Name: Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die Kraftspektroskopie zur Messung axonaler Adhäsion an Substrate mit Pikoneuton-Sensitivität. Diese Methode nutzt optische Fallen und UV-Laser zur Präzisionsanalyse neuronaler Mechanik.

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Alberto Guiggiani für die Entwicklung des Echtzeit-Steuersystem, Evelina Chieregatti und Hanako Tsushima für aufschlussreiche Diskussionen, Giacomo Pruzzo und Alessandro Parodi für die Entwicklung von kundenspezifischen Elektronik und Software, und Claudia Chiabrera und Marina Nanni für ihre kompetente Beratung und Unterstützung in der Zellkultur Vorbereitung.

1. Optischer Aufbau Das gesamte optische System wurde zuvor 15 beschrieben. Kurz gesagt, wird die optische Pinzette-System auf einer Ytterbium Dauerstrich (CW)-Faser-Laser, der bei 1064 nm (IPG Laser GmbH) basiert. Räumlicher Lichtmodulator (SLM) (LCOS SLM, Modell X10468-07 - Hamamatsu) variiert die Phase des ankommenden IR Laserstrahl, um die Position der Trapping Brennfleck auf der Kulturschale von computergenerierten Hologrammen steuern. Die frei verfügbaren Blue-Pinzette-Software (Web-Link auf Geräte-Tisch) Hologramme auf der Licht-Raum-Modulator projiziert. Und einer Photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs) - Das Interferometer für Kraft-Spektroskopie-Messungen wurde auf einem Vier-Quadranten-Photodiode (Hamamatsu QPD, S5980 mit C5460SPL 6041 board) basiert. Der Laser Dissektion Quelle war eine gepulste Subnanosekundenbereich UV Nd: YAG-Laser bei 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV-Laser - Teem Photonics). Ein akusto-Modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm Quarzglas-AA-Optoelektronische) gesteuert die Leistung des UV-Lasers in die Probe ein. Mit einem 60X, 0,9 NA Eintauchen in Wasser objective.The des Mikroskops von einem 3-Achsen linear Gleichstrommotor Feineinstellplatten besteht ausgestattet - das holographische optische Pinzette und Laser-Mikro-Dissektor wurden auf einer modifizierten aufrechtes Mikroskop (Olympus BX51) integriert System (M-126.CG1, Physik-Instrumente), die eine separate 3-Achsen piezoelektrischen Nano-Positionierung der Bühne (P-733.3DD, Physik-Instrumente), um grobe Bewegung der Probe mit dem Sub-Nanometer-Auflösung des Mähdreschers piezo- Stufe. Das Mikroskop Stufen-System mit zwei Schlaufen ausgestattet synergistisch wirkt, um das Einfangen Brennfleck an der richtigen Stelle zu halten, je nach der gewählten Arbeitsmodus (Position oder Kraftklemme, statisch oder dynamisch) 16. Insbesondere wirkt eine interne Rückkopplungsschleife auf einem piezoelektrischen Bühne, um den Wulst an einer select haltened Abstand aus der Falle entfernt. Die anderen externen Schleife steuert die Position des motorisierten Bühne, um die Region mit den Piezo-Aktor auf eine größere Fläche als die zur Verfügung stehende Hub 17 überspannt auszunutzen. Wenn das Piezo-Stufe die Grenze der zur Verfügung stehenden Hub in einer Richtung erreicht, die äußere Schleife die Mikro Stufe in entgegengesetzter Richtung, wodurch der piezoelektrische wieder in seine zentrale Position, weil es Tracking wird die eingeschlossene Wulst geklebt auf die Probe. Wenn der Piezo-Bühne die zentrale Position seines Kurses Bereich erreicht, stoppte der Mikro Bühne. Weitere Einzelheiten der Anlage sind in Guiggiani et al 16,17 gemeldet. Ein Peltier-Vorrichtung (QE1 Widerstandsheizelement mit TC-344B Zweikanal Heizungssteuerung - Warner Instruments) regelt die Temperatur der Zellkultur unter dem Mikroskop (37 ° C). In der Kultur, pH und Feuchte unter physiologischen Bedingungen durch Belüften eine speziell angefertigte Polydimethyl beibehaltenSiloxan (PDMS) Hülse (Integration des Mikroskop-Objektivs) mit angefeuchteten Carbogen (95% O 2, 5% CO 2). 