturmedium über Nacht. </li><li> Seed isolierte Zellen in definierten Zellzahlen (siehe unten) auf einer oder beiden Seiten des SIS (mono-oder Co-Kultur-Set-up). <ol><li> Samen 8.000 Zellen / cm 2 Primär MVECs in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l auf der basolateralen Oberfläche der SIS (früher Serosa). 3 Stunden später die gut mit Medium füllen, um eine Kultur eingetaucht zu gewährleisten. </li><li> Ermöglichen Endothelzellen für 3 Tage haften. Klappen Sie den statischen Kultursystem um 180 ° und übertragen sie auf eine 12-Well-Platte. </li><li> Samen eine Mischung von primären Hautfibroblasten (8.000 Zellen / cm 2) und Tumorzellen (15.000 Zellen / cm 2) in einem Gesamtvolumen von 500 &amp;mgr; l auf der apikalen Oberfläche des SIS (die Seite des ehemaligen Lumen). </li><li> Lassen Zellen für 3 Stunden halten und füllen die gut mit Medium (Kultur eingetaucht, mittel: 50% Vasculife + 50% DMEM mit 10% FCS). </li><li> Der Tumor-Testsystem wird unter statischen Bedingungen kultiviert eint 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für weitere 14 Tage. Ändern Kulturmedium alle 2 - 3 Tage. </li></ol></li><li> Für die dynamische Kultur, fixieren Sie die SIS-Muc zwischen zwei Metallringe und Saatgut Primär MVECs wie in 3.2.1 beschrieben. Nach 3 Tagen entfernen Sie die SIS-Muc von den Metallringen und legen Sie die Membran in den Strömungsreaktor (siehe 2C und 2D). Anwenden der primären Hautfibroblasten und Tumorzellen mit einer Spritze und Kanüle auf die Matrix im Bioreaktor und damit die Zellen für 3 h halten vor dem Füllen des Bioreaktorsystems mit Kulturmedium. </li><li> Am folgenden Tag dynamischen Kulturbedingungen mit konstanter Mediumstrom (3,8 ml / min, 37 ° C und 5% CO 2) eingeleitet werden. Die dynamische Kultur wird 14 Tage gehalten wird Kulturmedium nach 7 Tagen gewechselt. </li><li> Der dynamische Test-Setup ist in einer selbstgebauten Inkubator, Medienfluss bietet durch eine Pumpe und die notwendige Temperatur und CO 2 kultiviert </sub&gt; Inhalt. </li></ol> 4. Charakterisierungsmethoden für die Analyse 4.1 Fixierung und Paraffineinbettung der geimpften kollagene Matrix <ol><li> Für (Immun-) histologische Charakterisierungen entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren das Gewebe mit 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie 4% Paraformaldehyd und übertragen Sie die SIS von der Metalleinsatz zu einer Einbettung von Gewebekassette. Gießen Sie das Gewebe verbleibenden Fixiermittel zu entfernen und zu entwässern für Paraffin-Infiltration. </li><li> Vor dem Einbetten in einem Paraffinblock, schneiden Sie die SIS in 2 - 3 Scheiben und legen Sie sie in einem Paraffin-gefüllte Metallsockel Form, so dass die Schnittflächen nach unten zeigen. Fügen Sie die Gewebekassette auf der Form als Unterlage. </li><li> Cut 5 um Scheiben und schweben sie auf einem 40 ° C warmen Wasserbad zum Richten, dann montieren Dias auf Glasobjektträger geeignet. Unbeschichtete Objektträger sind für H &amp; E Flecken verwendet, Polylysin-beschichtete Objektträger für immunhistologische Färbung, um die Befestigung zu verbessern.Lassen Scheiben gründlich trocknen. </li><li> Melt Paraffin, entfernen Sie sie mit Xylol und deinen Durst Scheiben für folgende Färbung. </li></ol> 4.2 Färbung <ol><li> Die