Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine halbautomatisierte, mikrofluidikbasierte Plattform zusammenzustellen und zu nutzen, um kleine Zellpopulationen zu kultivieren und zu stimulieren sowie Zelllysate für molekularbiologische Analysen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst mikroskalige Zellkulturen in mit Fibronectin beschichteten Mikroküvetten – sogenannten Perfusionkammern – etabliert werden. Im zweiten Schritt werden die Perfusionkammern mit einem digitalen mikrofluidischen (DMF-)Modul verbunden, das eine flexible Steuerung der Reagenzien zu und von den mikroskaligen Zellkulturen ermöglicht.

Anschließend gibt das DMF-Modul den gewünschten Stimulus an die Perfusionskammern ab, und die Zellen werden für eine vorbestimmte Einwirkdauer mit dem Stimulus inkubiert. Schließlich werden die Zellen chemisch lysiert und die Lysate auf dem DMF-Modul gesammelt, um eine molekulare Analyse durchzuführen. Die gewonnenen Lysate werden anschließend mittels quantitativer R-T-P-C-R analysiert, um die transkriptionelle Antwort der Zellpopulation auf den Stimulus zu charakterisieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen Zellkultivierungsmethoden liegt darin, dass damit Zellstimulationsstudien mit geringen Zellmengen sowie geringen Reagenzmengen durchgeführt werden können. Unsere Forschung hat gezeigt, dass die präzise Handhabung von Zellen und Reagenzien durch die Plattform im Mikromaßstab die Variabilität von Experiment zu Experiment minimiert. Die Plattform ist außerdem sehr vielseitig.

Das digitale Mikroflussmodul kann Zellen und Reagenzien mit großer Flexibilität zu und von den Perfusionskammern leiten, sodass Experimente schnell und einfach angepasst und neu konfiguriert werden können. Bereiten Sie zunächst eine sterile Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin vor und verwenden Sie eine mehrkanalige Spritzenpumpe, um 30 Mikroliter der Lösung in jede Mikrokappe zu ziehen, um die Beschichtung der inneren Oberflächen der Mikrokappen zu beschleunigen. Inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius, ziehen Sie anschließend die Fibronectin-Lösung ab, entsorgen Sie sie und lassen Sie die Mikrokappen sechs Stunden lang bei Raumtemperatur trocknen.

Verbinden Sie als Nächstes die mit Faser beschichteten Mikrokappillaren oder Perfusionskammern über Kapillarverbindungsstücke mit Polycarbonat-Schläuchen und diese mit der Spritzenpumpe. Der hier gezeigte Aufbau verwendet eine Spritzenpumpe mit sechs Anschlüssen für Perfusionskammern. Sichern Sie den Körper jeder Perfusionskammer mit Klebeband an einem Wärmeblock und stellen Sie die Temperatur des Wärmeblocks auf 37 Grad Celsius ein.

Tauchen Sie dann die offenen Enden der Perfusionskammern in ein Reservoir, das Zellen in frischem Wachstumsmedium enthalten, gleichmäßig dispergiert mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Weisen Sie die Spritzenpumpe an, 10 Mikroliter der Zellsuspension in jede Perfusionskammer zu ziehen. Entfernen Sie danach die offenen Enden der Perfusionskammern aus der Zellsuspension und weisen Sie die Spritzenpumpe an, genügend Luft anzusaugen, um die Flüssigkeitspfropfen in die Abschnitte zu bewegen, die am Heizblock befestigt sind.

Lassen Sie die Zellen durch Inkubation bei 37 Grad Celsius für eine bis zwei Stunden an den mit Fibronectin beschichteten inneren Oberflächen der Perfusionskammern anhaften. In der Zwischenzeit bringen Sie die offenen Enden der Perfusionskammern in ein neues Reservoir mit frischem Wachstumsmedium. Nach der Anhaftphase weisen Sie die Spritzenpumpe an, die Flüssigkeitsportionen in den Abfall zu leiten und anschließend 10 µL frisches Medium in jede Perfusionskammer zu ziehen, gefolgt von ausreichend Luft, um das frische Medium über den angehefteten Zellen zu positionieren.

