Name: Betrieb einer Tischbioreaktor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-12T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Lernen Sie den Aufbau und Betrieb eines Tischbioreaktors für die großtechnische Kultivierung bioengineerter Zellen. Diese Methode zeigt Kalibrierung, Sterilisation und Überwachung kritischer Parameter.

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Dieses Projekt war Teil durch Unterstützung der Johns Hopkins University, Büro des Provost durch die Gateway-Science Initiative.

<ol><li> Beginnen Sie den Betrieb mit Gefäß-Setup. Ein herkömmlicher Fermenter besteht aus folgenden Komponenten, die auf (Abbildung 1) installiert werden müssen: <ol><li> pH-Sonde - für die Messung von pH-Wert in der Live-Kultur. Kalibrieren Sonde vor der Installation und sterilisieren mit dem Gefäß. Installieren Sonde in der Kopfplatte. </li><li> pO 2-Sonde - für die Messung von gelöstem Sauerstoff im Inneren des Schiffes während der Gärung. Installieren Sie in der Kopfplatte. </li><li> Ernte-Rohr zum Abtasten der Kultur. Installieren Sie dieses höhenverstellbar Komponente in der Kopfplatte. </li><li> Gasverteiler - liegt am Boden des Behälters und liefert Gas Infusion zu der Kultur. Haken Sprinkler bis zu der Gasquelle auf der Fermenter und montieren in der Kopfplatte. </li><li> Laufrad Welle und Laufrad - das Laufrad rührt die Kultur und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Einheitlichkeit Kultur im Behälter. </li><li> Abgaskühler - zur Verminderung der Verdampfungsverlust im Behälter durch Abkühlen der Abgasweg. </li><li> Reagenz Pumpleitungen zur pH-Kontrolle oder Futtermittel hinaus. </li></ol></li><li> Reinigen Sie das Schiff und Kopfplatte mit Wasser und Seife. Eine weiche Bürste zum Waschen des Gefäßes und Kopfplatte empfohlen. Bleich-oder Reinigungsmittel mit Chlor kann verwendet werden, um den Behälter zu reinigen. </li><li> Wenn die Medien nicht hitzelabil sind, fügen Sie ihn der sauberen Gefäß. Fügen Sie nur, bis die maximale Arbeitsvolumen erreicht ist. In diesem Fall beträgt die maximale Arbeitsvolumen 3,3 L für einen 5 l Gesamtvolumen Gefäß. </li><li> Montieren Sie das Gefäß Kopfplatte, so dass der O-Ring-Dichtung richtig sitzt. </li><li> Installieren Sie den Abgaskondensator. </li><li> Installieren Sie die Antischaumsonde in die 10 mm-Anschluss. </li><li> Installieren Sie das Rohr in seine Ernte 10 mm Port. Setzen Sie ein Stück Schlauch auf der Oberseite der sie und klemmen Sie sie ab. </li><li> Installieren Schläuche und einen 0,20 um Filter auf der Einlassspülung und dann klemmen Sie diese aus. </li><li> Kalibrieren Sie die pH-Sonde: <ol><li> Sammeln Sie 2 Referenzpuffer in kleinen Bechern, einer Waschflasche und ein Ersatz wash Becher. </li><li> Haken Sie die pH-Sonde bis in den Fermenter und drehen Sie den Fermenter auf. </li><li> Blättern Sie auf den Parameter pH-Wert und mit der Menütaste, blättern Sie zu der Option &quot;Cal&quot; und drücken Sie &quot;Enter&quot;. </li><li> Wählen Sie &#39;2 &#39;für 2-Punkt-Kalibrierung. </li><li> Waschen Sie die Sondenspitze und tauchen in der niedrigen Referenzpuffer. Der Wert auf dem Fermenter stabilisieren. Über die Tasten + und -, stellen Sie den angezeigten Wert auf den Wert der pH-Referenz-Puffer entsprechen. Sobald es aufhört zu blinken, drücken Sie &quot;Enter&quot;. </li><li> Waschen Sie die Sonde ab und legen Sie sie in der zweiten Referenzpuffer. Lassen Sie den Wert zu stabilisieren und dann über die Tastatur, um die angezeigte Wert entsprechen den hohen Referenzpufferwert. Drücken Sie &quot;Enter&quot; bestätigen. </li><li> Waschen Sie die Sondenspitze aus und ziehen Sie es aus dem Fermenter. Setzen Sie die Schutzkappe für den Anschluss und installieren Sie es in der Kopfplatte. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die pO 2 Sondenspitze und zu überprüfen, um sicherzustellen, dass esist genug, Elektrolyt, um die Spitze zu decken. Falls nicht, fügen Sie einige in den Vorratsbehälter und schließen Sie es wieder auf. </li><li> Installieren Sie die pO 2-Sonde in der Kopfplatte und stellen Sie sicher, dass der Autoklav Kappe auf seiner elektrischen Verbindungen zu schützen. Es wird nach der Sterilisation zu kalibrieren. </li><li> Besorgen Sie sich eine Flasche für Reagenz-Feed mit einem Tauchrohr und Luftfilter. In Pumpschlauch auf dem Tauchrohr-Anschluss und das andere Ende an den Einlass-Anschluss auf der Fermenter. </li><li> Platz Schlauch auf alle unbenutzten Ports klemmen Schlauch aus. </li><li> Installieren eines 0,45 &amp;mgr; m auf der Abgaskühler. Dieser