rehydriert Scheiben mit Hämatoxylin / Eosin als standardisierte Übersichtsfärbung gefärbt werden. </li><li> Für immunhistologische Färbung der fixierten und in Paraffin-Gewebeschnitten infiltriert muss eine Antigen-Retrieval, damit Antikörper zu erkennen und auf ihre spezifischen Epitope binden zu unterziehen. Daher entparaffiniert und rehydratisiert Träger werden in einem Dampfkochtopf mit beheizten Citratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten platziert. </li><li> Objektträger Waschpuffer (0,5 M TBS-Puffer + 0,5% Tween) und Kreisscheiben mit einem PAP Stift um das erforderliche Volumen für Färbelösungen minimieren. </li><li> Legen Sie die Folie in einer Feuchtekammer. Um einen bestimmten Meerrettich-Peroxidase vermittelten Visualisierung der Antigen-Antikörper-Bindung zu garantieren, muss die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid gesättigt ist. </li><li> Primäre antibOdy Verdünnungen werden auf die Scheiben aufgetragen, 1 h bei RT inkubiert und mit Waschpuffer sorgfältig abgewaschen. </li><li> Zum Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung der Ultra Vision Absicherung Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) wird entsprechend der empfohlenen Protokoll verwendet. </li><li> Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin für 1 min gegengefärbt. </li><li> Objektträger werden mit einem wässrigen Medium angeordnet, getrocknet und aufgenommen mit einer inversen Mikroskop. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Beim Vergleich von 2D-und 3D-Kultursysteme in der Tumorforschung, 3D-Systemen, obwohl die teurer Ansatz, haben sich die Bedingungen in den biologischen Mikroumgebungen besser zu imitieren. Es konnte gezeigt werden, dass einige Tumorzellen wachsen in einem 3D-Kultur sehr viel langsamer als in einem gemeinsamen 2D-Kultur 12, die in Übereinstimmung mit der Situation in einer realen Tumor ist. Bissell und Mitarbeiter zeigten in ihrer Arbeit, dass das Verhalten von krebserregenden Brustzellen spiegelt die Situation in vivo, einschließlich der Zellmorphologie und-Meldung, genauer, wenn ein 3D-Kultur in einer Matrix bietet Zell-ECM-Interaktionen. Außerdem wies sie die Bedeutung der extrazellulären Umgebung in 3D durch den Nachweis, dass Änderungen in den Umweltwechsel führte zur Reversion der malignen Zellen mit einem normalen Phänotyp. Außerdem und vor allem sind diese Ergebnisse auch in in vivo Tiermodellen 10,11 bestätigt werden. NHALT &quot;&gt; Der direkte Vergleich der in vivo-Tierversuchen und in vitro Gewebemodellen zeigt Vor-und Nachteile beider Systeme. Ein Vorteil der in-vitro-Modellen ist die Erlaubnis von einem viel besseren Echtzeit-oder Fest Bildgebung durch Mikroskopie. Eine Einschränkung ist, dass sie imitieren statische oder Kurzzeit-Bedingungen, während in vivo-Systemen oft die Fortschritte. Der derzeitige Mangel an Gefäßsystem und normalen Transport von kleinen Molekülen, Host-Immunantworten und andere Zell-Zell-Interaktionen sind weitere Nachteile der In-vitro-Modelle 12. Daher 3D In-vitro-Systeme, wie in dieser Studie vorge bieten eine vielversprechende Ergänzung zu Tierversuchen. Sie bieten eine bessere Vergleichbarkeit für den menschlichen Organismus und somit die Minimierung der experimentellen Fehlinterpretationen. Biomimetic