Setzen Sie die Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius fort und wechseln Sie das Medium alle zwei Stunden, bis die Kulturen ausreichend equilibriert und expandiert sind. Muster. Die untere Platte des DMF-Moduls mit 46 Indium-Zinn-Oxid-Elektroden. Beschichten Sie die untere Platte des DMF-Moduls mittels chemischer Gasphasenabscheidung mit fünf Mikrometern Lene C und anschließendem Spin-Beschichten mit 50 Nanometern Teflon af, unter Verwendung standardmäßiger photolithografischer Techniken.

Als Nächstes spinnt man eine unstrukturierte Indium-Zinn-Oxid-Glasunterlage mit 50 Nanometern Teflon AF beschichtet, die als obere Platte dient. Verwenden Sie Metallkompressionsrahmen, um die Platten in einem Polymerguss mit Ausnehmungen zu befestigen, die einen Abstand von 400 Mikrometern zwischen den Platten aufrechterhalten. Dieser Abstand in Kombination mit der Aktivierungselektrodenfläche von 2,5 Quadratmillimetern definiert das Tröpfchenvolumen als 2,5 Mikroliter pro Elektrode.

Danach Teflon-beschichtete Transfer-Mikrokapillaren in den Zwischenraum zwischen den DMF-Platten einsetzen. Jede so positionieren, dass sie sich von der Kante der zugehörigen Aktivierungselektrode bis zum gegenüberliegenden Ende des jeweiligen Transfers erstreckt. An der Mikrokapillare ein Capite-Fitting befestigen.

Danach die elektrischen Anschlüsse verbinden, um Spannung an die Indium-10-Oxid-Elektroden anzulegen. Die Aktivierungssequenzen der Elektroden werden automatisiert durch eine computergesteuerte elektronische Schnittstelle ausgeführt, die vordefinierte Skripte abarbeitet. Anschließend füllen Sie die an Bord befindlichen Reservoirs der DMF-Module mit den geeigneten Reagenzien für die Zellstimulation, das Waschen und die Lyse.

In einigen Fällen ist es am besten, den Stimulus selbst in einem späteren Schritt unmittelbar vor dessen Verwendung zu laden, wobei aus den geladenen Onboard-Reservoirs gezogen wird, um Mikrotropfen auf das DMF-Modul abzugeben. Testen Sie die Aktivierung der Mikrotropfen, einschließlich ihres Transports zwischen dem DMF-Modul und den Transfer-Mikrokappillaren. Blais. Bereiten Sie zunächst den Stimulus in frischem Medium mit 0,1 % F127 in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter vor.

Beladen Sie anschließend 80 bis 100 Mikroliter des Stimulus in den dafür vorgesehenen Onboard-Vorratsbehälter. Entfernen Sie danach die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Mediumreservoir und führen Sie sie in die Kapillarhalterungen ein, die an den Enden der Transfer-Mikrokapillaren befestigt sind; weisen Sie anschließend die Spritzenpumpe an, die Flüssigkeitsstopfen innerhalb der Perfusionskammern in den Abfallbehälter zu befördern. Danach weisen Sie das DMF-Modul an, 10-Mikroliter-Tropfen des Stimulus zu erzeugen und mittels der Transfer-Mikrokapillaren zu den Perfusionskammern zu transportieren.

Die Zellen bei Bedarf eine bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit dem Stimulus inkubieren. Nach der Stimulationsphase den Stimulus in regelmäßigen Abständen durch frischen Stimulus ersetzen. Die Spritzenpumpe anweisen, den Stimulus in den Abfallbehälter zu leiten, und das DMF-Modul anweisen, einen 10 µL-Tropfen Waschpuffer in jede Perfusionskammer abzugeben.

Inkubieren Sie die Zellen mit dem Waschpuffer für fünf Minuten. Danach ersetzen Sie den Waschpuffer durch 10 Mikroliter Lysepuffer und inkubieren für weitere fünf Minuten. Danach weisen Sie die Spritzenpumpe an, jeden Zelllysatabstrich zum DMF-Modul zu transportieren.