2. Cell Culture Vorbereitung Alle experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt. Primäre Kulturen wurden aus hippocampi von Mäusen (C57BL6J, Charles River) an embryonalen Tag 18 (E18) erhalten. <ol><li> Neuronen wurden bei einer Konzentration von 25.000 Zellen / ml auf Glasboden-Petrischalen (- MATEK Gesellschaft P35G-0-14-C) beschichtet. Die niedrige Konzentration der kultivierten Zellen benötigt wird, um die Bildung eines dichten Netzes schon in den ersten Tagen in vitro zu vermeiden. Bei der erwähnten Zellkonzentration, ist die Wahrscheinlichkeit des Findens isolierten Zellen mit einer längeren Neuriten nicht an andere Zellen verbunden viel höher. </li></ol> 3. Wulstbeschichtung <ol><li> Polymer-Mikrokugeln (Ø 4 um, COOH-terminierten-Bangs Laboratories, Produkt-Code PC05N/6700) wurden mit Poly-D-Lysin nach dem Verfahren in der Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, Produkt-Code 19539) beschrieben. Die Perlen werden mit dem gleichen Molekül verwendet werden, um die Kultur Unterstützung und für Zellen Haftung Abdeckung beschichtet. </li></ol> 4. Wählen Isolated Neuron. Trennen einer Perle aus der Kultur Substrat, Trap and Move it Neben dem Neuron <ol><li> Legen Sie die Kultur Petrischale am Mikroskop Bühne. Nach dem Setzen des Fokus auf der Probe durch Bewegung Bühne, korrigieren Sie die Position der leuchtenden Ziel Kondensator Kohler-Beleuchtung gesetzt. Ausrichten der Beleuchtung, um die Optik Kolher-Beleuchtung Bedingung ist nötig, damit die Hellfeldabbildung Qualität zu verbessern. Mit einer solchen Ausrichtung Bedingungen ist es auch notwendig, den IR-Laser Abscheidegrad (über Ziel Kondensator) zu maximieren, von der Streuung gefangen Sonde seiner interferometrischen Tracking der QPD und PD durchzuführen. </li><li> Pipette ein paar ul des beschichteten Mikrokügelchen Stammlösung inder Kulturschale. Mikrosphären werden hinterlegen und sich an die Kultur Substrat. Die Zahl der ul in der Kulturschale injiziert hängt von der Konzentration der Mikrokügelchen Stammlösung. Der Idealzustand ist, zwischen einem und zwei Mikrosphären pro Bildgebung Sichtfeld haben. Wenn zu viele Mikrokugeln in die Kulturschale gegeben werden, können sie bereits zufällig Befestigung zu den kultivierten Neuronen. </li><li> Bewegen Sie sich in der Kulturschale, die Suche nach einem isolierten Neuron mit einer längeren Neuriten (das Axon), und speichern Sie die Position des Mikroskops. </li><li> Bewegen Sie sich und suchen Sie nach einem Wulst verklebt auf der Kultur-Unterstützung. </li><li> Schalten Sie den IR Fanglaser. In diesem Stadium werden keine Hologramme auf SLM projiziert wird, und die Position des IR Laserpunkt fällt mit der UV Laserfleckposition. Stellen Sie die axiale Position der Stelle IR 2-3 um über der Kultur Auflagefläche durch Mikroskoptisch Bewegung. </li><li> Stellen Sie den UV-Laser zugeführte Energie der Probe auf weniger als 1 uW. DieUV-Laser dissector wurde bisher 14 kalibriert: 5-6 uW der Glasträger abgetragen 4 uW eine neuronale Verbindung wird vollständig zerlegt 2,5 uW ein Neuriten teilweise lädierten wird &lt;1 uW eine Schockwelle in der Kulturschale hergestellt. Die optische Stoßwelle ist stark genug, um den Wulst von dem Glasträger zu lösen. </li><li> Schalten Sie die UV-Laser, während die IR-Laser auf, und verschieben Sie die UV-Stelle über dem eingehalten Wulst durch Mikroskoptisches Bewegung. Die Kügelchen löst sich von der Oberfläche, und es wird von dem IR-Laser gefangen. Dann schalten Sie den UV-Laser. </li><li> Bewegen Sie die eingeschlossene Wulst mehrere Mikrometer über dem Glasträger (20-30 um). Anheben der Wulst zu dieser Position wird es von Kontakt mit anderen Zellen, während sie in Richtung des zuvor gewählten Neuron bewegt wird verhindern. Bringen Sie die Perle der zuvor gespeicherte Position der Bühne. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Bühne auf einen niedrigen Wert (10 um / sec), so dass die Drag Fluidkraft nicht übersteigt optischen Falleping Kraft. </li></ol> 5. Bewegen Sie den Trap-Position in Bezug auf den Spot-und Laser Dissector Axon Position von Computer Generated Hologram und Kalibrieren der optischen Pinzette Steifigkeit <ol><li> Bewegen Sie den Wulst auf dem Glasträger auf das Axon zu visualisieren. Der Wulst über der Zelle gehalten kontaktiert zu (etwa 5 um über dem Glasträger) zu vermeiden. </li><li> Bewegen des Mikroskops, um die UV-Fokuspunkt auf der Mitte der Breite des Axons zu bewegen. Speichern Sie die aktuelle Position der Bühne. </li><li> Bewegen Sie den IR Fokusfleck Position computergenerierten Hologramms. In diesem Schritt wird