in vivo Modellsystemen wird damit an Relevanz zu untersuchen, wie Krebs und Metastasierung ist abhängig auf Mikroumgebungsbedingungen, die tumorig regulierenenesis 11. Unsere Studie zeigt, dass die 3D-Umgebung durch die SIS-Muc vorgesehen führt zu einer tumorartigen Gewebebildung von Zellen, die nicht in den gängigen 2D-Zellkultur zu beobachten ist (siehe Abbildung 3A). Darüber hinaus ist die Verwendung von primären Zellen aus Tumorbiopsien abgeleitet ein sehr wichtiger Schritt in Richtung personalisierte Medizin, einer Disziplin, die bei der Ermittlung der besten Behandlung je nach individuellen Bedürfnissen des Patienten zum Ziel hat. Die Einbeziehung primären Patienten-spezifischen Tumorzellen aus Biopsiematerial isoliert werden In-vitro-Prüfung von Therapiestrategien zu ermöglichen. Solche Testsysteme machen es möglich, verschiedene Medikamente und Kombinationen davon, in einer Zeit-und kostensparende Hochdurchsatz-Screening zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Integration von Tumor-assoziierten Stromazellen wie in dieser Studie gezeigt, wichtig für den personalisierten Ansatz, da Einflüsse Mikroumgebung eines Tumors Tumorprogression 13 und könnte als geei beweisenle therapeutisches Ziel. Alternativ zu einer personalisierten Ansatz können unsere Tumor-Modell geändert werden, um als eine verallgemeinerte Tumortestsystem durch den Einbau von etablierten Zelllinien tumorigen zu dienen. Dies ist eine vielversprechende Anpassung der Grundlagenforschung Zwecke. Sowohl für Drogentests nähert sich das Vorhandensein einer Gefäßstruktur ist erforderlich, um die Verteilung und Aufnahme von therapeutischen Substanzen testen. Das SIS-Muc-Matrix ermöglicht die basolateralen Impfen mit primären MVEC für barriereAufnahmeStudien wird die Nachsaat der erhaltenen Gefäßstrukturen des BioVaSc weiteren Verbesserung der Untersuchung von Drug Delivery. Um Gewebemodelle zu erstellen, kann ein 3D-biologisch abbaubare Matrix als Rahmen für eine Co-Kultur von verschiedenen Zelltypen, 14 verwendet werden. Die Verwendung eines solchen 3D-Matrices wird oft durch das Fehlen eines funktionellen Gefäß beschränkt. Dieses Problem kann durch die Verwendung des BioVaSc, die erhaltenen Blutgefäß str bietet gelöst werdenuctures, die mit Endothelzellen reseeded werden kann. Weiterhin stellt die BioVaSc extrazellulären Komponenten, die die Adhäsion der Zellen zu gewährleisten und die Gewebedifferenzierung. Es ermöglicht auch die Langzeit-Gewebe-spezifische Funktion der 3D-Gewebe bioartifizielles 7,8,15. Voraussetzung für das Engineering von funktionellen Gefäßersatz ist die Nachahmung der menschlichen physiologischen und biomechanischen Bedingungen. Daher Bioreaktorsysteme, die diese Anforderungen in vitro umsetzen können, sind von großem Interesse für die Erstellung der biologischen Tumormodellen. Die Kombination der BioVaSc ist die Bioreaktortechnologie und Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen eine sehr vielversprechende Methode zur vaskularisierten Tumor-Gewebe, das für die Untersuchung der Tumorprogression wie Angiogenese und Metastasierung relevante Mechanismen erlauben erzeugen. Wir sehen, wie Tumormodellen als vielversprechender Ansatz zur Ergänzung von Tierstudien, die eine gleichwertigedas menschliche Tumorphysiologie.

