Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine halbautomatische mikrofluidische Plattform zusammenzustellen und zu verwenden, um kleine Zellpopulationen zu kultivieren und zu stimulieren und Zelllysate für molekulare Analysen zurückzugewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst mikroskalige Zellkulturen in Fibronektin-beschichteten Mikrokapillaren etabliert werden, die als Zellperfusionskammern bezeichnet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Perfusionskammern mit einem digitalen Mikrofluidik- oder DMF-Modul zu verbinden, das ein flexibles Mittel bietet, mit dem Reagenzien zu und von den mikroskaligen Zellkulturen geleitet werden.

Als nächstes gibt das DMF-Modul den interessierenden Stimulus an die Perfusionskammern ab und die Zellen werden für eine vorgegebene Expositionszeit mit dem Stimulus inkubiert. Schließlich werden die Zellen auf chemischem Wege lysiert und die Lysate für die molekulare Analyse auf das DMF-Modul zurückgewonnen. Die zurückgewonnenen Lysate werden dann mit quantitativem R-T-P-C-R analysiert, um die transkriptionelle Reaktion der Zellpopulation auf den Stimulus zu charakterisieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Zellkultivierungsmethoden besteht darin, dass Sie mit dieser Technik Zellstimulationsstudien mit kleinen Zellmengen durchführen und auch kleine Mengen an Reagenzien verwenden können. Unsere Forschung hat gezeigt, dass die präzise Handhabung von Zellen und Reagenzien auf der Mikroskala die Variabilität von Experiment zu Experiment minimiert. Die Plattform ist auch sehr vielseitig.

Das digitale Microflow-Modul kann Zellen und Reagenzien mit großer Flexibilität zu und von den Perfusionskammern leiten, so dass Experimente schnell und einfach angepasst und neu konfiguriert werden können. Bereiten Sie zunächst eine sterile Lösung von 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin vor und ziehen Sie mit einer Spritzenpumpe mit mehreren Anschlüssen 30 Mikroliter der Lösung in jede Mikrokapillare, um die Beschichtung der Mikrokapillarinnenflächen zu beschleunigen. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, ziehen Sie dann die Fibronektinlösung heraus und verwerfen Sie sie und lassen Sie die Mikrokapillaren sechs Stunden lang bei Raumtemperatur trocknen.

Verbinden Sie als Nächstes die mit Faser-Nin beschichteten Mikrokapillaren oder Perfusionskammern mit den Polycarbonatschläuchen und die Schläuche mit Hilfe von Kapite-Anschlüssen mit der Spritzenpumpe. Der hier gezeigte Aufbau verwendet eine Spritzenpumpe mit Hilfsanschluss, die sechs Perfusionskammern unterstützt. Befestigen Sie den Körper jeder Perfusionskammer mit Klebeband an einem Wärmeblock und stellen Sie die Temperatur der Heizblöcke auf 37 Grad Celsius ein.

Tauchen Sie dann die offenen Enden der Perfusionskammern in ein Reservoir mit Zellen, die in frischem Wachstum schweben und in einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter gleichmäßig verteilt sind. Weisen Sie die Spritzenpumpe an, 10 Mikroliter der Zellsuspension in jede Perfusionskammer zu ziehen. Entfernen Sie dann die offenen Enden der Perfusionskammern aus der Zellsuspension und weisen Sie die Spritzenpumpe an, genügend Luft anzusaugen, um die Flüssigkeitsstopfen in die am Wärmeblock befestigten Abschnitte zu bewegen.

Lassen Sie die Zellen an den mit Fibronektin beschichteten Innenflächen der Perfusionskammern haften, indem Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. In der Zwischenzeit werden die offenen Enden der Perfusionskammern in ein neues Reservoir mit frischem Wachstumsmedium überführt. Weisen Sie die Spritzenpumpe nach Ablauf der Adhäsionszeit an, die Flüssigkeitsstopfen in den Abfall zu schicken, und ziehen Sie dann 10 Mikroliter frisches Medium in jede Profusionskammer, gefolgt von genügend Luft, um das frische Medium über den anhaftenden Zellen zu positionieren.

