Name: Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Mikrofluidik-Plattform zur Zellkultur und Stimulation kleiner Zellpopulationen mit DMF-Modul. Diese Methode ermöglicht präzise Reagenziensteuerung und Lysatgewinnung für molekulare Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Ronald F. Renzi und Michael S. Bartsch für ihre Beiträge zur Gestaltung und Entwicklung von DMF-Geräten und dem DMF-Hub. Diese Forschung wurde vollständig durch das Laboratory Directed Forschungs-und Entwicklungsprogramm bei Sandia National Laboratories unterstützt. Sandia ist ein Multi-Programm-Labor verwaltet und von Sandia Corporation, eine hundertprozentige Tochtergesellschaft von Lockheed Martin Corporation, betrieben für das US Department of National Nuclear Energy Security Administration unter Vertrag DE-AC04-94AL85000.

Diese allgemeine Protokoll wurde entwickelt, um Anwendung der Plattform für eine Vielzahl von Studien zu unterstützen; Aspekte spezifisch für die repräsentative Studie in diesem Bericht beschrieben sind in Klammern getrennt Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Studie durchgeführt unter Verwendung des Protokolls.. Beachten Sie, dass in dem Protokoll, alle &quot;anweisen&quot;-Befehle durch die Verwendung von vorgegebenen Script automatisiert. Beachten Sie auch, dass Schritt 2 kann in parallel mit Schritt 1 (z. B. während der Schritte 1.7 und 1.8) durchgeführt werden, und dass Schritt 2.1 ist oft umgangen (weil gemustert / beschichtete DMF Gerät Platten können gewaschen und wieder verwendet werden, siehe Schritt 5.2) . 1. Montieren und Bestücken Sie die Zelle Perfusionskammern <ol><li> Bestreichen Sie die Innenflächen sterilisiert (autoklaviert) Mikrokapillaren (Fused-Silica; 679 od um, 534 um id; 15 cm lang) mit Fibronektin, durch Anweisen der Spritzenpumpe, um eine sterile Fibronektin-Lösung (30 ul von 50 ug / ml) zu ziehen in jedemmikrokapillaren, Inkubation (37 ° C für 2 Stunden), instruiert die Spritzenpumpe um die Lösung zu entziehen, und lassen die Mikrokapillaren trocken (Raumtemperatur (RT) für 6 Stunden). </li><li> Verbinden Sie jeden fibronektinbeschichtete mikrokapillaren (Perfusionskammer) zu Polycarbonat-Schlauch (500 um od 100 um ID) und der Schlauch mit dem Multi-Port-Spritzenpumpe mit CapTite Armaturen (6 Perfusionskammern, 8-Port-Spritzenpumpe). </li><li> Mit Klebeband, sichern den Körper jedes Perfusionskammer zu einem Heizblock auf gewünschte Temperatur (37 ° C). </li><li> Tauchen die offenen Enden der Perfusionskammern in einem Behälter (microcentifuge Rohr oder Mikrotiterplatte) enthaltenden Zellen (P388D.1 murine Makrophagen) in frischem Wachstumsmedium suspendiert (RPMI-1640, 10% FBS, 500 Einheiten / ml Penicillin, 500 ug / ml Streptomycin) bei gewünschten Konzentration (10 6 Zellen / ml). </li><li> Weisen Sie die Spritzenpumpe an Zellen (10 ul, 10 4 Zellen) in jede Perfusionskammer von genügend ai gefolgt ziehenr, um die Flüssigkeit Stecker (~ 4,5 cm) auf den Abschnitt, der an der Wärme Block bewegen. </li><li> Lassen Sie die Zellen an der mit Fibronectin beschichteten Innenflächen der Perfusionskammern (37 ° C für 1 - 2 Stunden) zur Verfügung. In der Zwischenzeit, übertragen die offenen Enden der Perfusionskammern aus den Zellen Reservoir zu einem neuen Behälter mit frischem Wachstumsmedium. </li><li> Nach dem Festhalten Zeitraum, weisen die Spritzenpumpe, um die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien und ungebunden Zellen) zu senden, um zu verschwenden, zurückzutreten frischem Medium (10 ul), und folgen Sie mit genügend Luft, um die neuen flüssigen Steckern (frisches Medium) über die Haftposition Zellen. </li><li> Weiter zur Durchführung von mittel-Börsen (dh wiederholen Sie Schritt 1.7) in regelmäßigen Abständen (alle 2 Stunden), bis die Zellpopulationen ausreichend äquilibriert und erweiterte (16 - 24 h von Mikro-Maßstab Kultur erzeugten Populationen von ~ 1.000 Zellen / Kammer) sind. </li></ol> 2. Fabricate die DMF Geräte-und zusammenbauen Hub Architektur <ol><li&gt; Wie zuvor 14,29, beschrieben Muster der Bodenplatte des DMF Gerät mit sechsundvierzig Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Elektroden (Treiber von Tröpfchen Betätigung) durch Photolithographie und Ätzen und Mantel mit 5 um von Parylene-C und 50 nm von Teflon-AF. Bilden die obere Platte des DMF Vorrichtung durch Beschichten einer unstrukturierten ITO Glassubstrat mit Teflon-AF, wie oben beschrieben. </li><li> Mit Metalldruckfeder Rahmen fixieren DMF Platten in eine Polymergussfolie 14,30 mit Ausnehmungen, die eine 400 um Abstand zwischen den Platten zu halten; dieser Abstand mit dem Aktivierungselektrode Größe (2,5 mm 2) kombiniert, definiert das Tropfenvolumen (2,5 ul pro Elektrode). Beachten Sie, dass DMF Montage mit einfacheren Mitteln 24 erreicht werden kann. </li><li> Einfügen teflonbeschichteten Übertragung Mikrokapillaren (360 um od, 100 um id; 3.5 - 4.0 cm) in den Raum zwischen den Platten DMF, Positionieren jeder an den Rand der zugehörigen Betätigung Elektrode erstrecken. </li><li> Um die entgegengesetzte end von jedem Transfer mikrokapillaren Anbringung eines CapTite Montage. </li><li> Rasten Sie die elektrischen Anschlüsse nach Spannung an die ITO-Elektroden liefern. Elektrode Aktivierung Sequenzen durch Verwendung eines computergesteuerten elektronischen Schnittstelle ausgeführt vorbestimmten Script automatisiert. </li><li> Optional: Den zusammengesetzten DMF Nabe auf die Translationsbewegung eines Mikroskops (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) mit einer Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) ausgestattet, um zu ermöglichen Tracking von Tröpfchen . 