Neue Arzneimittel müssen in Bezug auf ihre Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit vor der Zulassung überprüft werden. Bis heute sind Tierversuche die Standardmethode für Drogentests und Validierung. Jedoch aufgrund speziesspezifische Unterschiede, Tierversuche häufig nicht umfassend Bewertung der Wirkung der Verbindungen bei Menschen 1. Aus diesem Grund ist es wichtig, die menschliche Gewebemodelle, die für die in-vitro-Tests von neuen Arzneimitteln und Substanzen verwendet werden können, zu erzeugen. Einer der Schwerpunkte unserer Gruppe ist die Schaffung von in-vitro-Testmodellen mit unseren biologischen vaskularisierten Gerüst (BioVaSc) 2,3. Die BioVaSc können als statische oder dynamische 3D-Matrixsystem verwendet werden. Für statische Kultur, ist die Schweine dezellularisiertes Jejunalsegment (Dünndarmsubmukosa SIS-Muc) in einem Metalleinsatz für die Zell Nachsaat platziert. Verschiedene Zellen, wie Krebszellen und Endothelzellen auf dem Gerüst gezüchtet werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Für dynamische Kultur, die BioVaSc einen Bioreaktor-System, das Fluss durch das Gefäßsystem oder über die Oberfläche des Gerüsts gilt angebracht. Strom Bioreaktoren implementieren biologische, mechanische oder elektrische Stimuli, die auf der Differenzierung oder Proliferation von Zellen 4 handeln. Für Bioreaktoren im Bereich des Tissue Engineering, ist das Grundkonzept, um die Bedingungen im menschlichen Körper simuliert. Wobei werden Zellen bereitgestellt eine natürliche Umgebung, in der sie miteinander und mit den sie umgebenden extrazellulären Matrix interagieren können. Zur Herstellung von in vitro-Testsystemen oder Transplantate, ist die Fähigkeit, die natürliche Umgebung der Zellen mit einem geeigneten Trägerstruktur und Bioreaktorsystem nachahmen kritisch 5. Daher müssen immer komplexer und technisch anspruchsvoller Geräte, um diese Aufgaben zu erfüllen, 6 entwickelt werden. Weiterhin ist es möglich, unsere Gerüst für die establ verwendenAuffüllung eines vaskularisierten Modell aufgrund der erhaltenen röhrenförmige Strukturen, die die zuführende Arterie, Vene, und das Verbindungs ​​Kapillarbett enthalten. Alle Schweine-Zellen benötigen, um durch chemische, mechanische und enzymatische Dezellularisierung entfernt werden, und das Gerüst gamma-sterilisiert. Die wiederhergestellten Rohr vaskulären Strukturen können anschließend mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter Verwendung eines Rückführ Perfusionsbioreaktorsystem 7, welche die biomechanischen und / oder biochemische Parameter, wie pH-Wert, Temperatur, Druck, Nährstoffversorgung und Entsorgung 6 nachahmt impft werden. Die Reendothelialisierung der rohrförmigen Strukturen schafft eine menschliche Blutgefäßäquivalent im kollagenen Gerüst 3,7. In dem folgenden Schritt, kann die Oberfläche der früheren Lumen (Mucosa) mit primären humanen Zellen besiedelt werden, um Co-Kulturen 3,7,8 herzustellen. In dieser Studie wurde ein 3D-Tumortestsystem wird durch Co-Kultivieren einer Tumorzelllinie mit primären st eingestelltRomals Zellen unter statischen und dynamischen Bedingungen auf der SIS-Muc.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase-Lösung</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>(500 U/ml)</td></tr><tr><td>Dispase-Lösung</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>(2,0 U/ml)</td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase ROCHE</td><td></td><td>10104159001</td><td>200 mg gelöst in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td></tr><tr><td>DZ-Lösung</td><td>Roth</td><td>3484,2</td><td>34 g Natrium Desoxychelat, in 1 L Reinstwasser</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>medizinischer