die Phase, in der in dem vorhergehenden Schritt gewählt gestoppt. Wenn der Computer erzeugten Hologramm auf dem SLM projiziert wird, wird das eingeschlossene Wulst bezüglich der Axon bewegt. Wir ziehen die IR Laserpunkt haben die eingefangenen Wulst an der Mitte des Neuriten ausgerichtet ist, mit dem UV-Laser auf dem gleichen Fleck Neuriten zentriert zu. Die IR-Spot und damit die eingeschlossenen Wulst entlang der Neuriten positioniert5-10 um weg von der UV-Spot. Wir ziehen die Position des IR bezüglich der UV Ort in Abhängigkeit von der Geometrie Neuriten. Falls die optische Pinzette nicht mit einem SLM-System ausgestattet sind, kann die Position durch Kippen Spiegel, optische oder akustische Umlenkungen, auf der IR-Strahlengang variiert werden. Der IR-Laser Spot ist vielleicht 5-10 um positioniert weg von der UV-Punktstrahler, optische Wechselwirkung des Strahls mit dem Sezieren gefangen Sonde, die deren Brownsche Bewegung beeinflussen könnten und verändern die Kraftspektroskopie Spuren zu vermeiden. </li><li> Nach der Definition des neuen IR Spot Position in Bezug auf UV-Spot-und Axon Position, bewegen die Bühne, um die eingeschlossene Wulst vom Axon positionieren und zu vermeiden Kollision mit ihm. Bewegen der axialen Position des eingefangenen Wulst zu etwa 2 um oberhalb des Deckglases. </li><li> Richten Sie die QPD zum Zentrum die Interferenzstreifen darauf: x und y QPD differentielle Signale sind Nullen, wenn die QPD zentriert ist. Erwerben Sie 5 Sekunden von der Brownschen Bewegung der eingefangenen Wulst von der InterferometrieMeter, bei 50 KHz Abtastrate. Besorgen Sie sich die Steifigkeit (PN / nm) und Empfindlichkeit (V / nm) von der optischen Falle von dem Leistungsspektrum 18 Verfahren. </li></ol> 6. Befestigen Sie die Perle der Axon. Führen Axotomie und Simultaneous Kraftmessung <ol><li> Heben Sie den eingefangenen Wulstposition etwa 4 um über dem Deckglas und verschieben Sie sie in die zuvor gespeicherte Position der Bühne (siehe Schritt 3.2). </li><li> Bewegen Sie den gefangen Wulst unten in Richtung der Axon bis sie die Neuriten. Die Kollision zwischen dem eingeschlossenen Wulst und dem Axon durch die z QPD Signal Erfassen einer Verschiebung des eingefangenen Wulst in axialer Richtung überwacht. </li><li> Warten Sie 10 Sekunden mit dem eingefangenen Wulst geschoben gegen das Axon seine Haftung auf dem neurite Membran begünstigen. </li><li> Bewegen der Mikrotisch um die gefangenen Wulst aus dem Axon verdrängen und damit die Prüfung seiner Haftung an der Zellmembran. Wenn der Wulst verklebt, entweicht es aus dem optischen Falle. </li><li> Bringen Sie den Laserfalle am eingehalten Wulstund auf die Kraft-Clamp-Schleife mit Kraft Zustand gleich Null schalten. Auf diese Weise sind die Piezo-Stufe positioniert den Wulst, der an der Zelle auf der optischen Falle entfernt. Wenn das System nicht über eine Rückkopplungsschleife Steuerung kann die Laserfalle Position durch das Mikroskop Bühne zu zentrieren es auf der eingehalten Sonde bewegt. Das Zentrum des Abscheiders erreicht wird, wenn die QPD Signale die gleichen wie bei der Wulst eingeschlossen ist und nicht in die Zelle (x und y QPD Signale gleich Null ist, und die z QPD Signal gibt die gleiche Spannung Summe der vier Quadranten verklebt sind als wenn der Wulst weit von jeder Oberfläche eingeschlossen). </li><li> Festlegen eines Kraft-Clamp Zustand auf der z-Achse, die Positionierung der Fanglaser etwas über der Mitte der Wulst (etwa 100 nm), um eine Vorspannung auf der haftenden gefangen Sonde zu erzeugen. Falls das System nicht mit einer Kraft-Klemme ausgestattet, kann die optische Falle Position nach oben in Schritten von 25 nm erhöht werden, indem dem Mikroskoptisch. Die z QPD Signal ermöglicht die Überwachung. Daher verwenden this Signal, um die Position des Laser-Falle in Bezug auf die Einhaltung Sonde einzustellen. Eine solche Vorspannung ist erforderlich, um die Belastung der Membran nach der axonalen Läsion, und die sich daraus ergebende Abnahme der Brownschen Bewegung des anhaftenden Sonde abzutasten. Ein ähnlicher Ansatz wurde auf die Messung der Freisetzung von Spannungen in einer Membran Halteseil von Video-Imaging 19 vorgeschlagen worden. </li><li> Abschaltung