31. </li></ol> 3. Verbinden Sie die Perfusionskammern der DMF Hub und Stimulieren der Zellpopulationen <ol><li> Entfernen Sie die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Medium Reservoir (siehe Schritt 1.6) und fügen Sie sie in die CapTite Armaturen angebracht, um die Enden der Übertragung Mikrokapillaren der DMF-Hub (siehe Schritt 2.4). </li><li> Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (konditionierten Medien) in den Perfusionskammern zu verschwenden senden. </li><li> Inst.ruct die DMF-Hub an Reiz ziehen (E. coli Biopartikel bei 100 ug / ml in frischem Medium mit 0,1% Pluronic F127 w / v) aus einer On-Board-Speicher und liefern ein Tröpfchen von geeigneter Größe (10 ul) zu jedem Transfer Mikrokapillare . Die On-Board-Reservoire von zylinderförmigen Kammern (1,5 x 1,5 cm je) besteht und mit dem DMF Hub über einen Schlauch. </li><li> Weisen Sie die Spritzenpumpe zu zeichnen der Stimulus-Stecker in den Transfer Mikrokapillaren und folgen mit genügend Luft, um die Stecker in den Zellpopulationen in den Perfusionskammern positionieren. </li><li> Inkubieren der Zellen mit Stimulus (37 ° C für 1 - 4 Stunden). Optional: Exchange für neue Impulse (dh wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4) in regelmäßigen Abständen. </li></ol> 4. Beenden Stimulation und Recover Zelllysate für Analysis <ol><li> Optional: Wenn ein Post-Stimulation Zeitraum erforderlich ist, tauschen die Stimulus-haltigen Flüssigkeit Stecker für frisches Medium (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3.4, Substitution frischem Medium für Stimulus) und weiter inkubieren und nach Bedarf austauschen. </li><li> Austausch der Flüssigkeit in den Stecker Perfusionskammern für Waschpuffer (Prelude Direkte Lysis Buffer Modul B) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Waschpuffer für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min). </li><li> Tauschen Sie die Flüssigkeit Stecker (Waschpuffer) für die Lyse-Lösung (Prelude Direkte Lysemodul Puffer A mit 0,1% Pluronic F127 w / v) (dh wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4, Substitution Lyselösung für Stimulus) und inkubieren nach Bedarf (5 min) . </li><li> Weisen Sie die Spritzenpumpe, die Flüssigkeit Stecker (Zelllysate) mit dem DMF-Hub senden. </li><li> Demontieren Sie die DMF-Hub, entfernen Sie die obere Platte des DMF-Gerät (mit Pflege nicht auf die Platte seitlich kippen, da dies in Tropfenform Durchmischung führen kann), und sammeln Sie die Lysate mit einem Pipetman oder Spritze für off-Plattform Analyse (Genexpressionsanalysen über qPCR). </li></ol> 5. Saubere Plattform für HardwareRe-use <ol><li> Tauchen Sie den Transfer Mikrokapillaren und CapTite Armaturen in 10% Bleichmittel (v / v in Wasser) für 10 min bei RT, gut mit deionisiertem Wasser abspülen und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas. </li><li> Tauchen Sie die DMF Gerät Platten in 10% Bleichmittel für 10 min bei RT, gründlich mit Isopropanol gefolgt von deionisiertem Wasser und trocken unter Verwendung von Stickstoffgas durch Backen bei 160 ° C für 10 min folgte. </li><li> Die Spritze Pumpe Polycarbonat Schläuche, und der DMF Geräts Polymer Besetzung und Kompression Rahmen kann ohne Reinigung wieder verwendet werden. Die Perfusionskammer Mikrokapillaren werden nach jedem Experiment verworfen. </li></ol>

<ol><li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+bioapplications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for bioapplications.</a> Small. 7, 12-48 (2011).</li>
<li>Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained microfluidic cell culture system.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Skafte-Pedersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained%2C+programmable+microfluidic+cell+culture+system+with+real-time+microscopy+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access.</a> Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+complete+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for complete mammalian cell culture.</a> Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).</li>
<li>Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Openly+Accessible+Microfluidic+Liquid+Handlers+for+Automated+High-Throughput+Nanoliter+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture.</a> Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).</li>
<li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li>
<li>Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+culture+of+droplet-confined+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Dynamic culture of droplet-confined cell arrays.</a> Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).</li>
<li>Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+perfusion+microfluidic+cell+culture+array+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).</li>
<li>King, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+real-time+gene+expression+living+cell+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array.</a> Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).</li>
<li>Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile%2C+fully+automated%2C+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system.</a> Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).</li>
<li>Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+-+Putting+electrowetting+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry - Putting electrowetting to work.</a> Science. 322, 539-540 (2008).</li>
<li>Gong, J., Kim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 898-906 (2008).</li>
