Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung In vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, metallische Implantate auf mehreren Längenskalen zu modifizieren, um das Zellverhalten in vitro und in vivo zu kontrollieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Porengrößengradient in dreidimensionalen röhrenförmigen Implantaten erzeugt wird, die Biofreeze-Extraktionsmethode. Der zweite Schritt besteht in der Entwicklung von Nanofibrillären Basalmembran-Imitika auf der Grundlage von Kollagen- und Alginat-für-Schicht-Methodik.

Als nächstes eine indirekte Methode zur Überwachung solcher Implantate nach der Implantation mittels Blutplasmaanalyse. Mit der HPLC und der anschließenden Peptidsequenzierung wird letztendlich ein Implantat demonstriert, bei dem verschiedene Bereiche je nach Bedarf unterschiedliche Zelltypen aufnehmen können. Für einige können mehrzellige Gewebe erhalten werden, obwohl dieses System eine Möglichkeit bieten kann, metallische Implantate zu modifizieren.

Es kann auch auf 3D-Zellkulturmodellsysteme wie künstliches Gewebe oder Krankheitsmodelle angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir versuchten, eine Technik zu finden, um die Zellbewegung um poröse Titanimplantate in vivo zu kontrollieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, reinigen Sie die Implantate und entwerfen und fertigen Sie Teflonformen, wie im schriftlichen Text zum Einfrieren und Extrahieren beschrieben.

Bereiten Sie die synthetische Polymer-PLLA-Lösung in einem binären Gemisch aus Dioxin und Wasser vor, indem Sie das Polymerpulver in das organische Lösungsmittel einführen. Erhitzen Sie die Mischung auf einem magnetischen Starr auf 60 Grad Celsius, um eine homogene Lösung zu erhalten. Diese Temperatur wird gewählt, da sie die obere Grenze der Temperaturbeständigkeit für die Präzisionsglasspritzen darstellt, die für das Einbringen der Lösung in die Implantate verwendet werden sollen.

Berechnen Sie in der Zwischenzeit das Volumen der erforderlichen Polymerlösung in Bezug auf die Porosität des Implantats unter Berücksichtigung der Änderung des Volumens der gefrorenen Lösung. Als nächstes wird die Lösung mit Präzisionsglasspritzen mit einer Genauigkeit von 0,1 Mikrolitern in die Implantate eingeführt. Die untere Grenze für die Polymerkonzentration liegt bei 3 % für eine reproduzierbare PO-Gradientenbildung, oder da es schwierig wird, eine homogene Verteilung in den dicken Proben über 6 % zu erreichen, frieren Sie die Proben entweder direkt bei minus 80 Grad Celsius oder mit einer vorherigen Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur ein.

Frostbedingungen bestimmen teilweise die Porenbildung. So können die Gefrierbedingungen entsprechend der angestrebten Porosität eingestellt werden. Bewahren Sie die Proben über Nacht bei minus 80 Grad Celsius auf.

Die Trennung des Werkzeugs im gefrorenen Zustand ist ein sehr schwieriger Schritt. Es sollte darauf geachtet werden, den Kontakt der gefrorenen Bodenlösung mit der Form mit Hilfe einer Kopfhaut zu verringern. Tauchen Sie die Implantate in 80% vorgekühltes Ethanol, um Porositätsgradienten zu erhalten. Verwenden Sie ein vorgekühltes Skalpell, um alle Formteile mit Ausnahme des Dornkorns zu entfernen, für die röhrenförmigen Implantate und alle Teile außer dem unteren Teil für scheibenförmige Implantate, führen Sie die Extraktion bei minus 20 Grad Celsius über Nacht durch.

Entfernen Sie nach der Extraktion die restlichen Formteile und trocknen Sie die Implantate an der Luft. Zur Charakterisierung der Gesamtporosität der Struktur. Eine Quecksilberoximeter-Analyse ist notwendig.

In diesem Beispiel zeigen Quecksilberoximeter-Messungen deutliche Peaks, die den Poren auf beiden Seiten des Implantats und den kleineren interdispergierten Poren entsprechen. Die wichtigere Angabe ist jedoch die Differenz zwischen den Porositäten intraluminaler und extraluminaler Oberflächen, die mit Bild J auf die Porengrößenverteilung analysiert werden kann. Nach dem Frostbruch der Proben durch Beobachtung des Querschnitts mit einem Rasterelektronenmikroskop.

