Name: Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Lernen Sie einen quantitativen DNA-Bindungsassay zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen mit Streptavidin-Platten und biotinylierten Oligonukleotiden. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Transkriptionsregulatoren und potenziellen Antitumor-Wirkstoffen.

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Die technische Unterstützung und Instrumentierung der Universität von Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, insbesondere Drs. Rena Lapidus und Mariola Sadowska, werden dankbar anerkannt. Die für die Entwicklung dieses Tests zuständig Arbeit wurde zum Teil durch die NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, eine VA Merit Award an AP, und von der Universität von Maryland Zigarette Restitutionsfonds (CRF) an der Marlene Stewart &amp; vorgesehen finanziert Greenebaum Cancer Center.

Mehrere Schritte werden vor der Zeit durchgeführt und mehrere Reagenzien hergestellt und gelagert, bevor das Verfahren: (1) Zellkultur und Proteinisolierung, (2) Herstellung von Oligonukleotid (3) Herstellung von 96-Well-Platten (4) Kernextrakt Inkubation über Nacht. Vorgehensweise benötigt 2 Tagen wegen der Inkubation über Nacht von Kernprotein mit DNA-Oligonukleotiden. 1. Herstellung von Puffern 1.1 Kernproteinisolierung <ol><li> Hypotonischen Puffer: Zu 100 ml hypotonischen Puffer vorbereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) auf 98,3 ml H 2 O. Endkonzentrationen: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl. Für Hypotone Puffer + NP40 (für den Einsatz in Schritt 2.11): 0,5 ml (10% NP40) auf 9,5 ml hypotonischen Puffer für die letzten 0,5% NP40. </li><li> Niedrigsalzpuffer: Zu 100 ml Niedrigsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 &amp;mgr; l (1 M MgCl 2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 73 ml H 2 O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> Hochsalzpuffer: Zu 100 ml Hochsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 ul (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 47 ml H 2 O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> 10% NP40-Detergens: 10 ml NP40 bis 90 ml H 2 O </li><li> Protease-und Phosphatase-Inhibitoren [zum hypotonischen Puffer + NP40 (Schritt 2.11), um Niedrigsalzpuffer (Schritt 2.15) und der hohen Salzpuffer (Schritt 2.15) unmittelbar vor der Verwendung]: In 2,5 ul (1 M DTT) und 50 ul Proteaseinhibitoren (100x), 5 ml jedes Puffers für Endkonzentration von 0,5 mM DTT und 1x Proteaseinhibitoren. Der Protease-Inhibitor 100x Stock Mischung beinhaltet:Natriumfluorid (Ser / Thr, saure Phosphatasen), Natriumorthovanadat (Tyr, alkalische Phosphatasen), β-Glycerophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Natriumpyrophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Aprotinin (Ser Proteasen), Bestatin (Amino-Peptidasen ), E64 (Cystein-Proteasen), Leupeptin (Ser / Cys Proteasen), EDTA (Metalloproteasen). </li></ol> 1.2 Vorbereitung der Testplatten <ol><li> Plattenbefestigungslösung: So bereiten Sie 500 ml Lösung werden 5,25 g Natriumcarbonat in 500 ml H 2 O, gut mischen und pH-Wert auf 9,7 für eine endgültige Konzentration von 0,1 M Natriumcarbonat. </li><li> Teller Blockierlösung: Zur Herstellung von Poly Lager dI / dC Oligonukleotid, resuspendieren 1 Unit (~ 50 mg) von Poly dI / dC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, der 1 mM EDTA für eine Stammkonzentration von 50 ug / ul. Stock ist bis 1 ug / ul vor der Verwendung verdünnt. </li></ol> 1.3 Waschpuffer und Antikörperverdünnungen HINWEIS: Streptavidin Waschpuffer<html> verwendet werden, um Platten zwischen den Zugaben zu waschen und auf Primär-und Sekundärantikörper verdünnen. <ol><li> Um 1 l Streptavidin Waschpuffer, mit 2.4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), auf 1 Liter Millipore-Wasser sterilfiltriert , pH 7,18. Lagern bei 4 ° C Endkonzentration: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 DNA-Bindungspuffer HINWEIS: Dieser Puffer wird bei -20 ° C gelagert <ol><li> Die Bereitstellung von DNA 15 ml Bindungspuffer, fügen 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 &amp;mgr; l (1 M DTT), 3,0 ml (60% Glycerin), 300 &amp;mgr; l (50 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l poly dI / dC) mit entionisiertem / destilliertem H 2 O (12 ml) verdünnt. Endkonzentrationen: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% Glycerin, 