Entfernen Sie die obere Platte des DMF-Moduls, wobei darauf zu achten ist, die Platte nicht seitlich zu kippen, da dies zu einer Kreuzkontamination zwischen den Tropfen führen kann. Sammeln Sie abschließend die Lysate aus dem offenen DMF-Modul mithilfe einer Pipettenmanette für eine Analyse außerhalb der Plattform, beispielsweise zur Genexpression oder Profilierung mittels quantitativer RT-PCR, um die Plattform für das nächste Experiment vorzubereiten. Tauchen Sie zunächst die Transfer-Mikrokappillaren, CAPITE-Verbindungsstücke und DMF-Modulplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10 %ige Bleiche ein, spülen Sie die DMF-Modulplatten anschließend mit Isopropanol und danach mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie sie mit Stickstoffgas ab und backen Sie sie dann 10 Minuten lang bei 160 Grad Celsius.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansiedlungsmethoden führten zur Adhärenz von etwa 500 Miren-Makrophagen pro Perfusionskammer. Nach einer Inkubation der Zellen mit Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius über 16 Stunden verdoppelte sich die Populationsgröße auf etwa 1000 Zellen pro Perfusionskammer. Dargestellt sind hier Ergebnisse einer quantitativen RT-PCR-Analyse von vier Genen, die bekanntermaßen wichtige Rollen bei der angeborenen Immunantwort auf Bakterien spielen.

Die Makrophagen wurden entweder in konventionellen oder mikroskaligen Kulturen gezüchtet und mit E. coli-Biopartikeln für eine oder vier Stunden stimuliert. Die blauen Balken zeigen die durchschnittliche Faltungszunahme der Genexpression nach Stimulation konventionell kultivierter Zellen an, während die roten Balken die induzierte Expression in Zellen darstellen, die angezüchtet und stimuliert wurden. Bei mikroskaligen Kulturen zeigen die Fehlerbalken die Standardabweichungen zwischen biologischen Wiederholungen aus drei unabhängigen Experimenten an.

Die Ergebnisse der Genexpression-Profilierung waren sehr ähnlich, obwohl die konventionellen Kulturen 96-Loch-Platten mit etwa 50.000 Zellen pro Loch verwendeten, während die mikroskaligen Kulturen Mikrokappillaren mit etwa 1.000 Zellen pro Perfusionskammer nutzten. Die experimentelle Variabilität war zumindest vergleichbar und oft geringer in den mikroskaligen Kulturen, wie durch die kürzeren Fehlerbalken angezeigt wird. Bei der Arbeit im Mikromaßstab ergab sich eine um den Faktor fünf verringerte Zellverbrauch und eine um den Faktor drei bis fünfzig verringerte Reagenzienverbrauch im Vergleich zu den konventionellen Experimenten.

Die Methode könnte verwendet werden, um praktisch jeden Anheftungszelltyp zu kultivieren, wobei in einigen Fällen eine andere Komponente der extrazellulären Matrix oder ein anderes Wachstumsmedium erforderlich ist. Die Kultivierung von nicht-anklebenden Zelltypen kann herausfordernd sein, aber Strategien zur Verankerung von Zellen haben sich in ähnlichen Kontexten als erfolgreich erwiesen. Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Mikroskalenkultur für bis zu 24 Stunden.

Die Plattform umfasst ebenfalls alle Funktionen für eine Langzeitkultur, jedoch muss ein Protokoll für die Zellpassage entwickelt werden. Zusätzliche Module können über die mikrokapillaren Anschlüsse in das digitale Mikrofluidik-System integriert werden. Auf diese Weise dient das DMF als zentraler Knotenpunkt, um periphere Module anzuschließen und komplexe Arbeitsabläufe durchzuführen.

Wir konzentrierten uns hauptsächlich auf die Charakterisierung der transkriptionellen Reaktionen des Wirts auf infektiöse Agenten, aber die Plattform ist so konzipiert, dass sie äußerst vielseitig ist und daher eine breite Vielfalt von Forschungsanwendungen unterstützen sollte.