Aufgrund der offenporösen Natur der verwendeten Implantate und des Lichtreflexionsvermögens von Titan ist es möglich, Z-Stapel von markierten Zellen innerhalb der porösen Implantate herzustellen. Mit PKH 26 oder Calcium AM markierte Zellen können zur Visualisierung der Implantate mit konfokaler Lasermikroskopie für den Aufbau von Mehrschichtigkeiten verwendet werden. Höchste Reproduzierbarkeit wird mit Tauchrobotern erreicht.

Wenn jedoch kein Tauchroboter verfügbar ist, können diese Schritte manuell durchgeführt werden. Um die Kollagenlösung herzustellen, verwenden Sie medizinisches Kollagen Typ eins und Natriumalginat. Die optimierten Konzentrationen liegen bei 0,5 Gramm pro Liter für jeweils 150 Millimolar.

Natriumchloridcitratpuffer bei pH 3,8 löst die Kollagenlösung über Nacht auf, um die Homogenität zu gewährleisten. Die Lösung mit einem sauren pH-Wert von 3,8 ist für einen stabilen Aufbau der Schichten notwendig, da die Struktur instabil ist. Vor dem Cross-Linking.

In der pH-neutralen Ausführung ein spezieller Halter für die Verwendung der Implantate mit Tauchrobotern, die in der Polyelektrolyt-Mehrschichtproduktion eingesetzt werden. Die Schichten werden auf die Oberfläche von Implantaten nur aus Titan oder von Implantaten, die wie im Text beschrieben modifiziert wurden, abgeschieden. Mit einem Tauchrobotersystem werden die Implantate zunächst 15 Minuten lang in eine Alginatlösung getaucht und dann fünf Minuten lang mit 150 Millimolar Natriumchlorid bei einem pH-Wert von 3,8 gespült.

Anschließend 15 Minuten lang in eine Kollagenlösung eintauchen. Um die Basalmembran zu stabilisieren, bereiten Sie zuerst die Vernetzungslösung bei 100 millimolaren Genin vor. In A-D-M-S-O-Citratpuffer bei einem Volumenverhältnis von einem zu vier Volumenverhältnissen wird Genin in der DMSO-Komponente und dann in der Wasserkomponente gelöst, um ein Verklumpen zu vermeiden, und vernetzen Sie die Proben durch Eintauchen in die Vernetzungslösung zwischen 12 und 24 Stunden danach.

Spülen Sie mit reichlich Citratpuffer bei pH 3,8 Nach dem Waschen der Stufen sterilisieren Sie die Proben entweder 30 Minuten lang mit UV-Behandlung oder in einem antibiotischen Antimykotikumbad. Die Hauptparameter, die die Qualität der Basalmembran bestimmen, sind ihre Dicke und der Durchmesser der Fasern. Berechnen Sie die Faserdurchmesser mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie oder eines FM-Bildes, das im Kontaktmodus aufgenommen wurde.

Nach dem Trocknen der Proben mit einem Stickstofffluss wird vor der Bildgebung die Dicke von mindestens 10 Fasern pro Bild quantifiziert, um die durchschnittliche Fibrillendicke zu bestimmen. Mit der Software Image J kann nach dem Trocknen der Kollagen-Alginat-24-Doppelschicht-Kollagen-Mehrschichtfilme die Dicke der Schichten dann durch Kratztests bestimmt werden. Verwenden Sie zuerst einen FM, verwenden Sie eine Spritzennadel, um den Film nach der Lokalisierung des Kratzers mit einem Lichtmikroskop zu zerkratzen, und erhalten Sie Bilder mit einem FM auf 10 x 10 Quadratmikrometern großen Oberflächen an der Grenze des Kratzers.