Inkubieren Sie die Zellen weiterhin bei 37 Grad Celsius und wechseln Sie das Medium alle zwei Stunden, bis die Kulturen ausreichend ausgeglichen und expandiert sind. Muster. Die Bodenplatte des DMF-Moduls mit 46 Indiumzinnoxid-Elektroden. Unter Verwendung photolitografischer Standardtechniken wird die Bodenplatte des DMF-Moduls mit fünf Mikrometern Lene C durch chemische Gasphasenabscheidung beschichtet und anschließend mit 50 Nanometern Teflon af geschleudert.

Als nächstes wird ein Spin-Coat und ein unstrukturiertes Indiumzinnoxid-Glassubstrat mit 50 Nanometern Teflon AF als Deckplatte verwendet. Verwenden Sie Metallkompressionsrahmen, um die Platten in einem Polymerguss mit Aussparungen zu befestigen, die einen Abstand von 400 Mikrometern zwischen den Platten einhalten. Dieser Abstand in Kombination mit der Betätigungselektrodengröße von 2,5 Millimetern im Quadrat definiert das Tröpfchenvolumen mit 2,5 Mikrolitern pro Elektrode.

Führen Sie dann teflonbeschichtete Transfer-Mikrokapillaren in den Raum zwischen den DMF-Platten ein. Positionieren Sie jede so, dass sie sich bis zum Rand ihrer verwandten Betätigungselektrode bis zum gegenüberliegenden Ende jeder Übertragung erstreckt. Mikrokapillaren befestigen eine Kapite-Armatur.

Schalten Sie anschließend die elektrischen Steckverbinder ein, um die Indium-10-Oxidelektroden mit Spannung zu versorgen. Die Sequenzen der Elektrodenaktivierung werden durch die Verwendung einer computergesteuerten elektronischen Schnittstelle automatisiert, die vorgegebene Skripte ausführt. Füllen Sie dann die DMF-Module an Bord der Reservoirs mit den entsprechenden Reagenzien für die Zellstimulation, das Waschen und die Lyse.

In einigen Fällen ist es am besten, den Stimulus selbst in einem späteren Schritt kurz vor seiner Verwendung zu laden, indem Sie aus den geladenen Onboard-Reservoirs schöpfen und Mikrotröpfchen auf das DMF-Modul abgeben. Test, Betätigung der Mikrotröpfchen, einschließlich ihres Transports zwischen dem DMF-Modul und den Transfermikrokapillaren. Blais. Bereiten Sie den Stimulus zunächst in frischem Medium mit 0,1%onic F1 27 bei einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter vor.

Laden Sie dann 80 bis 100 Mikroliter des Stimulus in den dafür vorgesehenen Behälter an Bord. Entfernen Sie anschließend die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Mediumreservoir und setzen Sie sie in die Capite-Fittings ein, die an den Enden der Transfermikrokapillaren angebracht sind, und weisen Sie dann die Spritzenpumpe an, die Flüssigkeitsstopfen in den Perfusionskammern in den Abfallbehälter zu leiten. Weisen Sie anschließend das DMF-Modul an, 10 Mikroliter Stimuluströpfchen zu erzeugen und diese über die Transfermikrokapillaren in die Perfusionskammern zu bringen.

Inkubieren Sie die Zellen mit dem Stimulus bei 37 Grad Celsius bei Bedarf für ein bis vier Stunden. Austausch gegen frische Stimulation in regelmäßigen Abständen nach der Stimulationsphase. Weisen Sie die Spritzenpumpe an, den Stimulus an den Abfallbehälter zu senden, und weisen Sie das DMF-Modul an, einen 10-Mikroliter-Tropfen Waschpuffer in jede Perfusionskammer zu geben.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem Waschpuffer. Tauschen Sie dann den Waschpuffer gegen 10 Mikroliter Lyselösung aus und inkubieren Sie weitere fünf Minuten. Weisen Sie anschließend die Spritzenpumpe an, jedes Zelllysat an das DMF-Modul zu senden.

