Tissue Engineering eines Menschen 3D In-vitro- Tumor-Testsystem

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein 3D-Tumortestsystem mit Primärzellen auf einem dezellularisierten biologischen Gerüst aufzubauen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gerüst unter Verwendung eines Dezellularisierungsprozesses vorbereitet wird, bei dem ein Schweinesegment mit Dezellularisierungslösung gepumpt wird. Der zweite Schritt besteht darin, primäre menschliche Zellen aus der Biopsie eines Patienten unter Verwendung eines Standardisolationsprotokolls zu isolieren.

Als nächstes richten Sie das Tumortestsystem ein, indem Sie die tubuläre Dünndarmsubmukosa auf einer Seite aufschneiden, zwischen zwei Metallringen fixieren und mit Tumorzellen und zugehörigen Stromazellen in definierten Zelldichten besäen. Der letzte Schritt besteht darin, das zellbeladene Konstrukt in einem geeigneten Aufbau unter statischen oder dynamischen Bedingungen zu kultivieren. Letztendlich wird die immunhistochemische Mikroskopie eingesetzt, um die Eigenschaften des Tumorwachstums zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie TT-Tumortestsystemen besteht darin, dass es mit dieser Methode möglich ist, 3D-Gewebemodelle zu erstellen, die die In-vivo-Bedingungen eines Tumors genauer simulieren als herkömmliche 2D-Modelle. Der Vorteil der dynamischen Kultur besteht darin, dass zellspezifische Eigenschaften erhalten bleiben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumorbiologie zu beantworten, z. B. wie Krebszellen Zellzell- und Zellmatrix-Interaktionen in einer 3D-Umgebung bilden, was dazu beitragen wird, krebsbezogene Prozesse wie Tumorprogression und Metastasierung aufzuklären.

Das in diesem Tumortestsystem verwendete biologische vaskularisierte Gerüst oder Biova wird aus einem Schweinejaalsegment abgeleitet. Spülen Sie das Gefäßsystem des Schweinesegments und das Darmlumen mit PBS über einen kanülierten arteriellen Zugang. Wiederholen Sie den Vorgang, bis er vollständig sauber ist.

Bereiten Sie einen Glastank mit 200 Millimetern Durchmesser mit vier Adaptern vor und verbinden Sie diese über Silikonschläuche mit der Schlauchpumpe. Die Überwachung des Druckregelgeräts kann über einen Drucksensor erfolgen, der mit einer sterilen Einwegkuppel verbunden ist. Füllen Sie die Reservoirflaschen mit Dezellularisierungs- oder DZ-Lösung.

Überprüfen Sie das Schlauchsystem auf mögliche Luftblasen. Verbinden Sie das Darmlumen mit Kabelbindern mit den Glasanschlüssen für den Lichtfluss. Pumpen Sie 500 Milliliter DZ-Lösung in den roten arteriellen Zugang des Gefäßsystems.

Unterbrechen Sie den Pumpvorgang alle 15 Minuten kurz, um das gesamte Darmlumen manuell herauszudrücken. Es ist wichtig, den Druck der Pufferlösung während des Dezellularisierungsprozesses zu überwachen. Der Druck sollte zwischen 80 und 100 Millimeter Quecksilbersäule liegen, nach dem Vorbild des natürlichen Blutdrucks.

Waschen Sie die Biova mit PBS, bis sie frei von Zellresten ist und die Gefäßstruktur vollständig weiß ist. Beginnen Sie diesen Eingriff, indem Sie die Hautbiopsie mit einem Skalpell in zwei bis drei Millimeter breite Streifen schneiden und diese dreimal mit PBS-Lösung abspülen. Nachdem Sie das Gewebe mit Disbe-Lösung inkubiert haben, verwenden Sie zwei Pinzetten, um die Epidermis von der Dermis zu trennen.

Übertragen Sie beide separat in Petrischale, die mit PBS gefüllt sind, um primäre dermale mikrovaskuläre Endothelzellen zu isolieren, oder MV eecs Spülen Sie die Dermisstreifen. Sobald Sie mit En sind, geben Sie 10 Milliliter Trips in EDTA-Lösung zu den Dermisstreifen und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Enzymreaktion mit 1%FCS und übertragen Sie die Hautstreifen in eine Petrischale, die mit Gefäßleben gefüllt ist. Kratzen Sie jeden Streifen mit dem Skalpell achtmal auf jeder Seite aus und üben Sie etwas Druck aus, um eine Zellsuspension zu erzeugen.

Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension und -reanimation, suspendieren Sie das Zellpellet mit Vascu-Lebensdauer. Zur Isolierung von Fibroblasten. Zuerst schneidest du die Dermisstreifen mit einem Skalpell in kleine Stücke.