<li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+field+effect+transistor-based+biosensors+with+a+digital+microfluidic+device+for+a+lab-on-a-chip+application%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application.</a> Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for cell-based assays.</a> Lab Chip. 8, 519-526 (2008).</li>
<li>Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability%3A+incorporation+of+non-natural+amino+acids%2C+pseudo-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide.</a> 16, 3185-3203 (2010).</li>
<li>Miller, E. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+approach+to+homogeneous+enzyme+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays.</a> Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).</li>
<li>Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%3A+a+versatile+tool+for+applications+in+chemistry%2C+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology.</a> 12, 2452-2463 (2012).</li>
<li>Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidic+Magnetic+Separation+for+Particle-Based+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays.</a> Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).</li>
<li>Sista, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+immunoassays+using+magnetic+beads+on+a+digital+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform.</a> Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochip+functionalization+using+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidics+for+surface+plasmon+resonance+imaging+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+digital+microfluidics+for+enhanced+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).</li>
<li>Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidic+method+for+protein+extraction+by+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Nelson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubated+protein+reduction+and+digestion+on+an+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidic+chip+for+MALDI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS.</a> Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).</li>
<li>Mousa, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-scale+estrogen+assays+in+breast+tissue%2C+blood%2C+and+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum.</a> Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+method+for+dried+blood+spot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic method for dried blood spot analysis.</a> Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).</li>
<li>Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidics+for+Automated+Proteomic+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing.</a> J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).</li>
<li>Thaitrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+Next+Generation+Sequencing+Library+through+an+Integrative+Digital+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Shin, Y. J., Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+vision+for+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Machine vision for digital microfluidics.</a> Review of Scientific Instruments. 81, (2010).</li>
<li>Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+minimally+disturbed+synchronous+cultures+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells.</a> BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).</li>
<li>Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+adhesion+of+hematopoietic+cells+to+culture+dish+induces+endomitosis+and+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy.</a> Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).</li>
<li>Raje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+nylon+membrane+substrate+for+convenient+and+versatile+high+resolution+microscopic+analysis+of+Escherichia+coli+%26+mammalian+cells+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture.</a> Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).</li>
<li>Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics+with+nonaqueous+solvents+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions.</a> Lab Chip. 6, 199-206 (2006).</li>
<li>Perroud, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+cell+sorting+of+Francisella+tularensis+infected+macrophages+using+optical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces.</a> Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Malone, J. H., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays%2C+deep+sequencing+and+the+true+measure+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically-unified+cell+culture%2C+sample+preparation%2C+imaging+and+flow+cytometry+for+measurement+of+cell+signaling+pathways+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution.</a> Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).</li>
<li>Srivastava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+platform+enabling+automated+phosphoprofiling+of+macrophage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response.</a> Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben eine einfache und vielseitige automatisierte Plattform für die Mikro-Maßstab Zellkultur und Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform ermöglicht es uns, mit kleinen Mengen und Kultur Zellpopulationen (1 - 20 ul und 100 - 2.000 Zellen pro Kammer) arbeiten; Kultur Größen weiter durch Verwendung von Mikrokapillaren von kleineren Durchmesser reduziert werden konnte. Arbeiten bei diesen Skalen reduziert die Kosten für Routine-Untersuchungen und Studien, die machbar macht Gebrauch von wertvollen Rea...