Filter sorgt dafür, dass das Schiff nicht im Autoklaven unter Druck. </li><li> Prüfen, ob alle Rohre, die unter dem Niveau der Medien gehen werden abgeklemmt, Medien aus Coming Out zu verhindern. </li><li> Setzen Sie das Schiff im Autoklaven für 25 bis 30 Minuten bei 121 ° C, Flüssigkeitskreislauf. Vorsicht: Wenn es herauskommt, wird es sehr heiß. </li><li> Installieren Sie das Schiff auf der Fermenter Basis. </li><li> Schließen Sie den pH-WertSondenkabel. </li><li> Befestigen Sie die pO 2-Sonde Kabel. </li><li> Haken Sie die Sprinkler bis zu der Gasmesser hinaus. </li><li> Steril hinzufügen 1 M NaOH-Reagenz an der Flasche mit dem Tauchrohr und installieren Sie den Pumpenkopf auf der Grundpumpenkopf Spindel. </li><li> Setzen Sie den Temperaturfühler im Schutzrohr auf der Kopfplatte. Stellen Sie sicher, dass es geht den ganzen Weg auf den Boden des Schutzrohres. </li><li> Senken Sie den Arm auf die Agitation Gefäße Laufrad Kupplung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Fermenter ist. </li><li> Prüfen Sie, ob Wasser vorhanden ist, um den Fermenter. </li><li> Schalten Sie die Luftzufuhr in den Fermenter. </li><li> Blättern Sie zu dem Temperaturparameter und die Temperatur auf 37 ° C Drücken Sie die Taste &quot;Enter&quot;, um die Temperatursteuerung starten. Das Schiff wird in 15 min oder weniger erwärmen. </li><li> Drehen, um den Gasstrom 1 Gefäßvolumen Medium pro Minute oder weniger. Für diese Einrichtung ist Gasstrom 3 l / min. Bubbles sollte unten angezeigt. </li><li> Blättern Sie zu der Agitation parameter und auf 300 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Drücken Sie die Eingabetaste, um auf der Agitation zu machen. </li><li> Sobald die Temperatur 37 ° C erreicht, blättern Sie zu dem Parameter pH-Wert und legen Sie es auf 6,8. Drehen Sie den pH-Kontrolle durch Drücken der Taste &quot;Enter&quot;. </li><li> Eingestellt Rühren zu der maximalen Geschwindigkeit von 1000 rpm für den Lauf. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die pO 2-Sonde richtig polarisiert, um die richtigen Werte anzeigen. Nach 2 Stunden, blättern Sie zu dem Parameter pO 2 und verwenden Sie die &quot;Menü&quot;-Taste, um das &quot;Kalibrieren Funktion &#39;wählen und wählen Sie die 1-Punkt-Kalibrierung. </li><li> Nach 15 Minuten, verwenden Sie die Cursor, um den Wert auf 100 gesetzt, und drücken Sie &quot;Enter&quot;. Dies wird pO 2 zu kalibrieren. </li><li> Blättern Sie zu Unruhe und zu 300 Umdrehungen pro Minute eingestellt. </li><li> Mit der &quot;Menü&quot;-Taste, schalten Sie den &#39;Cascade&#39; auf &#39;on&#39; in der Unruhe-Menü. Dadurch wird die Geschwindigkeit der Bewegung in dem Bemühen, zerhacken Luftblasen und zwingen mehr Sauerstoff in Lösung als Wachstums Nachfrage zunimmt. </li&gt; <li> Blättern Sie zu dem Parameter pO 2 und setzen Sie den Wert auf 30 erhöht. Drücken Sie die Taste &#39;Enter&#39; pO 2 zu starten. </li><li> Startet die Steuerungssoftware auf dem PC. </li><li> Sobald die Sonden kalibriert sind, ist Rühren stabil bei 300 Upm, die Temperatur bei 37 ° C und pH-Wert in der Nähe von 6,8, ist es Zeit, zu beimpfen. Mit Alkohol, sterilisieren, den Hafen, die zur Impfung verwendet wird. </li><li> Zeichnen Sie den Impfstoff in eine Spritze und fügen Sie es in den sterilisierten Port. Schließen Sie den Anschluss. </li><li> Markieren Sie die Zeit der Impfung in einem Logbuch. </li><li> Es ist auch wichtig, um eine Probe zu nehmen Sterilisationszeit. Sterilisieren Sie das Ende der Ernte Rohr Rohr mit Alkohol. </li><li> Öffnen Sie die Klammer für den Ernte-Anschluss und mit einer Spritze, um eine Probe zu ziehen. Diese erste Probe wird in der Regel verworfen werden, da es in der Rohr gesessen. </li><li> Verwenden Sie eine andere Spritze, um eine weitere Probe zu ziehen. </li><li> Mit einem dritten Spritze, drücken Sie wieder Luft durch das Rohr, so viel Totvolumen entfernenvon der Linie und klemmen Sie die Zeile aus. </li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte und pH-Wert und die Werte notieren. Mit mikrobiellen Kulturen, ist es sinnvoll, Werte einloggen jede Stunde. Interval ist Kultur abhängig. </li><li> Ernte-Methode hängt von der Absicht, für die Kultur nach dem Wachstum abgeschlossen ist. In diesem Fall probieren Sie die Kultur eine letzte Frist bis zum Endpunkt Werte für die Zelldichte und pH-Wert möglich oder die Messung von Zellfeuchtmasse zu erhalten. Öffnen Sie die Kopfplatte der Inhalte in einem ausgewiesenen &quot;Kill-Tank&quot; mit Bleichmittel oder andere antimikrobielle Mittel angeordnet ist. </li></ol>