der Kraft-Clamp-Feedback, um die Kraft auf die eingehalten Sonde in der Lage-Clamp-Zustand (der Piezo-Bühne wird blockiert) messen. </li><li> Starten gleichzeitige Aufnahme der Sonde eingefangen Positionen durch das Interferometer (20 KHz Sampling-Frequenz) und der Zelle während der Laser Axotomie Zeitraffer Hellfeldaufnahme (20 Hz Bildrate). </li><li> Schalten Sie die UV-Laser, Laser-Impulse liefern, bis eine Läsion sichtbar auf das Bild des Axons (in der Regel 200-400 optischen Impulse benötigt Energie pro Puls:. NJ 25), und schalten Sie dann die UV-Laser. </li><li> Aufnahme fortsetzen durch das Interferometer für ca. 3 kmn, bis die x-, y-und z QPD Spuren ein Plateau erreicht. </li></ol> 7. Quantifizierung der insgesamt Spannungsstifte <ol><li> Konvertieren Sie die aufgezeichneten Spuren QPD (in Volt) durch die kalibrierte Empfindlichkeit der optischen Falle, um die jeweiligen Spuren in Nanometern zu erhalten. </li><li> Filtern der x-, y-und z-Verschiebung Spuren durch ein Hochpassfilter mit bei 10 Hz geschnitten. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Varianz der gefilterten Spuren, die die Brownsche Bewegung der eingefangenen Perle. Berechnen Sie die Varianz bei 25 ms Schritten für überlappende Zeitfenster von 500 ms (10.000 Datenpunkte) 20. Die Hochpassfilterung Spuren schließt die Änderungen der Brownschen Bewegung durch die Membran Fluktuation oder kortikalen Aktin Bewegung. Die Brownsche Bewegung der Kugel durch die optischen Kräfte und die Adhäsionskräfte an der Zellmembran reduziert. Wenn die Membran aufgrund der Freisetzung von Spannungen seine Viskosität erhöht und damit die Brownsche Bewegung der Raupe wird gespannt, sofort erkanntbar nach Axotomie, zu sinken beginnt. </li><li> Definieren t0: den Beginn der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz, nach der Lieferung von UV Laserenergie. Der Zeitpunkt t0 gibt den Beginn der Membran Stamm. </li><li> Definieren t1: das Ende der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz (wenn es ein Plateau erreicht). Der Zeitpunkt t1 gibt das Ende der Membran Stamm. </li><li> Führen Videotracking von Schmutz oder Kratzer auf der Abdeckung Glasträger, um jede Abweichung von der Probe während der Kraftmessung gemessen. Um die Teilchen auf dem Glasträger verfolgen wir zunächst gelten Schwellenwerte zu den Hellfeld-Bildern, um einen Stapel von binären Bildern mit dem Partikel in weiß auf schwarzem Hintergrund zu erhalten. Dann verfolgen wir das Teilchen Schwerpunkt mit Subpixel-Genauigkeit (unter Verwendung der Freeware ImageJ Software). </li><li> Subtrahieren Sie die gemessene Drift aus den Hubraum QPD Spuren. Multiplizieren Sie die driftkorrigierten QPD Spuren durch den jeweiligen kalibrierten optischen Steifigkeit (k x, k <sub&gt; y, z k), um die Fx, Fy, Fz Spuren in Pikonewton erhalten. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Kraft Spur als F ges = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Berechnen Sie die gesamte Freisetzung von Kraft zwischen t0 und t1 als F = F freigegeben tot (t1) - F tot (t0). Die Kraft, bei t0 gemessen wird, subtrahiert werden, da es aufgrund der Verschiebung der Sonde aus der Falle entfernt ist, wenn die Wulst haftet an der Neuriten. </li><li> Berechnen Sie die Neuriten Kontaktfläche zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition: auf der Hellfeld Maßnahme die lange (L) und kurzen (D) Achsen des Neuriten zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition. Das Axon Kontaktfläche A Axon = L x D. </li><li> Normalisieren der gesamt freigelassene Kraft F Freigabe durch das Axon Kontaktfläche A Axon. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir berichten in dieser Arbeit eine quantitative Methode, um die Neuriten Haftung auf dem Substrat Kultur vergleichen, indem Sie gleichzeitig Kraft-Spektroskopie Messung während laserinduzierten Zelle Läsion. Die gemessene Freisetzung von Spannung auf den Grad der Haftung der Zellen an das Substrat bezogen werden: Zellen mit einer höheren Anzahl von fokalen Adhäsionen zu weniger Verspannungen. Die Messung der Freisetzung von Spannungen in Bezug auf Pikonewton bietet eine physikalische Größe, durch die die axonale Haftun...