Das Studium der Zellen in Kultur gehalten (in vitro-Analyse) hat einen wertvollen Einblick in die grundlegenden Prinzipien und molekularen Mechanismen, die komplexen biologischen Systemen und der menschlichen Gesundheit zur Verfügung gestellt. Die herkömmlichen Methoden für die Kultur, Anregung und Sammlung von Zellen für die Analyse, die Petrischalen und Mikrotiterplatten nutzen, wurden für die Studie von großen Populationen von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Maßstab Kulturvolumina (≥ 0,1 ml) ausgelegt. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen nur geringe Mengen von Zellen zur Verfügung stehen (z. B. primäre Zellen) oder kleine Zellpopulationen sind wünschenswert (zB Zell-zu-Zell-Variabilität in der Bevölkerung zu verringern), oder erforderlichen Reagenzien sind schwierig zu erhalten oder unerschwinglich teuer (zB gereinigte Zellen sezernierten Faktoren). Solche Probleme erfolgreich durch Verkleinerung Kultur Größe angesprochen werden, hat das den zusätzlichen Vorteil der Reduzierung des Verbrauchs allerReagenzien für die in-vitro-Analyse 1,2 erforderlich. Leider herkömmliche Geräte und Methoden unterstützen nicht präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen und Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit zur Verfügung 3-11 sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors. In diesem Bericht beschreiben wir die Montage und Verwendung eines einfachen und vielseitigen Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (100 - 2.000 Zellen) in Mikro-Maßstab Bände (1 - 20 ul). Die Plattform-Architektur (Abbildung 1) ist modular aufgebaut: eine Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren (&quot;cell Perfusionskammern&quot; Modul) dient als Standort für die Errichtung, Wartung und Stimulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und ein digitaler Mikrofluidik (DMF ) 12,13 Gerät mit &quot;Transfer&quot; Mikrokapillaren (&quot;zentrale Drehscheibe&quot; Modul) 14,15 Routen Zellen ausgestattetund Reagenzien zu und von den Perfusionskammern. DMF ermöglicht dem Anwender individuell ansprechen mehrere Tröpfchen gleichzeitig und zu ändern oder neu zu ordnen die Manipulationen (dh neu Probenaufbereitung Züge), ohne dass die Geräte-Hardware. Seine enorme Flexibilität in seiner jüngsten Entstehung als Schlüsseltechnologie in einer breiten Palette von Anwendungen, einschließlich der Zellkultur 16,17, Enzymassays 18,19, 20,21 Immunoassays, DNA-Analyse 22,23, Eiweiß Verarbeitung, 24,25 evident und klinischen Probe Verarbeitung. 26,27 Unsere zentrale Drehscheibe nutzt die inhärente Flexibilität DMF Geräte und weiter verbessert sie durch die Zugabe von mikrokapillaren Schnittstellen, die Möglichkeit zur Durchführung einer Teilmenge von Manipulationen (zB Zellkultur) in spezialisierten peripheren bietet Module, und nicht auf der DMF Gerät. Kompartimentierung der Verarbeitung Züge auf diese Weise vereinfacht auch Design der plaTForm Architektur (keine Notwendigkeit, ein Gerät, das DMF durchführen können alle Bearbeitungsschritte zu bauen) und erleichtert seine Entwicklung als neue Funktionen erforderlich sind (einfach Integration neuer Peripherie-Module je nach Bedarf). Transport von Zellen und Reagenzien innerhalb der zentralen Nabe wird durch Elektrobenetzung Kräfte durch sequentielle Aktivierung der Elektroden innerhalb des DMF Gerät erzeugt 13,28 angetrieben, Verkehr nach, von und innerhalb der Perfusionskammern wird von Druckänderungen, die durch eine hochpräzise Spritze erzeugten Strom versorgt Pumpe. Alle diese Bewegungen Fluid über eine einfache elektronische Schnittstelle gesteuert und automatisiert durch Verwendung von vorbestimmten Script. Als repräsentatives Beispiel zeigen wir die Verwendung der Plattform für die Untersuchung der Transkriptionsaktivität hervorgerufenen Reaktionen in Immunzellen auf Provokation mit Bakterien (Abbildung 2). Die Durchführung dieser Experimente auf der Plattform konnten wir mit einer kleinen Anzahl von Zellen (~ 1.000 pro experimentell arbeitental Bedingung), zu minimieren Experiment zu Experiment Variabilität, konservieren Reagenzien und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es überträgt, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, sollte diese Plattform in einer Vielzahl von Laboratorien und Anwendungen finden und doch besonders nützlich erleichtert Analyse von Zellen und Impulse, die in nur geringe Mengen sind.

