Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen quantitativen DNA-Bindungs-Assay zu demonstrieren, der zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren der Genexpression sowie zur Entdeckung neuer Antitumor-Arzneistoffe nützlich ist. Dies wird zunächst durch die Herstellung einer mit Streptavidin beschichteten Testplatte mit einem geeigneten BIOTINYLIERTEN DNA-Ziel erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, Proteine aus nukleären Extrakten mit oder ohne potenzielle Inhibitoren hinzuzufügen und sie mit dem DNA-Ziel binden zu lassen.

Anschließend werden die gebundenen Transkriptionsfaktoren mit primären Antikörpern und mit Pferderadischen-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Im letzten Schritt wird ein Substrat für die Pferderadischen-Peroxidase in die Vertiefungen gegeben, um eine Farbentwicklung auszulösen. Abschließend wird die Farbentwicklung mit dem Spektralphotometer gemessen.

Im Laufe der Zeit zeigt das Ausmaß der Farbänderung den Grad der DNA-Bindung sowie die Wirkung potenzieller Inhibitoren der DNA-Bindung an. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Verfahren, wie beispielsweise dem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebe-Assay, besteht darin, dass es sich um einen quantitativen DNA-Inhibitor-Bindungs-Assay handelt. Zunächst bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von Zellkulturen vor, die jeweils mindestens dreimal 10 hoch sieben Zellen pro getesteter Bedingung umfassen.

Hier werden humane endotheliale Knochenmarkszellen verwendet, die das Runx2-Protein exprimieren. Wenn die Zellen zu 80 % konfluent sind, behandeln Sie die Zellen mit 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Nocodazol, um das Zellwachstum an der G2/M-Zellzyklus-Grenze anzuhalten.

Dies stabilisiert das Run X zwei Protein und führt nach 16 Stunden zu einer maximalen DNA-Bindung. Lyse die Zellen und isoliere das Protein gemäß der Anleitung im begleitenden Textprotokoll. Sobald das Protein isoliert wurde, bestimme die Protein-Konzentration mithilfe eines standardmäßigen BCA-Assays.

Dann lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius in 10-Mikroliter-Aliquoten mit Konzentrationen zwischen zwei und fünf Milligramm pro Milliliter. Fixieren Sie eine 96-Well-Platte mit einer 0,1-molaren Lösung von Natriumcarbonat, indem Sie 300 Mikroliter der Mischung pro Well hinzufügen. Bereiten Sie genügend Wells vor, sodass jede Probe im Dreifachansatz durchgeführt wird.

Die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einer wippenden Plattform inkubieren. Anschließend die Platte dreimal mit jeweils 300 µL Streptavidin-Waschpuffer waschen und mit 100 µL biotinylierter, doppelsträngiger Oligonukleotide (1,25 nmol pro Brunnen) zwei Stunden lang unter Schütteln inkubieren. Danach die Platten dreimal zusätzlich mit dem Strep-Din-Waschpuffer waschen.

Anschießend 100 µL pro Mulde der Master-Mix-Lösung zugeben, die einen XDNA-Bindungspuffer, DNA-Bindungsproteine in einer Konzentration von drei bis neun µg pro Mulde und poly DIGC in einer Konzentration von einem µg pro Mulde enthält. Danach den Master-Mix, der einen potenziellen Inhibitor wie Vitamin D3 oder die entsprechende Verdünnung der Lösungsmittelkontrolle, beispielsweise Ethanol, enthält, zu den jeweiligen Mulden hinzufügen. Anschließend die Platte abdecken und über Nacht auf einem schwingenden Inkubator bei vier Grad Celsius inkubieren, nachdem sie mit den nukleären Extrakten behandelt wurde.

Spülen Sie die Platte dreimal mit Streptavidin-Waschpuffer. Geben Sie dann pro Bohrung 90 Mikroliter eines 0,2 Nanogramm pro Mikroliter verdünnten monoklonalen Antikörpers der Verdünnungsreihe zwei in Streptavidin-Waschpuffer hinzu. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem schwingenden Plattformrührer.

Anschließend die Vertiefungen erneut mit Streptavidin- und Waschpuffer spülen und je 90 Mikroliter der sekundären Antikörpermischung zugeben, die fünf Nanogramm pro Mikroliter fab-spezifischen, affinitätsgereinigten, mit HRP konjugierten Antikörper enthalten, verdünnt in Streptavidin- und Waschpuffer. Die Inkubation des sekundären Antikörpers 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem schwingenden Plattformshaker durchführen.

Anschließend sechs Mal mit jeweils 300 Mikrolitern pro Brunnen Strp- und Waschpuffer waschen. Danach die Ergebnisse entwickeln, indem 50 Mikroliter eines Tetraethylbenzidin-Substrats direkt aus der Stammlösung zu jedem Brunnen hinzugefügt werden, um eine kontinuierliche Überwachung der Proben durchzuführen. Die Proben in das Spektrophotometer geben und kontinuierlich die Extinktion bei 635 Nanometern messen.

Für eine einmalige Messung werden die Proben 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Während dieser Zeit sollten sich die Farben in den Vertiefungen von klar bis zu unterschiedlichen Blautönen verändern. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 Mikrolitern Schwefelsäure zu jedem Ansatz.

Danach die Extinktion jedes Wells bei 450 Nanometern mithilfe eines 96-Well-Plattenlesegeräts messen. Der hier gezeigte Graph ist ein Beispiel für die kontinuierliche Überwachung des Effekts von biologisch aktiver Vitamin D3 auf die Run X 2D-NA-Bindung. Die getesteten Konzentrationen zeigten kaum einen Einfluss auf die Run X 2D-NA-Bindung.

Obwohl andere Vitamin-D-drei-Verbindungen bereits dramatische Wirkungen gezeigt haben, wurde die hier getestete Verbindung 5 2 2 1 9 7 5 mithilfe des computerunterstützten Wirkstoffdesigns identifiziert. Bei der Prüfung zeigte die Verbindung eine dosisabhängige Hemmung der Rux-zwei-Bindung im Bereich von einem Nanomolar bis 100 Mikromolar; 50 % der Renx-2D-NA-Bindung konnten bereits mit nur 0,01 Mikromolar der Verbindung gehemmt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut wissen, wie man den DNA-Bindungs-Assay durchführt und potenzielle Inhibitoren der DNA-Bindung testet.