<ol><li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShuler%2C+M+%22Bioprocess+Engineering+Basic+Concepts%22">Bioprocess Engineering Basic Concepts</a>. , 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).</li>
<li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Wave [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
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<li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan%2C+a+bioengineered+heparin+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).</li>
<li>Bioreactors [Internet]. , Applied Technical Resources. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf">http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf</a> (2012).</li>
<li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInfors%2C+HT+%22Minifors+operating+Manual+and+user+guide%22">Minifors operating Manual and user guide</a>. , Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.</li>
</ol>

Autor A. Magno ist ein Mitarbeiter der ATR Biotech, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Rührkessel-Bioreaktoren sind der Standard in der Biotechnologie-Industrie und haben seit über 40 Jahren 1 verwendet. Die kleine Rührkessel wurde für Scale-up, Scale-Down, Stammoptimierung, Charakterisierung und Prozessentwicklung wichtig. Es kann auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von individualisierten Medizin 2. Der kleine Bioreaktor am ähnlichsten ist in-situ-Bedingungen für das Zellwachstum, weil sie überwacht und in einem Durchlauf zu optimieren. Meistens werden die ersten Experimente mit Schüttelkolben durchgeführt, aber die Bedingungen in der kleinen Bioreaktor erheblich vom Schüttelkolben. In einem Experiment haben wir festgestellt, dass die Bedingungen für ein optimales Wachstum von E. coli und Herstellung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Schüttelkolben nicht in den gerührten Tank (unveröffentlichte Daten) zu übersetzen. Andere Methoden der wachsenden Zellen in großem Maßstab sind Rollerflaschen, single use Schaukel Plattform Bioreaktoren 3 und größeren einzelnen Bioreaktoren mit einem Arbeitsvolumen von 50 bis 5.000 L. Jede Methode bietet Herausforderungen für Scale-up, aber hat einen Platz in der Produktion gefunden. Die einzelne Verwendung Schwingplattform Bioreaktor ist ähnlich zu dem gerührten Tank und liefert eine geregelte Umgebung. Es unterscheidet sich von dem Rührbehälter in diesem Mischen erfolgt durch eine Schwenkbewegung um Wellen zu Zelle Absetzen zu verhindern und Oxygenierung zu erzeugen. Die Hydrodynamik für dieses Verfahren unterscheidet sich von dem Rührbehälter und maximales Volumen auf 1000 L. Die Unterschiede können Zellwachstum und die Produktproduktion beeinflussen beschränkt. Andere Einzelnutzung Systeme kombinieren die Rührkessel mit dem Einweg-Reaktor, eine Plattform bieten, mit einem Minimum an Infrastruktur und damit verbundenen Aufwand und die Fähigkeit für Hochdurchsatz-Bioprozess-4. Neue Benutzer von Tischbioreaktoren können Probleme Bestimmung anfänglichen Sollwerte für pH, pO 2 und Temperatur habenTemperatur, aber veröffentlichte Forschungs können diese Informationen 5, 6, 7, 8, 9 verwiesen werden. Mit Bakterienkulturen, insbesondere empfiehlt es sich, unter Rühren bei der gleichen Geschwindigkeit wie die Schüttelkolben und der Temperatur bei der gleichen Sollwert startet. Kultur pH-Wert der letzten Schüttelkolben Läufe können auch als Ausgangspunkt verwendet werden. Einstellung der pO 2-Wert ist schwieriger und wird in der Regel empirisch ermittelt. , Beginnend mit 50% pO 2 ist jedoch eine empfohlene Ausgangspunkt.