<table><tbody><tr><td>Prelude Direct Lysis Module</td><td>NuGEN</td><td>1400-24</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4% w/v)</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cell</td><td>Cellgro</td><td>25-056-C1</td><td></td></tr><tr><td>Ovation PicoSL WTA</td><td>NuGEN</td><td>3310-048</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo BioParticles</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>CCL4 TaqMan qRT-PCR Assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443111_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCL5 TaqMan qRT-PCR Assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm01302428_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2 TaqMan qRT-PCR Assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00478374_m1</td><td></td></tr><tr><td>TNF TaqMan qRT-PCR Assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443258_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan qRT-PCR Assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm99999915_g1</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma Chemical</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinert FC-40</td><td>Sigma Chemical</td><td>51142-49-5</td><td></td></tr><tr><td>Parylene C Dimer</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td></td></tr><tr><td>Polyimidband</td><td>ULINE</td><td>S-11928</td><td></td></tr> Mit <tr><td>Indiumzinnoxid (ITO) beschichtete Glassubstrate </td><td>Delta Technologies</td><td>CB-40IN-1107</td><td></td></tr><tr><td>DMF-Nabe Teflonbeschichtete Mikrokapillaren aus Quarzglas</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSU100375</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillaren in der Perfusionskammer</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP530700</td><td></td></tr><tr><td>Schläuche und Mikrokapillarverschraubungen</td><td>Sandia National Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Schlauch</td><td>Paradigm Optics</td><td>CTPC100-500-5</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsspritzenpumpe mit 8 Anschlüssen, ausgestattet mit 30 mm (500 &#956; l Kapazität) Spritzen</td><td>Hamilton Company</td><td>54848-01</td><td></td></tr><tr><td>Parylene-C Gasphasenabscheidungsgerät</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>PDS 2010 Labcoter 2</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungs-Funktionsgenerator</td><td>Trek</td><td>615A-1 615-3</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Optional (erleichtert die Verfolgung von Tröpfchen auf der DMF-Nabe)</td></tr><tr><td>QIClick digitale CCD-Kamera</td><td>QImaging</td><td>QIClick-F-CLR-12</td><td>Optional (erleichtert die Verfolgung von Tröpfchen auf der DMF-Nabe)</td></tr></tbody></table>

eine vielseitige automatisierte plattform für mikro-skala handy stimulation experimente

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Studium der Zellen in Kultur (in vitro-Analyse) hat wichtige Einblicke in komplexe biologische Systeme zur Verfügung gestellt. Herkömmliche Verfahren und Anlagen für die in vitro-Analyse sind gut geeignet, um einer großen Anzahl von Zellen (≥ 10 5) in Milliliter-Skala Volumina (≥ 0,1 ml) zu untersuchen. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen es notwendig oder wünschenswert sein, Kultur Größe verkleinern, um den Verbrauch der Zellen von Interesse und / oder Reagenzien für die Kultur, Stimulation oder der Verarbeitung zu reduzieren. Leider haben konventionelle Ansätze nicht unterstützt präzise und reproduzierbare Manipulation von Mikro-Maßstab Kulturen, und die Mikrofluidik-basierte automatisierte Systeme, die derzeit verfügbar sind zu komplex und spezialisiert für den routinemäßigen Einsatz von den meisten Labors. In Mikro-Maßstab Volumen - Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine einfache und vielseitige Technologie-Plattform für die automatisierte Kultur, Anregung und Wiederherstellung von kleinen Populationen von Zellen (2000 Zellen 100) entwickelts (1 - 20 ul). Die Plattform besteht aus einer Reihe von