Optische Mikroskopie ist eine der weniger invasiven bildgebenden System zur Verfügung zu lebenden Zellen zu beobachten. Mit der Nutzung von Effekten wie Strahlungsdruck (wie in einer optischen Pinzette 1) oder hochenergetischen Photonen-Flux (wie im Laser dissector 2) wurde diese Technologie, um Nano-Manipulation erweitert. Die optische Imaging-System liefert eine präzise Steuerung zu visualisieren und zu manipulieren sub zellulären Targets 3. Zur gleichen Zeit, dank der präzisen Kalibrierung des gelieferten Laserleistung, erreichen optischen Werkzeuge entweder weich oder invasive Probenmanipulation mit beispielloser Reproduzierbarkeit. Mehrere Labors integriert, in derselben Versuchsanordnung, optische Pinzetten und Laser Dissektor um Organellen 4, miteinander zu verschmelzen verschiedenen Zellen 5 oder Zellen durch optisch angetrieben Ladungen 6,7 stimulieren abzutragen. Während optische Pinzette, nach der Kalibrierung des optischen Steifigkeit, für erlaubendie Kontrolle der aufgebrachten Kraft auf die Zelle auf einer Skala Pikonewton können Laser Dissektion Systeme modulieren optische Manipulation, die von Membran Foto-ration der Ablation einzelner Organellen oder Dissektion der sub-zellulären Strukturen reicht. Jedoch beruht Laser Dissektion Kalibrierung auf qualitative Beurteilung der Einheit von optischen Manipulation in Bezug auf die Energie, die an die Probe, vor allem auf Bildanalyse veranschaulicht morphologischen Veränderungen verursacht, die dem Muster 8 basiert. In dem vorgestellten Verfahren zeigen wir, wie man Kraft-Spektroskopie Messung während des Laser axonal Dissektion einer sich entwickelnden Neuronen führen, zu quantifizieren, auf Pikonewton Skala, die Kraft durch eine veränderte Gleichgewicht im Zytoskelett-Struktur eines sub-zellulären Fach 9 produziert. Kultivierten Neuronen an dem Substrat haften, und während der Entwicklung zu polarisieren. Die Polarisation Phase tritt während der ersten fünf Tage in vitro. In Stufe zwei der Polarisierung, einer der Extrudering Neuriten länger wird, und es wird zu differenzieren, um das Axon 10 geworden. Axonal Dehnung in Reaktion auf Zugkraft am Wachstum Kegel wurde zuvor von Dennerl-Modell 11 modelliert. Vor kurzem ist dieses Modell 12 verlängert, um die Rolle von Neuriten Adhäsion an die extrazelluläre Matrix Substrate umfassen. Diese biophysikalische Modell nach experimentellen Beobachtungen 13 vorgeschlagen, zeigten, dass Zugkräfte auf das Wachstum Kegel, der sich entlang der Neuriten, moduliert von fokalen Adhäsionen zu dem Substrat. Ebenso produziert axonale Läsion eine lokale Freisetzung von Spannungen hin ausbreiten Zellkörper. So haben wir vorgeschlagen, dass die Messung solcher freigegeben Spannung an einem Ort entlang des Axons zwischen der Verletzung und der Zelle soma bietet die Möglichkeit, die dämpfende Ergebnis unberührt fokalen Adhäsionen zu bewerten. Wir kalibrieren die notwendige Energie Photon-Fluss des Lasers Dissektor, um das Ausmaß des zugefügten axonalen damag steuerne, von der kompletten Durchtrennung einer partiellen Läsion. Nach der Kalibrierung, wiederholten wir partielle Läsion der Axone von mehreren differenzierenden Neuronen und entwickelte das Protokoll, um die Spannung zu lösen quantifizieren und somit erhalten eine quantitative Parameter, um die Haftung der Axon auf das Substrat 14 zu schätzen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail die entwickelte Protokoll, das eine genaue experimentelle Verfahren zu ermitteln und zu vergleichen mit Pikonewton Empfindlichkeit des axonalen Haftung auf dem Substrat in verschiedenen experimentellen Bedingungen wie chemische Behandlung 14, oder verschiedene Arten von Zellkultur Unterstützung darstellt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Polymer-Mikrosphären, 4 &mu; m, COOH-beschichtet</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PC05N/6700</td><td></td></tr><tr><td>PolyLink Protein Coupling Kit</td><td>Polyscience</td><td>19539<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>IR-Laser</td><td>IPG Laser GmbH</td><td>YLM-5-SC-LP</td><td>Ytterbium-Dauerstrich (CW) Faserlaser mit 1064 nm, mit linearer Polarisation</td></tr><tr><td>Räumlicher Lichtmodulator</td><td>Hamamatsu</td><td>LCOS-SLM 10468-07</td><td></td></tr><tr><td>Software für blaue Pinzetten</td><td>Optics Group, University of Glasgow</td><td>Kostenlos herunterladbare Software</td><td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Hamamatsu</td><td>Kostenlos herunterladbare Software</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td></tr><tr><td>QPD</td><td>Thorlabs</td><td>S5980 mit C5460SPL 6041 Platine</td><td>Vier-Quadranten-Fotodiode zur Messung der Verschiebung der x, y-eingefangenen Sonde</td></tr><tr><td>PD</td><td>Teem Photonics</td><td>PDA100A-EC</td><td>Fotodiode zur Messung der z-gefangenen Sondenverschiebung</td></tr><tr><td>Nano-Puls-UV-Laser</td><td>AA-optoelctronics</td><td>PNV-001525-040</td><td>Gepulster UVA-Laser, Pulslänge 400 ps</td></tr><tr><td>Akustischer optischer Modulator</td><td>Olympus</td><td>MQ110-A3-UV, 355 nm Quarzglas</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Andor</td><td>BX51</td><td>Ausgestattet mit einem 60, 0,9 NA, Wassertauchobjektiv</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Warner Instruments</td><td>V887ECSUVB EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Peltier-Gerät</td><td>Physic Instruments</td><td>QE1 ohmsche Heizung mit TC-344B Zweikanalheizung Controller</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoptisch: Mikro+Piezotisch</td><td>National Instruments</td><td>Drei lineare Tische M-126. CG1 mit separatem piezoelektrischem 3-Achsen-Nanopositioniertisch P-733.3DD</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassung</td><td></td><td>NI PCI-6229</td><td>Erfassung der x-, y- und z-Position der gefangenen Sonde und Senden von Rückkopplungsschleifensignalen an den Mikroskoptisch</td></tr><tr><td>Linux Real Time Application Interface (RTAI)-Maschine</td><td></td><td></td><td>Echtzeit-Feedback-Schleifensystem zur Steuerung der Tischposition, entwickelt auf einem dedizierten PC-Desktop</td></tr></tbody></table>