1 ug / ul Poly dI / dC. </li></ol> 2. Zellkultur und Kernproteinisolierung t &quot;&gt; Hinweis: Die Herstellung erfordert etwa 3 h Stimulation von Zellen auf Experiment hängen die Anzahl der Zellen für jedes Experiment variieren und alle Volumen reflektieren ein typisches Experiment unter Verwendung von 3 × 10 7 Zellen / Punkt einstellen Volumen unterzubringen... die Anzahl der Zellen tatsächlich in dem Experiment 6 verwendet. <ol><li> Um Kernprotein für die DNA-Bindungsassays, die Kultur, die menschliche Zellen RUNX2 (Endothel-, Osteosarkom, Brustkrebs-Zellen) in geeigneten Medien 6 exprimieren. </li><li> Gönnen subkonfluente Zellen mit Nocodazol (0,2 ug / ml für 16 Stunden) zu den Zellen in der G2 / M Zellzyklus Grenze 6 verhaften. Unter diesen Bedingungen wird das Protein stabilisiert RUNX2 und maximale DNA-Bindung erreicht wird. Auf diese Weise ist genug Kernprotein für mehrere Tests und Inhibitoren können aus dem gleichen Präparat verglichen werden, zur Verfügung. </li><li> Für jeden Schritt, Pre-kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C und bereiten Puffer und Chill 20 min bei 4 ° C vor der Zellernte.</li><li> Chill-Zellen (4 ° C) und die Durchführung Verfahren auf Eis. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1000 rpm für 5 min in einem 15 ml Polypropylen-Rundrohr. </li><li> Wash 1x mit eiskaltem PBS (Ca 2 + und Mg 2 +-frei). </li><li> Zentrifuge wieder und entsorgen PBS Stand. </li><li> Add 500 ul hypotonischen Puffer ohne Protease-Inhibitoren, wobei darauf geachtet, das Zellpellet vollständig zu suspendieren. </li><li> Übertragen Inhalt in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Unmittelbar bei 5.500 rpm für 5,5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und halten das Zellpellet. </li><li> Zellpellet in 500 ul hypotonischen Puffer, der 0,5% NP40. Hinzufügen Protease-und Phosphatase-Inhibitoren und 0,5 mM DTT (wie in Schritt 1.1.5 beschrieben). </li><li> Die Probe wird auf Eis für 30 Minuten ruhen. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 rpm für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand (enthält die cytosolische Proteine). </li><li> Resuspendieren Sie das Kernpellet in jeweils geringer sal 60 ult-Puffer (um die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) und Hochsalz-Puffer (auf die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) für eine Gesamtmenge von 120 ul. In 60 ul Niedrigsalzpuffer zum Pellet ersten und resuspendieren, dann fügen Sie 60 ul Hochsalzpuffer. Mischen Sie den Pellet an der Aufwirbelung unterstützen. </li></ol> HINWEIS: Dieser Schritt hilft loszuwerden einige der Kernmembran-Proteine ​​und bis zur Lyse Schritt gesetzt: niedrige Salz ersten (Pellet erneut, Vortex), so hohe Salz (Vortex) optimiert diesen Schritt. Halten Extrakt auf Eis für 30 min, unter Verwirbelung nach den ersten 10 min. <ol start="16"><li> Zentrifuge bei 12.000 rpm für 15 min; halten den Überstand mit dem Kernprotein. </li><li> Messen Proteinkonzentration (versuchen, um Proben bei 2-5 mg / ml zu halten), aliquoten in entsprechenden Mengen (10 ul / Röhrchen) und bei -80 ° C </li></ol> HINWEIS: Geschätzte Ausbeute: 30 x 10 6 cells 5 ug / ul Protein in 120 ul ergeben. 5 x 10 6 Zellen 2,2 ug / ul Protein in 40 ul ergeben. 3. Vorbereitung der Doppel Oligonukleotid <ol><li> Entwerfen komplementäre Oligonukleotide mit kompatiblen Halbstellen an den Enden. Für RUNX2 diese sind: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-Biotin (Sinn) und 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-Biotin (Antisense). </li></ol> HINWEIS: Pilotversuche festgestellt, dass drei RUNX2 Bindungsstellen und Single-Ende Biotin ergab die meisten reproduzierbare Ergebnisse. <ol start="2"><li> 5x herzustellen Annealing-Puffer: In 300 &amp;mgr; l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 &amp;mgr; l (1 M MgCl 2), 10 &amp;mgr; l (1 M DTT) und 260 &amp;mgr; l H 2 O (600 &amp;mgr; l final). </li><li> Zu 200 pmol von jedem Einzelstrang-oligonucleotide (3 ul), fügen Sie 12 ul 5x Annealing-Puffer und 45 ul H 2 O für insgesamt 60 ul (200 pmol/60 ul). </li><li> Hitze bei 95 ° C für 5-10 min in einem Heizblock. </li><li> Abkühlen auf 65 ° C langsam (durch Einstellen der Temperatur auf 65 ° C, dauert es 15 min), dann auf Raumtemperatur langsam durch Abschalten der Leistung der Wärmeblock (oder indem Sie in 50 ml 65 ° C Wasser in einem Becherglas auf Eis, dies dauert 15-20 min). </li></ol> 