Übertragen Sie die Dermisstücke in ein Falcon-Röhrchen und fügen Sie 10 Milliliter Kollagenaselösung hinzu, die 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde. Zentrifugieren Sie anschließend die Lösung und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit DMEM plus 10 % FCS plus 1 % Streptokokken.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig entfernt, das Pellet in Kulturmedium resuspendiert und in einen T 75-Kulturkolben überführt, damit die Zellen unter statischen Bedingungen aus dem Gewebe herauswachsen und inkubieren können. Um das Tumortestsystem einzurichten, schneiden Sie zunächst die röhrenförmige Dünndarmsubmukosa oder SIS-Muc ab, öffnen Sie sie auf einer Seite und fixieren Sie sie zwischen zwei Metallringen. Diese selbst konstruierten Zellkronen haben einen Durchmesser von 10 Millimetern.

Das SIS mu über Nacht in Zellkulturmedium einhüllen, primäres MVE CS auf die basale spätere Oberfläche des SIS, das frühere CI, aussäen.Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid inkubieren. Füllen Sie die Vertiefung drei Stunden später mit Medium, um eine untergetauchte Kultur zu gewährleisten, und bringen Sie sie in den Inkubator zurück. Lassen Sie die Endothelzellen nach drei Tagen drei Tage lang anhaften.

Drehen Sie das statische Kultursystem um 180 Grad und übertragen Sie es auf eine 12-Well-Platte. Als nächstes sehen Sie eine Mischung aus primären dermalen Fibroblasten und Tumorzellen auf der apikalen Oberfläche des SIS. Die Seite des ehemaligen Lumens.

Lassen Sie die Zellen drei Stunden lang anhaften. Füllen Sie die Vertiefung mit Medium, um die Kulturkultur, das Tumortestsystem unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid für weitere 14 Tage zu tauchen, und wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage für die dynamische Kultur. Befestigen Sie das SIS-mu zwischen zwei Metallringen und setzen Sie die primären MV-eecs aus, wie zuvor gezeigt.

Entfernen Sie nach drei Tagen das SIS mu von den Metallringen und setzen Sie die Membran mit einer Spritze und einer Kanüle in den Durchflussreaktor ein. Bringen Sie die primären dermalen Fibroblasten und Tumorzellen auf die Matrix im Bioreaktor auf. Lassen Sie die Zellen drei Stunden anhaften, bevor Sie am nächsten Tag das Bioreaktorsystem mit Kulturmedium befüllen, stellen Sie den Bioreaktor in ein selbst konstruiertes Inkubatorsystem und schließen Sie ihn an eine Peristaltikpumpe an.

Dieser Aufbau ermöglicht die dynamische Kultur entweder mit druckgeregelter pulsierender Strömung oder mit konstanter Strömung. In diesem Experiment wird ein konstanter Medienfluss von 3,8 Millilitern pro Minute verwendet. Behalten Sie die dynamische Kultur 14 Tage lang bei, und wechseln Sie das Kulturmedium nach sieben Tagen.

Nach Abschluss der Experimente werden die Gewebe fixiert, paraffiniert, eingebettet und gefärbt und dann mit einem inversen Mikroskop abgebildet. Repräsentative Ergebnisse sind hier zu sehen. Panel A gibt einen Überblick über die statisch kultivierte S 4 62 Tumorzelllinie in 2D-Monokultur, die mit Hämattolin gefärbt wurde.

Die 3D-Co-Kultur ist in den Panels B, C und D zu sehen.Dieses H- und e-gefärbte Bild zeigt die Dreifachkultur der Tumorzellen S 4 62 und primären Fibroblasten auf der apikalen Seite der SIS MU und MVEC. Auf der basalen lateralen Seite markieren die Pfeile die Endothelzellen. Verschiedene Zelltypen können durch Färben von zelltypspezifischen Markern identifiziert werden, wie z. B. dem von-Willebrand-Faktor zur Markierung von MVEC (siehe Panel C) und P 53 (siehe Panel D). Die P 53 positiven S 4 62 Zellen können von den P 53 negativen primären Fibroblasten unterschieden werden, und die 3D-Verteilung der Zellen kann auf die gleiche Weise analysiert werden.

In der dynamisch kultivierten Dreifachkultur können verschiedene Zelltypen identifiziert werden: Panel A ist ein H- und E-gefärbtes Bild, bei dem die Pfeile die Endothelzellen markieren. Panel B zeigt eine immunhistologische Färbung für den von-Willebrand-Faktor und Panel C zeigt eine Färbung für P 53 nach diesem Verfahren. Andere Methoden, wie z.B. Medikamententests, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Suche nach neuen Krebstherapien oder die Analyse wichtiger Signalwege in der Tumorgenese.

Außerdem können Primärzellen verwendet werden, um die beste personalisierte Behandlung für einzelne Patienten zu definieren.