fibronektinbeschichtete Mikrokapillaren (&quot;cell Perfusionskammern&quot;), in dem Mikro-Maßstab Kulturen etabliert, werden beibehalten und angeregt, eine digitale Mikrofluidik (DMF)-Gerät mit &quot;Transfer&quot; Mikrokapillaren (&quot;zentrale Drehscheibe ausgestattet &quot;), die Strecken Zellen und Reagenzien zu und von den Perfusionskammern; eine hochpräzise Spritzenpumpe, die Befugnisse Transport von Materialien zwischen den Perfusionskammern und der zentralen Nabe und eine elektronische Schnittstelle, die Kontrolle über den Transport von Materialien bietet, das ist koordiniert und automatisiert via vorgegebenen Skripten. Als Beispiel haben wir die Plattform zur Untersuchung der transkriptionellen Reaktionen hervorgerufen in Immunzellen auf Herausforderung mit Bakterien zu erleichtern. Die Nutzung der Plattform konnten wir den Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu reduzieren, minimieren Experiment zu Experiment Variabilität und re-direct hands-on Arbeit. Angesichts der Vorteile, die es verleiht, sowie die Erreichbarkeit und die Vielseitigkeit, our Plattform sollte den Einsatz in einer Vielzahl von Laboren und Anwendungen zu finden, und als besonders nützlich erweisen bei der Erleichterung der Analyse von Zellen und Stimuli, die in nur begrenzten Mengen sind.

Als Demonstration der automatisierten Plattform, haben wir es für die Durchführung einer Studie, in der kleinen Populationen von Immunzellen im Mikro-Maßstab gezüchtet wurden, mit Bakterien herausgefordert, und lysiert für off-Plattform Analyse von pro-inflammatorischen Reaktionen (Abbildung 2 ). Jeder der sechs Zellen Perfusionskammern wurde mit 10 4 Immunzellen (P388D.1 murine Makrophagen) in 10 ul Wachstumsmedium resuspendiert ausgesät. Nach einer Einhaltung Ze...

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine halbautomatisierte, mikrofluidikbasierte Plattform zusammenzustellen und zu nutzen, um kleine Zellpopulationen zu kultivieren und zu stimulieren sowie Zelllysate für molekularbiologische Analysen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst mikroskalige Zellkulturen in mit Fibronectin beschichteten Mikroküvetten – sogenannten Perfusionkammern – etabliert werden. Im zweiten Schritt werden die Perfusionkammern mit einem digitalen mikrofluidischen (DMF-)Modul verbunden, das eine flexible Steuerung der Reagenzien zu und von den mikroskaligen Zellkulturen ermöglicht.Anschließend gibt das DMF-Modul den gewünschten Stimulus an die Perfusionskammern ab, und die Zellen werden für eine vorbestimmte Einwirkdauer mit dem Stimulus inkubiert. Schließlich werden die Zellen chemisch lysiert und die Lysate auf dem DMF-Modul gesammelt, um eine molekulare Analyse durchzuführen. Die gewonnenen Lysate werden anschließend mittels quantitativer R-T-P-C-R analysiert, um die transkriptionelle Antwort der Zellpopulation auf den Stimulus zu charakterisieren.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen Zellkultivierungsmethoden liegt darin, dass damit Zellstimulationsstudien mit geringen Zellmengen sowie geringen Reagenzmengen durchgeführt werden können. Unsere Forschung hat gezeigt, dass die präzise Handhabung von Zellen und Reagenzien durch die Plattform im Mikromaßstab die Variabilität von Experiment zu Experiment minimiert. Die Plattform ist außerdem sehr vielseitig. Das digitale Mikroflussmodul kann Zellen und Reagenzien mit großer Flexibilität zu und von den Perfusionskammern leiten, sodass Experimente schnell und einfach angepasst und neu konfiguriert werden können. Bereiten Sie zunächst eine sterile Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin vor und verwenden Sie eine mehrkanalige Spritzenpumpe, um 30 Mikroliter der Lösung in jede Mikrokappe zu ziehen, um die Beschichtung der inneren Oberflächen der Mikrokappen zu beschleunigen. Inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius, ziehen Sie anschließend die Fibronectin-Lösung ab, entsorgen Sie sie und lassen Sie die Mikrokappen sechs Stunden lang bei Raumtemperatur trocknen.Verbinden Sie als Nächstes