messung der spannungsstifte während laser induced axon läsion axonal haftung auf dem substrat und auswerten zu pikonewton millisekundenauflösung

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Die Bildung von funktionalen Zusammenhänge in einem Entwicklungsland neuronale Netzwerk wird durch extrinsische Cues beeinflusst. Das Neuritenwachstum von sich entwickelnden Neuronen unterliegt chemische und mechanische Signale, und die Mechanismen, durch die er spürt und reagiert auf mechanische Signale werden kaum verstanden. Die Aufklärung der Rolle der Streitkräfte in Zell-Reifung wird das Design von Gerüsten, die Zelladhäsion und Zytoskelett-Kopplung mit dem Substrat zu fördern und damit die Verbesserung der Fähigkeit der verschiedenen neuronalen Typen nach einer Verletzung regenerieren. Hier beschreiben wir eine Methode, um die gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messungen während der Laser-induzierten Zell-Läsion gelten. Wir messen Spannung Release in der teilweise lädierten Axon durch gleichzeitige interferometrischen Tracking eines optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons. Unsere experimentellen Protokoll erkennt die Spannung Release mit Pikonewton Empfindlichkeit und die Dynamik der Spannung Freisetzung beiMillisekunden-Auflösung. Somit ist es ein hochauflösendes Verfahren zu untersuchen, wie die mechanischen Verbindungen zwischen den Zellen und Substrate moduliert werden kann durch medikamentöse Behandlung und / oder durch unterschiedliche mechanische Eigenschaften des Substrats.