Entfernen Sie die obere Platte des DMF-Moduls und achten Sie darauf, die Platte nicht seitlich zu kippen, da dies zu einer Kreuzkontamination zwischen den Tröpfchen führen kann. Sammeln Sie schließlich die Lysate aus dem offenen DMF-Modul mit einem Pipettenmann für Off-Plattform-Analysen, wie z. B. Genexpression, Profilerstellung über quantitatives R-T-P-C-R, um die Plattform für das nächste Experiment vorzubereiten. Tauchen Sie zuerst die Transfer-Mikrokapillaren, CAPITE-Fittings und DMF-Modulplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10%iges Bleichmittel, spülen Sie die DMF-Modulplatten mit Isopropanol, gefolgt von deionisiertem Wasser und trocknen Sie es mit Stickstoffgas und backen Sie es dann 10 Minuten lang bei 160 Grad Celsius.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Aussaatmethoden führten zur Adhärenz von etwa 500 Miren-Makrophagen pro Perfusionskammer. Nach 16-stündiger Inkubation der Zellen mit Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius verdoppelte sich die Populationsgröße auf etwa 1000 Zellen pro Perfusionskammer. Hier sind die Ergebnisse der quantitativen R-T-P-C-R-Analyse von vier Genen zu sehen, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunantwort auf Bakterien spielen.

Die Makrophagen wurden entweder in konventionellen oder mikroskaligen Kulturen gezüchtet und entweder eine oder vier Stunden lang mit E-coli-Biopartikeln stimuliert. Die blauen Balken zeigen die durchschnittliche Faltung der Genexpression bei der Stimulation konventionell kultivierter Zellen, während die roten Balken die induzierte Expression in gezüchteten und stimulierten Zellen anzeigen. In mikroskaligen Kulturen zeigen die Fehlerbalken Standardabweichungen zwischen biologischen Replikaten aus drei unabhängigen Experimenten an.

Die Ergebnisse der Genexpressionsprofilierung waren sehr ähnlich, obwohl die konventionellen Kulturen 96-Well-Platten mit etwa 50.000 Zellen pro Well verwendeten, während die mikroskaligen Kulturen Mikrokapillaren mit etwa 1000 Zellen pro Perfusionskammerexperiment verwendeten, um zu experimentieren, war die Variabilität in mikroskaligen Kulturen zumindest vergleichbar und oft reduziert, wie die kürzeren Fehlerbalken auf der Mikroskala zeigen. Reduzierter Verbrauch von Zellen um das Fünffache und reduzierter Verbrauch von Reagenzien um das Drei- bis 50-fache. Relativ zu den konventionellen Experimenten.

Die Methode könnte verwendet werden, um praktisch jeden Adhärenzzelltyp zu kultivieren, in einigen Fällen unter Verwendung einer anderen extrazellulären Matrixkomponente oder eines anderen Wachstums. Mittlere Zelltypen ohne Adhärenz können eine Herausforderung darstellen, aber Zell-Tethering-Strategien haben sich in ähnlichen Kontexten als erfolgreich erwiesen. Der hier beschriebene Ansatz unterstützt die Kultur im Mikromaßstab für bis zu 24 Stunden.

Die Plattform enthält auch alle Funktionen, um eine Langzeitkultur durchzuführen, aber ein Zellpassaging-Protokoll muss entwickelt werden. Zusätzliche Module können durch die Mikrokapillarverbindungen in die digitale Mikrofluidik-Kabine integriert werden. Auf diese Weise dient das DMF als zentrale Drehscheibe für die Anbindung der Peripheriemodule, um komplexe Arbeitsabläufe durchzuführen.

Wir haben uns in erster Linie auf die Charakterisierung der transkriptionellen Reaktionen des Wirts auf Infektionserreger konzentriert, aber die Plattform ist so konzipiert, dass sie extrem vielseitig ist und daher eine Vielzahl von Forschungsanwendungen unterstützen sollte.