Druckmessumformer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>monoklonale Maus anti-human Von Willebrand Faktor</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>Klon F8/86 0,12 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-human p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>Klon DO-7 gebrauchsfertige</td></tr><tr><td>peristaltische Pumpe</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile Einwegkuppel</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin / EDTA-Lösung</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-MV)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering eines menschen 3d<em&gt; in-vitro-</em&gt; tumor-testsystem

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Krebs ist eine der führenden Todesursachen weltweit. Aktuelle Therapiestrategien werden überwiegend in 2D-Kultur-Systeme, die physiologischen Bedingungen in vivo unzureichend widerspiegeln entwickelt. Biologische Zellen 3D-Matrices bieten ein Umfeld, in dem die Zellen können sich selbst organisieren, so dass die Untersuchung der Gewebeorganisation und der Zelldifferenzierung. Solche Gerüste können mit einem Gemisch aus verschiedenen Zelltypen, direkte 3D-Zell-Zell-Interaktionen zu studieren ausgesät werden. Um das 3D-Komplexität von Krebstumoren zu imitieren, hat unsere Gruppe ein 3D in vitro Tumortestsystem entwickelt. Unsere 3D-Gewebetestsystem-Modelle der in vivo Situation von malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs), die wir mit unseren dezellularisiertes Schweine Jejunalsegment abgeleiteten biologischen vaskularisierten Gerüst (BioVaSc) gegründet. In unserem Modell reseeded wir eine modifizierte BioVaSc Matrix mit primären Fibroblasten, mikrovaskulären Endothelzellen (MVECs) und die S462-Tumorzelllinie. Für statische Kultur, wird die Gefäßstruktur des BioVaSc entfernt und die verbleibende Gerüst auf einer Seite offen (Dünndarmsubmukosa SIS-Muc) geschnitten. Die resultierende Matrix wird dann zwischen zwei Metallringen (Zell Kronen) befestigt. Eine weitere Option ist es, die Zellkultur ausgesät SIS-Muc in einem Strömungsbioreaktorsystem, das die Zellen Scherbelastung aussetzt. Hier wird der Bioreaktor eine peristaltische Pumpe in einem selbstgebauten Inkubator verbunden. Ein Computer steuert die arterielle Sauerstoff-und Nährstoffzufuhr über Parameter wie Blutdruck, Temperatur und Volumenstrom. Dieser Aufbau ermöglicht eine dynamische Kultur entweder mit druckregulierten pulsierende oder Konstantstrom. In dieser Studie konnten wir erfolgreich sowohl eine statische als auch dynamische 3D-Kultursystem für MPNSTs herzustellen. Die Fähigkeit, Krebstumore in einer natürlicheren 3D-Umgebung zu modellieren wird die Entdeckung, Erprobung und Validierung zu ermöglichenZukunft Pharmazeutika in einem Menschen-ähnliches Modell.

Wie in Fig. 1B gezeigt ist, wir die dezellularisierte Schweine Jejunalsegment (ca. 2 m Länge und 20 mm Durchmesser) mit erhaltenen röhrenförmigen Strukturen des kapillaren Netzwerk. Nach der chemischen, enzymatischen und mechanischen Dezellularisierung, erhalten wir eine Kollagen I / III-Gerüst, die für 3D-Zellkultur verwendet werden können. Ein Feulgen-Test wurde durchgeführt, um die Reinheit (keine DNA-Resten) der Matrix (Daten nicht gezeigt) zeigen. 2A und 2B zeigen die statische Kultur der SIS-Muc von den Zell Kronen gesichert. Wir setzten die SIS-Muc in einer in-house entwickelt Bioreaktor (2C) für die dynamische Kultur. 2D stellt die simulierten dynamischen Strom durch die Kammer des Bioreaktors. Der Bioreaktor wird in einem selbstgebauten Inkubator System angeordnet und mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist. Dieser Aufbau ermöglicht eine dynamische Kultur entweder mit druckregulierten pulsierenden Fluss oder c<html> onstant Fluss. Figur 3 gibt einen Überblick über den statisch kultivierten S462 Tumorzelllinie in der 2D-Mono (3A) und in 3D Cokultur (3B-3D). 