Die Zelle erzeugt Zugkräfte auf dem Substrat durch die fokalen Adhäsionen. Kraft durch Zytoskelett Elemente erzeugt werden, sind im Gleichgewicht mit der Gegenkraft der Kultur Substrat. Nach laserinduzierten Läsion des Neuriten, sind einige der gespannten Zytoskelett Kabel gestört und ihre äquilibriert Spannung befreit wird, da die Gegenkraft der Haftung auf dem Substrat eliminiert wird. Das freigesetzte Spannung teilweise auf die nicht betroffenen fokalen Adhäsionen verteilt und die Wulst an der Zellmembran in einer op...

Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Adhäsion von Axonen an Substraten mit einer Empfindlichkeit im Piko-Newton-Bereich zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Hilfe von Lasern ein Mikrosphäre erfasst und neben ein isoliertes Neuron mit langem Neurit positioniert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kugel mit einem Infrarotlaser mittig über dem Axon zu platzieren.Anschließend wird die Steifigkeit der optischen Falle kalibriert, indem die Brownsche Bewegung der eingefangenen Perle interferometrisch verfolgt wird, bevor diese an das Neurit angeheftet wird. Der letzte Schritt besteht darin, Kraftmessungen während der Abgabe von UV-Laserimpulsen zur Läsion des Axons durchzuführen. Letztendlich kommt die Kraftspektroskopie zum Einsatz, um die Freisetzung der durch die Axonläsion erzeugten Spannung zu bewerten, was eine Abschätzung der axonalen Adhäsion an das Substrat darstellt.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber fluoreszeinbasierten Methoden besteht darin, dass sie einen physikalischen Parameter liefert. Die Kraft wird mit pikonewton-Empfindlichkeit gemessen, was einen direkten Vergleich der axialen Haftung an das Substrat unter verschied