4. Herstellung von 96-Well-Platten HINWEIS: Verwenden Sie keine Milchproteine ​​in den Waschpuffer. <ol><li> Fix Platte mit Befestigungslösung (0,1 M Natriumcarbonat): add 300 ul /. </li><li> Inkubation für 2 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur (RT) oder kein Schütteln bei 4 ° C (O / N). </li><li> Waschen Platte 3x mit Streptavidin Waschpuffer (WB): add 300 ul / jeder Zeit. </li><li> Hinzufügen Biotin-markierten doppelsträngigen Oligonukleotids (3 Konsensus-Bindungsstellen pro Nukleotid) für 2 h with Schaukel (1,25 nmol / gut; 100 ul / Vertiefung). </li><li> 3x Waschen mit kaltem WB: add 300 ul / und dann sofort die Platte umzukehren in eine Senke und tupfen Sie die Kanten auf einem Papiertuch nach jeder Zugabe. </li></ol> HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um Flüssigkeit von den Platten zu entfernen, da dies zu kratzen Avidin: Biotin: DNA-Komplexe aus den Vertiefungen. Tun Sie dies für alle nachfolgenden Waschschritte. 5. Inkubation mit Kernextrakt HINWEIS: Sie ersetzen nicht Lachs oder Hering-Sperma-DNA für die Poly dI / DC-Blockpuffer. Vermeiden Sperrplatten mit Milchproteinen. Beide Blockierungsmittel führen zu einer hohen Hintergrundwerten. <ol><li> Inkubation mit spezifischen Transkriptionsfaktor aus der Kernextrakt (90 ul /) erstellt. Erstellen Sie einen Master-Mix mit Kernextrakt (DNA-bindendes Protein, 3-9 g / gut) + Poly dI / dC (1 ug / ul von einer 50 ug / ul Lager) in 1x DNA-Bindungspuffer. Volumen wird als die Gesamtzahl der benötigtenBrunnen erforderlich (90 ul / Vertiefung). </li><li> Einem potentiellen Inhibitor, wie z. B. Vitamin D3 (Fig. 2) oder CADD Verbindung 5221975 (Fig. 3) oder der geeigneten Verdünnung der Lösungsmittelkontrolle, wie Ethanol, wird in diesem Schritt zugegeben. </li><li> Legen Sie die Platte auf Schaukel Plattform, O / N bei 4 ° C </li><li> 3x Waschen mit WB: add 300 ul / </li></ol> 6. Zugabe des primären Antikörpers HINWEIS: Primärantikörperverdünnungen sollte frisch zubereitet werden - Speicher wird nicht empfohlen. <ol><li> Verdünnen RUNX2-spezifische monoklonale Antikörper (Lager 1 ug / ul) 5.1, 000 in Streptavidin-Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug. </li><li> Inkubation für 1 h bei RT auf einer Schwingplattform. </li><li> 3x Waschen mit WB, fügen Sie 300 ul /. </li></ol> 7. Zugabe von sekundärem Antikörper HINWEIS: Sekundärantikörperverdünnungen können sto seinrot bei 4 ° C über Nacht bei Bedarf am nächsten Tag. <ol><li> Verdünnen F ab-spezifische Affinität gereinigt HRP-konjugierte Antikörper (7,1 mg / ml Stamm) bis 1:1,400 in Streptavidin-Waschpuffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug. </li><li> Inkubation 30 min bei RT auf einer Schwingplattform. </li><li> Wash 6x mit WB durch Umdrehen der Platte in Enke (300 ul / Vertiefung). </li></ol> 8. HRP-Substrat-und Produktentwicklung <ol><li> In 50 ul TMB-Substrat pro Vertiefung direkt ab Lager Flasche. </li><li> Inkubation 10-20 min bei RT im Dunkeln (Stop-Reaktion-Methode) oder die Messung der Extinktion direkt (kontinuierliche Bewegungsüberwachung). </li></ol> 9. Reaktionsmessung <ol><li> Stoppen Reaktionsverfahren: Für die visuelle Stopp-Reaktion, überprüfen Sie Farbwechsel von blau und klar zu stoppen Reaktion mit 50 ul Schwefelsäure. </li><li> Messung der Extinktion bei 450 nm mitdie Biotrak II Visible Plattenleser Spektralphotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) oder ein ähnliches Instrument. </li><li> Kontinuierliche Überwachung kinetische Methode: Fügen Substrat nach dem letzten Waschen und kurz vor der Platzierung im Spektralphotometer (nicht die Reaktion zu stoppen). </li><li> Extinktion bei 635 nm mit dem Bio-Tek Synergy HT Multi-Reaktionsmikroplatten-Reader Spektralphotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) oder ein ähnliches Instrument. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li>
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	Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf">http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf</a> (2007).</li>
<li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21(2001).</li>
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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) 1 und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays 2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte (32 P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungskomp...

DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide 1 oder 2 Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine ​​assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Polyacrylamid-Gelen verzögert und die spezifische Transkriptionsfaktor kann mit einem Antikörper &quot;Supershift&quot; validiert werden. Wir haben eine quantitative DNA-Bindungsassay unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Format (D-ELISA), die in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente zu messen, ist entwickelt in RUNX2 Zielgene. Verwendung eines Anti-Antikörpers enthält RUNX2 Spezifität des Assays und der Mangel an Radiomarkierung zeichnen diesen Assay vom herkömmlichen Gel-Shift-Assay-5. Nachweis von Bindungskomplexen ist mit der Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine HRP-Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in ein gefärbtes Produkt spektrophotometrische Analyse umwandelt möglich. Der Test hier berichtet die Verwendung von mutierten DNA-Oligonukleotide als Kontrolle übernehmen und kann zum Nachweis von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren der DNA-Bindung verwendet werden. Das Screening von neuen Anti-Tumor-Verbindungen ist ebenfalls mit diesem Assay möglich.

<table><tbody><tr><td>Poly dI/dC</td><td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td><td>US20539-5UN</td><td>1 U ~50mg</td></tr><tr><td>RUNX2 Antikörper</td><td>MBL International Corp., Woburn, MA</td><td>D130-3</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Fab-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9917</td><td>7,1 mg/ml</td></tr><tr><td>TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin)</td><td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td><td>X1189S</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>57995</td><td>Plattenfixierende</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>VWR, West Chester, PA</td><td>BDH-39922-1</td><td>Stopplösung</td></tr><tr><td>Multi-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One, Basel, Schweiz</td><td>655996</td><td>Avidin-beschichtete, schwarze Seiten</td></tr><tr><td>HALT</td><td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td><td>78440</td><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitoren</td></tr><tr><td>Chemikalien</td><td>Verschiedene Hersteller</td><td>Laborqualität</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 1. Reagenzien</stark></td></tr><tr><td>Spektralphotometer: Biotrak II Reader für sichtbare Platten</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td>Zur Verwendung mit der Stoppreaktionsmethode</td></tr><tr><td>Spektralphotometer: Bio-Tek Synergy HT Multireaktions-Mikroplatten-Reader</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td><td></td><td>Zur Verwendung mit kontinuierlicher kinetischer Überwachung</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 2. Ausrüstung</stark></td></tr></tbody></table>