3B zeigt die dreifache Kultur von Tumorzellen und Fibroblasten S462 auf der apikalen Seite des SIS -Muc (ehemaliger Innenlumen Seite) und MVEC auf der basolateralen Seite (ehemaliger Serosaseite). Die Identifizierung der verschiedenen Zelltypen ist durch Färbung Zelltyp-spezifischen Markern, wie z. B. von Willebrand-Faktor zu MVEC (3C) Beschriftung möglich. Die p53-positiven Zellen S462 aus den p53-negativen primären Fibroblasten (Fig. 3D) und die 3D-Verteilung der Zellen können analysiert werden unterschieden werden. 4 zeigt Färbungen entspricht Fig. 3 der dynamisch kultivierten Triple Kultur. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Dezellularisierung Set-up. (A) Bioreaktor und Pumpen Set-up für die Dezellularisieren BioVaSc von einem PC überwacht. (B) Dezellularisierte BioVaSc in Glasbehälter. Das Lumen und die arterielle Einlass sind an den Adapter angeschlossen ist. . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> 2. In Hinblick auf die verschiedenen Kultur-Set-ups. (A) CAD-Schnittansicht der statischen Kultursystem in Mikrotiter-Well-Platte, (B) Metalleinsätze für statische Kultur, (C) mittlere Strömungssimulation (Geschwindigkeitsfeld [m / s]) für die dynamische Kultur der obere Deckel des Strömungs Bioreaktor , (D) Durchfluss Bioreaktor für die dynamische Kultur in die Schlauchpumpe verbunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Fig. 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> 3. Übersicht über die immunhistologische Charakterisierung der statischen 3D-Tumormodell. (A) Hämatoxylin-Färbung der statisch kultivierten 2D-Monokultur S462 Zellen auf einem Permanox Rutsche, (B) H &amp; E-Färbung der statisch kultivierten 3D-Dreifach-Kultur, markieren Pfeile Endothelzellen, (C) immunhistologische Färbung für von-Willebrand-Faktor, (D ) immunhistologischen Färbung für p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 4. Übersicht über die immunhistologische Charakterisierung der dynamischen 3D-Tumormodell. (A) H &amp; E-Färbung der dynamisch kultivierten 3D-Dreifach-Kultur, Pfeile markieren Endothelzellen, (B) immunhistologische Färbung für von-Willebrand-Faktor, (C) immunhistologischen Färbung für p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a>

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein dreidimensionales Tumortestsystem mit primären Zellen auf einem entzellulierten biologischen Gerüst aufzubauen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gerüst mithilfe eines Entzellulisierungsprozesses vorbereitet wird, bei dem ein porcines Al-Segment mit einer Entzellulisierungslösung durchspült wird. Der zweite Schritt besteht darin, primäre humane Zellen aus der Biopsie eines Patienten unter Verwendung eines Standardisolierprotokolls zu gewinnen.Als Nächstes wird das Tumortestsystem eingerichtet, indem die röhrenförmige Dünndarmmukosa an einer Seite geöffnet, zwischen zwei Metallringen fixiert und mit Tumorzellen sowie assoziierten stromalen Zellen in definierten Zelldichten besiedelt wird. Im letzten Schritt wird das mit Zellen beladene Konstrukt in einer geeigneten Vorrichtung unter statischen oder dynamischen Bedingungen kultiviert. Abschließend erfolgt die Beurteilung der Eigenschaften des Tumorwachstums mittels immunhistochemischer Mikroskopie.