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Anwendungs-und direkte Messungen von Kräften auf Neuronen im 2-1000 Microdyne Bereich sind mit hoher Genauigkeit kalibriert Glasnadeln erreicht. Diese Methode kann verwendet werden zur Steuerung und Messung verschiedene Aspekte der axonalen Entwicklung, einschließlich der axonalen Initiierung, axonale Spannung, Geschwindigkeit der axonalen Dehnung und Kraftvektoren werden.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Laser Axotomie gefolgt von Zeitraffer-Imaging ist eine sensible Art und Weise zum Testen der Auswirkungen von Mutationen...

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Dieses Video beschreibt die Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Axotomie und der Beobachtung der axonalen Erholung von Verletzungen.

Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

Das Video demonstriert eine Methode zur Bewertung von Rezeptorkräften, die von Immunzellen mit Polyethylenglykol-verankerten Goldnanopartikeln und DNA-Haarnadel-Zugsonden angewendet werden. CD8-positive T-Zell-Wechselwirkungen lösen die Entfaltung der Sonde aus und emittieren Fluoreszenz, während Verriegelungsstränge das Signal zur Quantifizierung der von Immunzellen ausgeübten Kräfte aufrechterhalten.

Verwendung von DNA-basierten Zugsonden zur Bewertung der von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte

Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zwei-Photonen-Anregungs-Zeitraffermikroskopie verwendet, um gleichzeitig die Dynamik von Axon- und Myelinverletzungen in Echtzeit zu visualisieren. Dieses vorgeschlagene Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren, die das Schicksal des zentralen myelinisierten Axons nach einer Verletzung beeinflussen und zu einer dauerhaften klinischen Behinderung beitragen können.

Ein Ex vivo Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte &gt;4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Lernen Sie die Kraftspektroskopie zur Messung axonaler Adhäsion an Substrate mit Pikoneuton-Sensitivität. Diese Methode nutzt optische Fallen und UV-Laser zur Präzisionsanalyse neuronaler Mechanik.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung (Video) | JoVE Journal

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

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