Basisfermentationstechnologie ist eine Erweiterung der einfachen Schüttelkolben Technik für wachsende Kulturen. Es entstand aus dem Wunsch, Wachstumsumgebungen für lebende Kulturen in einer vollständigeren und quantitative Weise zu steuern. Batch-Kultur Schüttelkolben sind in der Regel durch ungenaue Kontrolle der Temperatur beschränkt. Temperaturverteilung in einem inkubiert Shaker oder warmen Zimmer ist sehr variabel, manchmal verirrt 5 ° C oder mehr von der vorgesehenen Sollwert. Da der Schüttelkolben wird normalerweise bei einer festen Geschwindigkeit bewegt, ist die Sauerstoffaufnahme und Gasaustausch beschränkt. Sobald das vorhandene Umgebungs Sauerstoff verbraucht ist, den meisten Kulturen nicht zu gedeihen. Es gibt keine pH-Kontrolle in Schüttelkolben. In vielen Fällen, wenn die Kultur nicht von Futter-Vorrat begrenzt ist, saure wird es zu dem Punkt der Schaden für die Kultur und die Atmung verlangsamt sich dramatisch. Die meisten Schüttelkolben-Kulturen werden auch als &quot;Los&quot;, was bedeutet, dass sie nur einmal am oder nahe dem Beginn der Kulturen inoculatio speist laufenn. Nach der ersten Kohlenstoffquelle verbraucht ist, stoppt der Kultur wachsen. In einigen Fällen kann seinen Stoffwechsel zu verschieben und beginnen, andere Metaboliten in dem Kulturmedium verbraucht, manchmal, die die Eigenschaften der resultierenden Biomasse oder Protein. Schüttelkolben sind gewöhnlich einer Medienverdampfungsverlust in wärmeren Umgebungen Kultur, typischerweise 10% Volumen pro 24 Stunden bei 37 ° C. Dieser Verlust ändert die Dichte der Kultur und verbietet längere Zeitbetrieb des Systems. Schließlich kann der Benutzer stoßen Schäumen aus den Medien nach dem Rühren. Das Auftreten von Schaum in dem Kopfraum über der Kultur wird der Gasaustausch und weitere Knie Wachstum begrenzen. Die Grundfermentationssystem ist entworfen, um alle diese Einschränkungen zu adressieren. Sorgfältige Temperatursteuerung in Fermentationsbehälter durch die Verwendung von Laufradbewegung und einem Heizmantel erreicht. Ein Sensor in das Gefäß und Regelung der Heizung und Kühlung dieser Jacke üblicherweise eingesetztErgebnisse der Temperaturregelung ± 0,1 º C um den Sollwert. Tisch-Fermenter der Regel bieten Kontrolle der pH-Wert über flüssige Reagenz zusätzlich durch eine Pumpe. Der pH-Wert wird kontinuierlich in dem Bemühen, die optimale Umgebung für das Zellwachstum zu halten überwacht. Eine ausreichende Belüftung ist durch die oben erwähnte Mischflügel oder durch die Beimischung von Luft oder Sauerstoff ergänzt Gas direkt in die Kultur eingetragen. Bei scherempfindlichen Kulturen, Sauerstoff ergänzt Gas der primäre Mechanismus für die Aufrechterhaltung der Sauerstoffgehalt in der Kultur. Messung von Sauerstoff in der Lösung wird gewöhnlich durch eine polarographische Sonde, die normalerweise nicht für die Verwendung in Schüttelkolben erhältlich erreicht. Es ist auch möglich, kontinuierlich oder periodisch hinzuzufügen Zufuhr zu dem Behälter, um das Wachstum in einer linearen oder exponentiellen Art und Weise aufrecht zu erhalten. Die Austrittsgaskondensator eine kalte Oberfläche für Dampf in den Abgasstrom zu kondensieren, wodurch die Erhaltung Kulturvolumen und Dichte. Periodische Zugabe von Antischaum Tensid betätigteneine Leitfähigkeitssonde in der Kultur, wodurch Schaum auf der Oberfläche und damit den Gasaustausch. Das Schiff, mit allen Sonden, Armaturen, Laufräder, Ernte Rohre und Röhren, zusammengebaut und in einem Standard-Autoklaven sterilisiert. Sonde nach der endgültigen Kalibrierung und Stabilisierung der Betriebsumgebung wird die Kultur in den Behälter gegeben. Das System kann dann verwendet werden, um die Kultur in einer Weise, die mehr quantitative und genauer als mit einem Schüttelkolben Methode charakterisieren. Strenge Kontrolle von Temperatur, pH, Sauerstoffgehalt, Futterverbrauch, Flüssigkeitsverdampfung und Schaumniveaus alle zu einem viel höheren Biomasse und bessere Eiweißausbeute beitragen.

<table><tbody><tr><td>LB-Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A1593-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB-Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Antischaummittel 204</td><td>Sigma</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>1 M Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>38215-1EA-R</td><td></td></tr><tr><td>Referenzpuffer, pH 4,00</td><td>Sigma</td><td>B5020</td><td></td></tr><tr><td>Referenz Puffer, pH 7,00</td><td>Sigma</td><td>B4770</td><td></td></tr><tr><td>pO2-Sonde Elektrolyt</td><td>Broadley James</td><td>AS-3140-C30-0025</td><td></td></tr><tr><td>0,45 Mikron Filter</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-02915-22</td><td></td></tr><tr><td>0,22 Mikron Filter</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-29950-40</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Spritze, 10 mL</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07940-12</td><td></td></tr><tr><td>Minifors Bioreaktor</td><td>Infors HT</td><td>B-Pack 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Air Admiral Luftpumpe</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-79202-00</td><td></td></tr><tr><td>1175 PD Kältethermostat</td><td>VWR</td><td>13721-204</td><td></td></tr></tbody></table>

