Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen quantitativen DNA-Bindungsassay zu demonstrieren, der bei der Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen, der Entdeckung von Transkriptionsregulatoren der Genexpression und der Identifizierung neuer Anti-Tumor-Wirkstoffe nützlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Streptavidin beschichtete Assay-Platte mit einem geeigneten BIOTINYLIERTEN DNA-Target hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Kernextraktproteine mit oder ohne potenzielle Inhibitoren hinzuzufügen und sie an das DNA-Ziel binden zu lassen.

Anschließend werden die gebundenen Transkriptionsfaktoren mit Primärantikörpern und Meerrettichperoxidase-gekoppelten Sekundärantikörpern nachgewiesen. Der letzte Schritt besteht darin, ein Meerrettichperoxidase-Substrat in die Vertiefungen zu geben, um die Farbentwicklung hervorzurufen. Letztendlich wird die Farbentwicklung mit dem Spektralphotometer gemessen.

Im Laufe der Zeit zeigt das Ausmaß der Farbänderung den Grad der DNA-Bindung und die Wirkung potenzieller Inhibitoren der DNA-Bindung an. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Techniken, wie z. B. dem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assay, besteht darin, dass es sich um einen quantitativen DNA-Inhibitor-Bindungsassay handelt. Bereiten Sie zunächst eine ausreichende Anzahl von Zellkulturen vor, die aus mindestens drei mal 10 bis sieben Zellen für jede getestete Bedingung bestehen.

Hier werden humane Knochenmark-Endothelzellen verwendet, die das Run X zwei Protein exprimieren. Sobald die Zellen zu 80% zusammenfließen. Behandeln Sie die Zellen mit 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, kein Conazol, um das Zellwachstum an der Grenze des G-2-M-Zellzyklus zu stoppen.

Dies stabilisiert das Laufprotein X zwei und erzeugt nach 16 Stunden eine maximale DNA-Bindung. Lycieren Sie die Zellen und isolieren Sie das Protein gemäß den Anweisungen im begleitenden Textprotokoll. Sobald das Protein isoliert wurde, messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Standard-BCA-Assay.

Anschließend lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius in 10-Mikroliter-Aliquoten mit Konzentrationen zwischen zwei und fünf Milligramm pro Milliliter. Fixieren Sie eine 96-Well-Platte mit einer 0,1 molaren Lösung von Natriumcarbonat, indem Sie 300 Mikroliter der Mischung pro Ton hinzufügen. Gut Bereiten Sie so gut vor, dass jede Probe in dreifacher Ausfertigung ausgeführt wird.

Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Platte dreimal mit 300 Mikrolitern Streptokokken und Waschpuffer und inkubieren Sie mit 100 Mikrolitern biotinmarkierten doppelsträngigen Oligonukleotiden bei 1,25 Nanomol pro Vertiefung für zwei Stunden unter Schaukeln. Waschen Sie die Platten anschließend drei weitere Male mit dem Streptokokken-Din-Waschpuffer.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter pro Vertiefung des Mastermixes hinzu, der einen XDNA-Bindungspuffer, DNA-Bindungsproteine mit drei bis neun Mikrogramm pro Vertiefung und Poly-DIGC mit einem Mikrogramm pro Vertiefung enthält. Geben Sie dann den Mastermix, der einen potenziellen Inhibitor wie Vitamin D drei oder die entsprechende Verdünnung des Lösungsmittels, wie z. B. Ethanol, enthält, in die jeweiligen Vertiefungen. Decken Sie dann die Platte ab und stellen Sie sie nach der Inkubation mit den Kernextrakten über Nacht bei vier Grad Celsius auf eine schaukelnde Plattform.

Waschen Sie den Teller dreimal mit dem Strep Avid und dem Waschpuffer. Fügen Sie dann 90 Mikroliter pro Vertiefung eines Laufs X zwei spezifische monoklonale Antikörper hinzu, die auf 0,2 Nanogramm pro Mikroliter verdünnt sind, sowie Streptokokken und Waschpuffer. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform.

Spülen Sie dann die Vertiefungen erneut mit Streptokokken-Avid- und Waschpuffer und fügen Sie 90 Mikroliter pro Vertiefung des Sekundärantikörpergemisches hinzu, das fünf Nanogramm pro Mikroliter enthält, einen Fab-spezifischen, affinitätsgereinigten, HRP-konjugierten Antikörper, der in der Streptokokken verdünnt ist. AVID und Waschpuffer. Inkubieren Sie den Sekundärantikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippplattform.

Waschen Sie es dann sechsmal mit 300 Mikrolitern Strp pro Mulde und Waschpuffer. Entwickeln Sie als Nächstes die Ergebnisse, indem Sie 50 Mikroliter eines Tetraethylbenadin-Substrats direkt aus der Vorratsflasche in jede Vertiefung geben, um die Proben kontinuierlich zu überwachen. Legen Sie die Proben in das Spektralphotometer und messen Sie die Extinktion kontinuierlich bei 635 Nanometern.

Für eine einmalige Messung inkubieren Sie die Proben 10 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Während dieser Zeit sollten die Vertiefungen von klar zu unterschiedlichen Blaugraden wechseln. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeweils 50 Mikroliter Schwefelsäure hinzufügen.

Messen Sie dann die Absorption jeder Vertiefung bei 450 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenlesegerät. Die hier gezeigte Grafik ist ein Beispiel für die kontinuierliche Überwachung der Wirkung von biologisch aktivem Vitamin D 3 auf die Bindung von 2D NA im Lauf. Die getesteten Konzentrationen hatten nur einen geringen Einfluss auf die NA-Bindung von Run X 2D.

Obwohl andere Vitamin-D-Verbindungen gezeigt haben, haben drei Verbindungen dramatische Wirkungen. Die hier getestete Substanz 5 2 2 1 9 7 5 wurde mittels computergestütztem Wirkstoffdesign identifiziert. Bei der Prüfung zeigte die Substanz eine dosisabhängige Hemmung der Rux-2-Bindung von einem Nanomolar auf 100 Mikromolare 50% der renx-2D-NA-Bindung konnte mit nur 0,01 Mikromolar der Verbindung gehemmt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie den DNA-Bindungsassay durchführen und potenzielle Inhibitoren der DNA-Bindung testen.