die mit Faser beschichteten Mikrokappillaren oder Perfusionskammern über Kapillarverbindungsstücke mit Polycarbonat-Schläuchen und diese mit der Spritzenpumpe. Der hier gezeigte Aufbau verwendet eine Spritzenpumpe mit sechs Anschlüssen für Perfusionskammern. Sichern Sie den Körper jeder Perfusionskammer mit Klebeband an einem Wärmeblock und stellen Sie die Temperatur des Wärmeblocks auf 37 Grad Celsius ein.Tauchen Sie dann die offenen Enden der Perfusionskammern in ein Reservoir, das Zellen in frischem Wachstumsmedium enthalten, gleichmäßig dispergiert mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Weisen Sie die Spritzenpumpe an, 10 Mikroliter der Zellsuspension in jede Perfusionskammer zu ziehen. Entfernen Sie danach die offenen Enden der Perfusionskammern aus der Zellsuspension und weisen Sie die Spritzenpumpe an, genügend Luft anzusaugen, um die Flüssigkeitspfropfen in die Abschnitte zu bewegen, die am Heizblock befestigt sind.Lassen Sie die Zellen durch Inkubation bei 37 Grad Celsius für eine bis zwei Stunden an den mit Fibronectin beschichteten inneren Oberflächen der Perfusionskammern anhaften. In der Zwischenzeit bringen Sie die offenen Enden der Perfusionskammern in ein neues Reservoir mit frischem Wachstumsmedium. Nach der Anhaftphase weisen Sie die Spritzenpumpe an, die Flüssigkeitsportionen in den Abfall zu leiten und anschließend 10 µL frisches Medium in jede Perfusionskammer zu ziehen, gefolgt von ausreichend Luft, um das frische Medium über den angehefteten Zellen zu positionieren.Setzen Sie die Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius fort und wechseln Sie das Medium alle zwei Stunden, bis die Kulturen ausreichend equilibriert und expandiert sind. Muster. Die untere Platte des DMF-Moduls mit 46 Indium-Zinn-Oxid-Elektroden. Beschichten Sie die untere Platte des DMF-Moduls mittels chemischer Gasphasenabscheidung mit fünf Mikrometern Lene C und anschließendem Spin-Beschichten mit 50 Nanometern Teflon af, unter Verwendung standardmäßiger photolithografischer Techniken.Als Nächstes spinnt man eine unstrukturierte Indium-Zinn-Oxid-Glasunterlage mit 50 Nanometern Teflon AF beschichtet, die als obere Platte dient. Verwenden Sie Metallkompressionsrahmen, um die Platten in einem Polymerguss mit Ausnehmungen zu befestigen, die einen Abstand von 400 Mikrometern zwischen den Platten aufrechterhalten. Dieser Abstand in Kombination mit der Aktivierungselektrodenfläche von 2,5 Quadratmillimetern definiert das Tröpfchenvolumen als 2,5 Mikroliter pro Elektrode.Danach Teflon-beschichtete Transfer-Mikrokapillaren in den Zwischenraum zwischen den DMF-Platten einsetzen. Jede so positionieren, dass sie sich von der Kante der zugehörigen Aktivierungselektrode bis zum gegenüberliegenden Ende des jeweiligen Transfers erstreckt. An der Mikrokapillare ein Capite-Fitting befestigen.Danach die elektrischen Anschlüsse verbinden, um Spannung an die Indium-10-Oxid-Elektroden anzulegen. Die Aktivierungssequenzen der Elektroden werden automatisiert durch eine computergesteuerte elektronische Schnittstelle ausgeführt, die vordefinierte Skripte abarbeitet. Anschließend füllen Sie die an Bord befindlichen Reservoirs der DMF-Module mit den geeigneten Reagenzien für die Zellstimulation, das Waschen und die Lyse.In einigen Fällen ist es am besten, den Stimulus selbst in einem späteren Schritt unmittelbar vor dessen Verwendung zu laden, wobei aus den geladenen Onboard-Reservoirs gezogen wird, um Mikrotropfen auf das DMF-Modul abzugeben. Testen Sie die Aktivierung der Mikrotropfen, einschließlich ihres Transports zwischen dem DMF-Modul und den Transfer-Mikrokappillaren. Blais. Bereiten Sie zunächst den Stimulus in frischem Medium mit 0,1 % F127 in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter vor.Beladen Sie anschließend 80 bis 100 Mikroliter des Stimulus in den dafür vorgesehenen Onboard-Vorratsbehälter. Entfernen Sie danach die offenen Enden der Perfusionskammern aus dem Mediumreservoir und führen Sie sie in die Kapillarhalterungen ein, die an den Enden der