betrieb einer tischbioreaktor

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentationssysteme werden verwendet, um eine optimale Wachstumsbedingungen für viele verschiedene Arten von Zellkulturen zu schaffen. Die Fähigkeit von Fermentern lieferte sorgfältig zu steuern Temperatur, pH und gelöstem Sauerstoff-Konzentrationen, insbesondere sind sie für den Einsatz effizienter Groß Wachstum und Expression von Fermentationsprodukten. Dieses Video wird kurz die Vorteile der Fermenter über die Schüttelkolben. Es wird auch Schlüsselkomponenten einer typischen Tisch-Fermentationssystem identifizieren und grundlegende Anweisungen auf Setup des Schiffes und Kalibrierung der Sonden. Der Betrachter wird mit dem Sterilisationsverfahren vertraut gemacht und gezeigt, wie man das Wachstumsmedium in dem Behälter mit der Kultur zu beimpfen. Bedienkonzept, Sampling, und die Ernte wird auch demonstriert werden. Einfache Datenanalyse und Systembereinigung wird auch diskutiert werden.

Der Bioreaktor kann mit oder ohne die IRIS-Software ausgeführt werden. Allerdings, um Daten zu erfassen, ist es am besten, um die Software zu nutzen. Vor der Zugabe von Bakterien, muss der pH-und Sauerstoffsensoren kalibriert werden, das Laufrad und die Drehzahlsolltemperatur einzustellen. In Fig. 2 ist die Datenausgabe für einen Bioreaktor Lauf dargestellt. Die Temperatur wurde auf 30 º C, die Rührgeschwindigkeit auf 200 Upm eingestellt. Die Parameter können für jeden Versuch unterschiedlich sein, aber vor der Zugabe der Bakterien, sollte das System im Gleichgewichtszustand sein. In Fig. 3 ist die Änderung der Sauerstoffkonzentration mit der Zugabe der Bakterienkultur gezeigt. Die Sollwerte für diesen Versuch sind 37 ° C, Rührer bei 200 U, O 2 bei 70%. Zum Zeitpunkt 19.20 Uhr, die Förderpumpe liefert die bakterielle Keimkultur bei einer OD von 0,1 was ein unmittelbar in der O 2-Niveau sinken. Der Bioreaktor reagiert auf die Veränderung O 2-Pegel mit einem Anstieg in der Luftströmung und Laufraddrehzahl. Ter Sollwerte für die Erhöhungen in der Kaskade (Schritt 35) gesetzt. Der Reaktor pH wurde in Echtzeit überwacht, wobei der pH-Wert abnimmt, dann zunimmt, wenn der pH Linie Schwankung im Laufe der Zeit (Fig. 4) gezeigt. Der gesamte Durchlauf analysiert werden und Parameter für nachfolgende Experimente eingestellt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Tischbioreaktor mit allen beschriftet und miteinander verbundenen Teilen. Dieses Bild zeigt den Rührkessel zu Beginn des Laufs. Die Teile des Reaktors sind beschriftet und sind die Sensoren, Laufrad, Temperaturanzeige, Futter-und Probenflaschen, Abgas Hafen, Luftdruckmesser, Wärmemantel, Kondensator Turm und Bedienfeld. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> 2. Screen-Bild der Bioreaktor sofTWARE zu Beginn der Flucht. Zu Beginn der Rührkessel Lauf wurde die Temperatur auf 30 ° C (gelbe Linie) gesetzt, Laufrad Geschwindigkeit auf 200 Umdrehungen pro Minute (rote Linie), pH-Wert bei 6,5 (grüne Linie), und pO 2 bei 57,2% (blaue Linie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> 3. Schirmbild des Bioreaktors Software während der Lauf Sauerstoff abnimmt. Wenn die Kultur in der aktiven Wachstumsphase verbraucht Sauerstoff und die Menge an Sauerstoff in dem Reaktor verringert wird (blaue Linie). Durch die Erhöhung der Laufraddrehzahl, mehr Sauerstoff in der Kultur (rote Linie) hinzugefügt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . 4. Screen-Bild von Bioreaktor-Software, die pH-Änderung über die Zeit. Den pH-Wert der Kultur wird kontinuierlich überwacht und im Laufe der Zeit abnimmt, wie Milchsäure produziert wird und steigt dann als Basis mit dem Bioreaktor (blaue Linie) aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

Fermenter werden verwendet, um Kultur Ausbeute und Produktivität von biotechnisch hergestellten Zellen zu erhöhen. Nach dem Screening mehrere mikrobiellen oder tierischen Zellkultur-Kandidaten in Schüttelkolben, ist der nächste logische Schritt, um der ausgewählten Kultur Biomasse mit dem Fermenter zu erhöhen. Dieses Video zeigt den Aufbau und Betrieb einer typischen Tisch-Bioreaktor-System.