Berechnen Sie die Höhen aus den Profilen, die mit der Software A FM erhalten wurden, die die Dicke der Folienschicht liefert. Nachdem Sie das Gerät wie im Text beschrieben in die Luftröhre der Kaninchen implantiert haben, entnehmen Sie Blutproben aus ihren Ohrvenen und zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 U/min für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Für die Analyse ist der Überstand zu verwenden, der nach Extraktion des Kaninchenplasmas mit 0,1 % Trioressigsäure erhalten wurde.

Führen Sie eine Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des Plasmaproteingehalts durch, indem Sie den Extrakt mit einer Zellkernzell-Umkehrphase 305 C 18-Säule reinigen. Erfassen Sie die Extinktion bei 214 und 280 Nanometern unter Verwendung des Lösungsmittelsystems und der Durchflussrate, die im Textprotokoll angegeben sind. Sammeln Sie die Peakfraktionen, bevor Sie sie durch Verdampfung konzentrieren.

Bei der Anwendung des Schnellvakuums ist es wichtig, das Schnellvakuum vor dem vollständigen Trocknen zu stoppen. Korrelieren Sie die Peaks, die zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Implantationszeit erzielt wurden. Verwenden Sie die gereinigten Peptide, die im Verlauf der Implantation konsistente Trends zeigen, zur Identifizierung durch automatische Edmond-Sequenzierung.

Laden Sie die Probe in mit Polyhirn behandelte Glasfaserfilter, bestimmen Sie die Endsequenz der gereinigten Peptide durch automatischen Edmond-Abbau mit einem professionellen Mikrosequenzierer. Der nächste Schritt ist die Identifizierung der Aminosäuren Phenyl th und 1 durch Chromatographie auf einer C 18 Säule. Nachdem die Sequenz erhalten wurde, kann sie mit Hilfe der Blast-Software unter Verwendung der Swiss Prote-Datenbank identifiziert werden.

Durch Ändern der Konzentration der PLLA-Lösung ist es möglich, die Größe der Poren auf der extra luminalen Seite der Implantate zu steuern. Die Porengröße und -form wurde durch das Vorhandensein von Titanimplantaten erheblich beeinflusst. Die Porengrößen reichten von 40 bis 100 Mikrometern, wobei niedrigere Konzentrationen zu kleineren Poren führten, während die intraluminale Seitenporengröße durch die eingeschränkte Extraktion bestimmt wurde und etwa neun Mikrometer betrug, was unter der durchschnittlichen Größe von Fibroblasten liegt.

Durch Hinzufügen eines Inkubationsschritts bei Raumtemperatur können doppelporöse Strukturen erhalten werden, bei denen die Porenwände der größeren Poren ihre eigene Porosität haben. Diese Eigenschaft ist wichtig für dicke Implantate, da sie die Gas- und Nährstoffbewegung erleichtern würde. Nachdem sich der Porengradient gebildet hat, ist es möglich, die Kollagen-Alginat-Filmschicht auf die Struktur aufzubringen.

Diese Filmschicht ist stabil auf dem PLLA-Schaum und kann auch in Abwesenheit des Schaums auf der Oberfläche gehalten werden, wenn sich nanoskalige Kollagenfasern bilden. Wenn die Folienschicht wächst, ist das Wachstum der Folie exponentiell. So kann ein dicker Film von mehreren hundert Nanometern erhalten werden.

Poröse Titanimplantate integrieren sich in das Wirtsgewebe und sind zwischen vier und sechs Wochen in vivo vollständig gefüllt, wie die explantierten Implantatquerschnitte zeigen. Das Gewebe in den Poren ist ein reifes Bindegewebe mit einem guten Grad an Vaskularisation. In diesem Zeitraum zeigte die HPLC-Analyse deutliche Peaks, die im zeitlichen Verlauf der Implantation schwankten.

Die interessierenden Spitzenfraktionen wurden sequenziert und als Alpha- und Beta-Hämoglobin-Halbketten bestimmt, die einen ähnlichen Trend bei den C-reaktiven Proteinmessungen gezeigt hatten. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 3D-Multiskalen-PO-Gradienten für die Modifikation von metallischen Implantaten und für Zellkulturexperimente erzeugt.

Gefrierextraktion und Schicht durch die Filmbildung sind einfache Metalle, um eigene modifizierte Implantate oder Mikroumgebungen für Zellen zu entwickeln.