eine quantitative assay zur protein studie: dna-wechselwirkungen, discover transkriptionsregulatoren der genexpression, und identifizieren novel anti-tumor-wirkstoffe

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.

Die D-ELISA-Verfahren ist hochspezifisch für die bezeichnete DNA-Bindungsprotein, solange eine sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid drei Kopien des Konsensus RUNX2 Bindungsstelle (ACACCA) enthält, verwendet wird. Der primäre Antikörper, der das Protein Faktor erhöht auch die Spezifität. Der sekundäre Antikörper enthält kovalent gebundenen Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine klare Substrat (Tetramethylbenzidin) zu einem farbigen Produkt für einfache Erkennung (Abbildung 1) umwandelt. A...

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen quantitativen DNA-Bindungs-Assay zu demonstrieren, der zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren der Genexpression sowie zur Entdeckung neuer Antitumor-Arzneistoffe nützlich ist. Dies wird zunächst durch die Herstellung einer mit Streptavidin beschichteten Testplatte mit einem geeigneten BIOTINYLIERTEN DNA-Ziel erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, Proteine aus nukleären Extrakten mit oder ohne potenzielle Inhibitoren hinzuzufügen und sie mit dem DNA-Ziel binden zu lassen.Anschließend werden die gebundenen Transkriptionsfaktoren mit primären Antikörpern und mit Pferderadischen-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Im letzten Schritt wird ein Substrat für die Pferderadischen-Peroxidase in die Vertiefungen gegeben, um eine Farbentwicklung auszulösen. Abschließend wird die Farbentwicklung mit dem Spektralphotometer gemessen.Im Laufe der Zeit zeigt das Ausmaß der Farbänderung den Grad der DNA-Bindung sowie die Wirkung potenzieller Inhibitoren der DNA-Bindung an. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Verfahren, wie beispielswei

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Biology

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Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Dieses Video zeigt einen in vivo Assay in Bakterien, um die Interaktion von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit RNA zu untersuchen. Die Bakterienzellen werden mit zwei Plasmidkonstrukten transformiert – einem Plasmid an der Bindungsstelle, das für eine mRNA kodiert, die ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts einer RBP-Bindungsstelle enthält –, während ein RBP-Plasmid die RBP-Proteine unter der Kontrolle eines Induktors exprimiert. Bei einer durch Induktoren vermittelten Erhöhung der...

Reportergen-Repressionsassay zur Untersuchung der translationalen Regulation eines Zielgens

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Lernen Sie einen quantitativen DNA-Bindungsassay zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen mit Streptavidin-Platten und biotinylierten Oligonukleotiden. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Transkriptionsregulatoren und potenziellen Antitumor-Wirkstoffen.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe (Video) | JoVE Journal

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

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