Betrieb einer Tischbioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Bioreaktor einzurichten, der eine kontrollierte Umgebung für das großtechnische Wachstum bioingenieurtechnisch veränderter Zellen bereitstellt. Dies wird erreicht, indem zunächst der Behälter zusammengebaut, die pH-Elektrode kalibriert und der montierte Behälter autoklaviert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den autoklavierten Behälter an die Fermentor-Basis anzuschließen und die Parameter für Rührergeschwindigkeit, Temperatur, pH-Wert und Sauerstoffsättigung einzustellen.Anschließend wird der Bioreaktorbetrieb gestartet, sodass nach manueller Kalibrierung der Sauerstoffsonde die gewünschte Rührergeschwindigkeit, die Temperatursollvorgabe und die Sauerstoffsättigung erreicht werden. Der letzte Schritt besteht darin, den Bioreaktor mit der Bakterienkultur zu impfen und die Bedingungen im Bioreaktor mithilfe der Computersoftware zu überwachen. Letztendlich können die Wachstumseigenschaften der Kultur analysiert und die Kultur zur Gewinnung und Reinigung des gewünschten Produkts aufgearbeitet werden.In diesem Video zeigen wir den Aufbau und die Bedienung eines Bioreaktors für die bakterielle Fermentation. Die visuelle Demonstration dieser Methode kann nützlich sein, da die Montage, Kalibrierung und Überwachung des Bioreaktors eine anspruchsvolle Aufgabe für Personen darstellen kann, die mit dieser Technologie nicht vertraut sind. Gut, dann fangen wir an.Als Erstes ein bakterielles Medium, das nicht wärmeempfindlich ist, in das saubere Gefäß geben. Nur bis zur maximalen Arbeitsvolumen hinzufügen, das bei einem Gesamtvolumen von fünf Litern 3,3 Liter beträgt. Die Kopfplatte des Gefäßes montieren, wobei sichergestellt werden muss, dass die O-Ring-Dichtung richtig sitzt. Den Ablaufgas-Kondensator installieren.Installieren Sie das Ernterohr in seinen 10-Millimeter-Anschluss. Legen Sie ein Stück Schlauch darauf. Verbinden Sie es mit der Probenflasche und klemmen Sie den Schlauch ab.Befestigen Sie Schläuche und einen 0,2-Mikron-Filter am Sargedruckeinlass und verschließen Sie diesen mit einer Klemme. Zum Kalibrieren der pH-Elektrode bereiten Sie zwei Referenzpuffer in kleinen Bechern, eine Sprühflasche und einen Spülbecher vor. Schließen Sie die pH-Elektrode an den Fermentor an und schalten Sie sie ein.Scrollen Sie zum pH-Parameter und scrollen Sie dann mithilfe der Menütaste zur Option „cow“ und drücken Sie die Eingabetaste. Wählen Sie zwei für die Zweipunktkalibrierung. Spülen Sie die pH-Elektrodenspitze und tauchen Sie sie in das niedrige Referenzpufferlösung ein.Der Wert im Fermentor stabilisiert sich mithilfe der Plus- und Minustasten. Stellen Sie den angezeigten Wert so ein, dass er mit dem Wert des pH-Referenzpuffers übereinstimmt. Sobald das Blinken stoppt, drücken Sie Weiter.Spülen Sie den Niedrig-Referenzpuffer von der Sonde ab und tauchen Sie die Sonde in den zweiten Referenzpuffer ein. Warten Sie, bis der Wert stabil ist, und passen Sie mithilfe des Tastenfelds den angezeigten Wert an den Wert des Hoch-Referenzpuffers an. Drücken Sie die Eingabetaste, um zu bestätigen.Spülen Sie die Sondenspitze aus und trennen Sie sie vom Fermentor. Setzen Sie die Schutzkappe auf die Anschlussstelle und bringen Sie sie in der Kopfplatte an. Öffnen Sie die Sondenspitze für den Sauerstoffsensor und prüfen Sie, ob ausreichend Elektrolyt vorhanden ist, um die Spitze zu bedecken.Installieren Sie die Sauerstoffsonde in der Kopfplatte. Stellen Sie sicher, dass die Autoklavierkappe angebracht ist, um die elektrischen Anschlüsse zu schützen, da diese vor der Kalibrierung sterilisiert werden. Beschaffen Sie anschließend eine Flasche für die Reagenzienzufuhr mit Tauchrohr und Luftfilter.Befestigen Sie die Pumpeleitungen am Anschluss für das Tauchrohr und verbinden Sie das andere Ende mit dem Einlassanschluss des Fermenters. Bringen Sie Leitungen an allen unbenutzten Anschlüssen an und verschließen Sie diese mit Schellen. Installieren Sie einen 0,45-Mikron-Filter am Abluftkondensator. Dieser Filter verhindert, dass der Behälter im Autoklaven Druck aufbaut.Überprüfen Sie, ob alle Schläuche, die sich unterhalb des Mediums befinden, abgesperrt sind, um ein Austreten des Mediums zu verhindern. Stellen Sie das Gefäß in den Autoklaven und sterilisieren Sie es 25 bis 30 Minuten bei 121 Grad Celsius im Flüssigkeitszyklus. Sobald das Autoklav-Gefäß abgekühlt ist, folgt der nächste Schritt: die Montage auf der Fermentor-Basis. Dann schließen Sie das Kabel der pH-Sonde an. Befestigen Sie das Kabel der Sauerstoffsonde und schließen Sie den Begaser an die Gaszufuhr an. Drehen Sie, und schalten Sie den Fermenter unter Aufrechterhaltung der Sterilität ein.Fügen Sie eine molare Natriumhydroxidlösung in die Flasche mit dem Tauchrohr hinzu und montieren Sie den Pumpenkopf auf der Pumpenkopf-Spindel der Basis. Stecken Sie den Temperatursensor in das Thermoblock auf der Kopfplatte. Stellen Sie sicher, dass er vollständig bis zum Boden des Thermoblocks eingeschoben wird.Senken Sie den Rührarm vorsichtig auf die Rührer-Kupplung der Gefäße ab. Stellen Sie sicher, dass der Fermentor eingeschaltet ist. Überprüfen Sie, dass Wasser für den Fermentor verfügbar ist.Schalten Sie die Luftzufuhr zum Fermenter ein. Blättern Sie zum Temperaturparameter und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Drücken Sie die Eingabetaste, um die Temperaturregelung zu starten.Das Gefäß wird sich in 15 Minuten oder weniger aufheizen. Stellen Sie den Gasfluss auf ein Gefäßvolumen Medium pro Minute oder weniger ein. Bei diesem Aufbau beträgt der Gasfluss drei Liter pro Minute.Blasen sollten am Boden erscheinen. Scrollen Sie zum Agitationsparameter und stellen Sie ihn auf 300 U/min ein. Drücken Sie die Eingabetaste, um die Agitation einzuschalten.Sobald die Temperatur 37 Grad Celsius erreicht hat, scrollen Sie zum pH-Parameter und stellen Sie diesen auf 6,8 ein. Schalten Sie die pH-Regelung ein, indem Sie die Eingabetaste drücken.Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf die maximale Drehzahl von 1000 U/min für den Lauf ein. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffsonde ordnungsgemäß polarisiert ist, um nach zwei Stunden korrekte Werte anzuzeigen. Blättern Sie zum Sauerstoffparameter.Wählen Sie mithilfe der Menütaste die Kalibrierfunktion und anschließend die einpunktige Kalibrierung aus. Stellen Sie nach 15 Minuten mit den Cursor-Tasten den Wert auf 100 ein und drücken Sie die Eingabetaste. Dadurch wird die Sauerstoffsättigung kalibriert.Scrollen Sie zur Agitation und stellen Sie diese auf 300 U/min ein. Schalten Sie mithilfe des Menüknopfs in dem Agitationsmenü die Kaskade ein. Dadurch wird die Agitationsgeschwindigkeit erhöht, um Luftblasen zu fragmentieren und bei steigendem Sauerstoffbedarf infolge des Wachstums mehr Sauerstoff in Lösung zu bringen.Scrollen Sie zum Sauerstoffparameter und stellen Sie den Wert auf 30 ein. Drücken Sie die Eingabetaste. Starten Sie das Steuerungssoftwarepaket auf dem PC.Nachdem die Sonden kalibriert wurden, ist die Rührgeschwindigkeit bei 300 U/min stabil. Die Temperatur beträgt 37 Grad Celsius und der pH-Wert liegt nahe bei 6,8. Es ist Zeit, mit Alkohol zu impfen.Sterilisieren Sie den Animpfport. Ziehen Sie das Inokulum in eine Spritze auf und geben Sie es über den sterilisierten Port hinein. Verschließen Sie den Port, und markieren Sie die Zeitpunkt der Inokulation im Computer-Protokoll.Es ist außerdem wichtig, eine Probe zum Zeitpunkt der Inokulation zu entnehmen. Nachdem Sie die Klemme geöffnet und die Erntedüse abgedeckt haben, drücken Sie den Spritzenkolben, um die Leitung zu spülen. Ziehen Sie anschließend den Spritzenkolben zurück.Um eine Probe zu entnehmen, schrauben Sie die Flasche ab und entsorgen Sie die erste Probe, da sie in der Leitung gestanden hat. Schrauben Sie die Flasche wieder fest und verwenden Sie denselben Spritzenkolben, um eine weitere Probe zu entnehmen. Entfernen Sie die Flasche und gießen Sie den Inhalt in ein Vete.Zum Testen drücken Sie mit der Spritze Luft durch das Rohr zurück und schließen die Klemme an der Probennahmeleitung. Bestimmen Sie die Zelldichte und den pH-Wert und notieren Sie die Werte. Bei mikrobiellen Kulturen ist es sinnvoll, stündlich Werte zu erfassen, doch das Probennahmeintervall hängt von der jeweiligen Kultur ab.Die Erntemethode hängt vom Verwendungszweck der Kultur nach Abschluss des Wachstums ab. In diesem Fall nehmen Sie die Kultur ein letztes Mal zur Bestimmung der Endwerte für die Zelldichte sowie gegebenenfalls für den pH-Wert oder die Messung des Feuchtzellgewichts. Öffnen Sie abschließend die Kopfplatte, ernten Sie die Kultur und entsorgen Sie den Gefäßinhalt in einem vorgesehenen Tötungsbehälter mit Bleiche oder anderen antimikrobiellen Mitteln.In diesem Video wurde der Aufbau und die Bedienung eines typischen Labormaßstab-Bioreaktorsystems demonstriert. Diese Abbildung zeigt den Bioreaktor zu Beginn eines Laufs mit allen beschrifteten und verbundenen Teilen. Die Datenausgabe für einen repräsentativen Bioreaktor-Lauf ist in dieser Abbildung dargestellt.Zu Beginn eines Rührkesselversuchs wurde die Temperatur auf 30 Grad Celsius, die Rührergeschwindigkeit auf 200 U/min, der pH-Wert auf 6,5 und der Sauerstoffgehalt auf 57,2 % eingestellt. Die Parameter können je nach Experiment variieren, jedoch sollte das System vor der Zugabe von Bakterien einen stationären Zustand erreicht haben. In der folgenden Abbildung ist die Änderung der Sauerstoffkonzentration nach Zugabe der Bakterienkultur durch die blaue Linie dargestellt.Die Zufuhrpumpe liefert die bakterielle Impfkultur bei einem OD von 0,1, was einen unmittelbaren Abfall verursacht. Bei dem Sauerstoffgehalt reagiert der Bioreaktor auf die wechselnden Sauerstoffkonzentrationen mit einer Erhöhung der Rührergeschwindigkeit. Diese letzte Bildschirmanzeige der Bioreaktorsoftware zeigt die pH-Änderung über die Zeit, dargestellt durch die dunkelblaue Linie.Der pH-Wert der Kultur wurde kontinuierlich überwacht und nahm im Laufe der Zeit ab, während Milchsäure produziert und anschließend angereichert wurde. Der gesamte Versuchslauf kann analysiert und die Parameter für nachfolgende Experimente angepasst werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Bioreaktor für die Expression eines rekombinanten Proteins einrichtet und überwacht. Mit Fermentationssystemen wird eine optimale Wachstumsumgebung für viele verschiedene Arten von Kulturen im größeren Maßstab bereitgestellt. Die Möglichkeit, die Temperatur, den pH-Wert und insbesondere die Konzentration des gelösten Sauerstoffs genau zu steuern, macht Fermenter zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die effiziente großtechnische Kultivierung und die Produktion von Fermentationsprodukten.Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Mit einem pneumatischen Bioreaktor demonstrieren wir den Aufbau, den Betrieb und die Leistung dieses Einweg-Bioreaktorsystems für das Wachstum von Säugetierzellen.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Ein neuartiges Reaktordesign, das als High Density Bioreactor (HDBR) bezeichnet wird, wird für die Kultivierung und Untersuchung von mikrobiellen Gemeinschaften mit hoher Dichte vorgestellt. Hier wird der HDBR erfolgreich in einer Photobioreaktor (PBR)-Konfiguration zur Untersuchung des Stickstoffstoffwechsels durch eine gemischte Algengemeinschaft mit hoher Dichte eingesetzt.