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie TT-Tumortestsystemen liegt darin, dass mit ihr 3D-Gewebemodelle erzeugt werden können, die die In-vivo-Bedingungen eines Tumors genauer abbilden als gängige 2D-Modelle. Der Vorteil der dynamischen Kultur besteht darin, dass zellspezifische Eigenschaften erhalten bleiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorbiologie zu beantworten, beispielsweise, wie Krebszellen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen in einer 3D-Umgebung ausbilden, was zur Aufklärung tumorkrankheitsbezogener Prozesse wie Tumorprogression und Metastasierung beiträgt. Das biologische, vaskularisierte Gerüst (biova), das in diesem Tumortestsystem verwendet wird, stammt aus einem porcinen Dünndarmabschnitt. Spülen Sie das vaskuläre System des porcinen Darmabschnitts sowie das intestinale Lumen über einen katheterisierten arteriellen Zugang mit PBS aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Strukturen vollständig gereinigt sind.Bereiten Sie einen 200 Millimeter durchmessenden Glasbehälter mit vier Anschlüssen vor und verbinden Sie diese über Silikonschläuche mit der peristaltischen Pumpe. Die Druckregelungseinheit kann über einen Drucksensor überwacht werden, der mit einer sterilen Einweghaube verbunden ist. Füllen Sie die Vorratsflaschen mit Dekellularisierungs- oder DZ-Lösung.Überprüfen Sie das Schlauchsystem auf mögliche Luftblasen. Verbinden Sie das intestinale Lumen mit Kabelbindern mit den Glasverbindern für den luminalen Fluss. Pumpen Sie 500 Milliliter DZ-Lösung in den roten arteriellen Zugang des Gefäßsystems. Unterbrechen Sie den Pumpvorgang alle 15 Minuten kurz, um den gesamten Darmlumen manuell auszupressen. Es ist wichtig, den Druck der Pufferlösung während des Dekellularisierungsprozesses zu überwachen. Der Druck sollte zwischen 80 und 100 Millimeter Quecksilbersäule liegen, angelehnt an den natürlichen Blutdruck.Waschen Sie die Bioba mit PBS, bis keine Zellreste mehr vorhanden sind und die Gefäßstruktur vollständig weiß ist. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Hautbiopsie mit einem Skalpell in Streifen von zwei bis drei Millimetern Breite schneiden und diese dreimal mit PBS-Lösung spülen. Nach der Inkubation des Gewebes mit Disbe-Lösung trennen Sie mithilfe zweier Pinzetten die Epidermis von der Dermis.Überführen Sie beide getrennt in mit PBS gefüllte Petrischalen, um primäre dermale mikrovaskuläre Endothelzellen oder MV-EECs zu isolieren. Spülen Sie die Dermis-Streifen einmal mit Enzym, geben Sie 10 Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung zu den Dermis-Streifen hinzu und inkubieren Sie 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit 1 % FCS und überführen Sie die Hautstreifen in eine mit Vascu Life gefüllte Petrischale. Schaben Sie jeden Streifen mit dem Skalpell je achtmal auf jeder Seite ab, wobei etwas Druck ausgeübt wird, um eine Zellsuspension zu erhalten.Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Zellpellet in Vascu Life. Um Fibroblasten zu isolieren, schneiden Sie zunächst die Dermisstreifen mit einem Skalpell in kleine Stücke.Überführen Sie die Dermisstücke in ein Falcon-Gefäß und geben Sie 10 Milliliter kollagenasehaltige Lösung hinzu, die 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Anschließend zentrifugieren Sie die Lösung und entfernen vorsichtig den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit DMEM plus 10 % FCS plus 1 % Pen/Strep.Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand entfernen, das Pellet in Kulturmedium resuspendieren und in einen T-75-Kulturkolben überführen, um das Auswachsen der Zellen aus dem Gewebe zu ermöglichen; inkubieren Sie unter statischen Bedingungen. Um das Tumortestsystem einzurichten, schneiden Sie zunächst die röhrenförmige Darmsubmukosa oder SIS-Muk, öffnen Sie sie an einer Seite und fixieren Sie sie zwischen zwei Metallringen. Diese selbstkonstruierten Zellkronen haben einen Durchmesser von 10 Millimetern.Bedecken Sie die SIS mu am folgenden Tag über Nacht in Zellkulturmedium, säen Sie primäre MVE CS auf die basale Schichtoberfläche der SIS, der ehemaligen CI.Inzubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid für drei Stunden. Füllen Sie drei Stunden später die Vertiefung mit Medium, um eine untergetauchte Kultur zu gewährleisten, und stellen Sie sie zurück in den Inkubator. Lassen Sie die Endothelzellen drei Tage lang haften, nachdem drei Tage vergangen sind.Drehen Sie das statische Kultursystem um 180 Grad und überführen Sie es in eine 12-Loch-Platte. Danach betrachten Sie eine Mischung aus primären dermalen Fibroblasten und Tumorzellen auf der apikalen Oberfläche der SIS. Die Seite des ehemaligen Lumens.Lassen Sie die Zellen drei Stunden lang anhaften. Füllen Sie die Vertiefung mit Medium, um die Kultur zu überständen, das Tumortestsystem unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, für zusätzliche 14 Tage, wobei das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage für die dynamische Kultur gewechselt wird. Fixieren Sie das SIS-Mu zwischen zwei Metallringen und säen Sie primäre MV-EECs, wie zuvor gezeigt. Nach drei Tagen die SIS-Membran von den Metallringen entfernen und die Membran mit einer Spritze und einer Kanüle in den Durchflussreaktor einsetzen. Die primären dermalen Fibroblasten und Tumorzellen auf die Matrix im Bioreaktor aufbringen. Die Zellen drei Stunden lang andocken lassen, bevor am folgenden Tag das Bioreaktorsystem mit Kulturmedium gefüllt wird; anschließend den Bioreaktor in ein selbstkonstruiertes Inkubatorsystem stellen und an eine peristaltische Pumpe anschließen.Dieser Aufbau ermöglicht die dynamische Kultivierung entweder mit druckreguliertem pulsatilem Fluss oder mit konstantem Fluss. In diesem Experiment wird ein konstanter Mediumfluss von 3,8 Milliliter pro Minute verwendet. Führen Sie die dynamische Kultivierung über 14 Tage durch und wechseln Sie das Kulturmedium nach sieben Tagen.Nach Abschluss der Experimente werden die Gewebe fixiert, in Paraffin eingebettet und gefärbt und anschließend mit einem inversen Mikroskop abgebildet. Hier sind repräsentative Ergebnisse dargestellt. Das Panel A zeigt eine Übersicht über die statisch kultivierte S 4 62 Tumorzelllinie in 2D-Monokultur, die mit Hämatoxylin gefärbt wurde.Die 3D-Kokultur ist in den Abbildungen B, C und D dargestellt. Dieses mit H und E gefärbte Bild zeigt die dreifache Kultur aus Tumorzellen S 4 62 und primären Fibroblasten auf der apikalen Seite des SIS-MU und der MVEC. Auf der basolateralen Seite markieren die Pfeile die endothelialen Zellen. Unterschiedliche Zelltypen können durch Färbung zellspezifischer Marker identifiziert werden, wie beispielsweise von Willebrand-Faktor zur Markierung der MVEC in Abbildung C und P 53 in Abbildung D. Die P 53-positiven S 4 62-Zellen können von den P 53-negativen primären Fibroblasten unterschieden werden, und die 3D-Verteilung der Zellen kann auf die gleiche Weise analysiert werden.Unterschiedliche Zelltypen können in der dynamisch kultivierten Dreifachkultur identifiziert werden. Abbildung A zeigt ein H- und E-gefärbtes Bild, in dem die Pfeile die Endothelzellen markieren. Abbildung B zeigt eine immunhistologische Färbung für das von-Willebrand-Faktor, und Abbildung C zeigt die Färbung für p53 nach dieser Prozedur. Weitere Methoden wie Arzneimitteltests können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie neue Krebs Therapien gefunden werden können oder die Analyse wichtiger Signalwege in der Tumorgenese.Außerdem können Primärzellen verwendet werden, um die beste personalisierte Behandlung für einzelne Patienten zu bestimmen.

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