A Novel Bioreaktor für High Density Anbau von Diverse mikrobiellen Gemeinschaften

Dieses Papier beschreibt den Montageprozess und den Betrieb eines fotosynthetischen Bioreaktors auf der Bank, der in Verbindung mit anderen Methoden verwendet werden kann, um relevante kinetische Wachstumsparameter zu schätzen. Dieses System überwacht kontinuierlich den pH-Wert, das Licht und die Temperatur mit Sensoren, einer Datenerfassungs- und Steuereinheit und einer Open-Source-Datenerfassungssoftware.

Aufbau und Aufbau eines handelsüblichen Algen-Photosynthese-Bioreaktors mit Temperatur-, Licht- und pH-Monitoring für kinetische Wachstumstests

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Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Dieses Protokoll beschreibt den Zusammenbau von Mini-Bioreaktor-Arrays, die für die kontinuierliche Durchflusskultur komplexer Stuhlgemeinschaften unter anaeroben Bedingungen verwendet werden sollen. Wir besprechen auch die Methoden für den Zusammenbau, die Inokulation und die Probenahme der Reaktoren für die weitere Analyse.

Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Das Minibioreactor Array (MBRA) ist ein anpassbares Hochdurchsatz-Kultursystem mit kontinuierlichem Durchfluss, das die Kultivierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften ermöglicht und parallele Experimente zur Untersuchung der Mikrobiomdynamik, therapeutischer Wechselwirkungen und mikrobieller Reaktionen auf Umweltfaktoren unterstützt.

Aktualisiertes Protokoll für den Aufbau und die Verwendung des Minibioreaktor-Arrays (MBRA)

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Lernen Sie den Aufbau und Betrieb eines Tischbioreaktors für die großtechnische Kultivierung bioengineerter Zellen. Diese Methode zeigt Kalibrierung, Sterilisation und Überwachung kritischer Parameter.

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