Transfer-Mikrokapillaren befestigt sind; weisen Sie anschließend die Spritzenpumpe an, die Flüssigkeitsstopfen innerhalb der Perfusionskammern in den Abfallbehälter zu befördern. Danach weisen Sie das DMF-Modul an, 10-Mikroliter-Tropfen des Stimulus zu erzeugen und mittels der Transfer-Mikrokapillaren zu den Perfusionskammern zu transportieren.Die Zellen bei Bedarf eine bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit dem Stimulus inkubieren. Nach der Stimulationsphase den Stimulus in regelmäßigen Abständen durch frischen Stimulus ersetzen. Die Spritzenpumpe anweisen, den Stimulus in den Abfallbehälter zu leiten, und das DMF-Modul anweisen, einen 10 µL-Tropfen Waschpuffer in jede Perfusionskammer abzugeben.Inkubieren Sie die Zellen mit dem Waschpuffer für fünf Minuten. Danach ersetzen Sie den Waschpuffer durch 10 Mikroliter Lysepuffer und inkubieren für weitere fünf Minuten. Danach weisen Sie die Spritzenpumpe an, jeden Zelllysatabstrich zum DMF-Modul zu transportieren.Entfernen Sie die obere Platte des DMF-Moduls, wobei darauf zu achten ist, die Platte nicht seitlich zu kippen, da dies zu einer Kreuzkontamination zwischen den Tropfen führen kann. Sammeln Sie abschließend die Lysate aus dem offenen DMF-Modul mithilfe einer Pipettenmanette für eine Analyse außerhalb der Plattform, beispielsweise zur Genexpression oder Profilierung mittels quantitativer RT-PCR, um die Plattform für das nächste Experiment vorzubereiten. Tauchen Sie zunächst die Transfer-Mikrokappillaren, CAPITE-Verbindungsstücke und DMF-Modulplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10 %ige Bleiche ein, spülen Sie die DMF-Modulplatten anschließend mit Isopropanol und danach mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie sie mit Stickstoffgas ab und backen Sie sie dann 10 Minuten lang bei 160 Grad Celsius. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansiedlungsmethoden führten zur Adhärenz von etwa 500 Miren-Makrophagen pro Perfusionskammer. Nach einer Inkubation der Zellen mit Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius über 16 Stunden verdoppelte sich die Populationsgröße auf etwa 1000 Zellen pro Perfusionskammer. Dargestellt sind hier Ergebnisse einer quantitativen RT-PCR-Analyse von vier Genen, die bekanntermaßen wichtige Rollen bei der angeborenen Immunantwort auf Bakterien spielen.Die Makrophagen wurden entweder in konventionellen oder mikroskaligen Kulturen gezüchtet und mit E. coli-Biopartikeln für eine oder vier Stunden stimuliert. Die blauen Balken zeigen die durchschnittliche Faltungszunahme der Genexpression nach Stimulation konventionell kultivierter Zellen an, während die roten Balken die induzierte Expression in Zellen darstellen, die angezüchtet und stimuliert wurden. Bei mikroskaligen Kulturen zeigen die Fehlerbalken die Standardabweichungen zwischen biologischen Wiederholungen aus drei unabhängigen Experimenten an.Die Ergebnisse der Genexpression-Profilierung waren sehr ähnlich, obwohl die konventionellen Kulturen 96-Loch-Platten mit etwa 50.000 Zellen pro Loch verwendeten, während die mikroskaligen Kulturen Mikrokappillaren mit etwa 1.000 Zellen pro Perfusionskammer nutzten. Die experimentelle Variabilität war zumindest vergleichbar und oft geringer in den mikroskaligen Kulturen, wie durch die kürzeren Fehlerbalken angezeigt wird. Bei der Arbeit im Mikromaßstab ergab sich eine um den Faktor fünf verringerte Zellverbrauch und eine um den Faktor drei bis fünfzig verringerte Reagenzienverbrauch im Vergleich zu den konventionellen Experimenten.Die Methode könnte verwendet werden, um praktisch jeden Anheftungszelltyp zu kultivieren, wobei in einigen Fällen eine andere Komponente der extrazellulären Matrix oder ein anderes Wachstumsmedium erforderlich ist. Die Kultivierung von nicht-anklebenden Zelltypen kann herausfordernd sein, aber Strategien zur Verankerung von Zellen haben sich in ähnlichen Kontexten als erfolgreich erwiesen. Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Mikroskalenkultur für bis zu 24 Stunden.Die Plattform umfasst ebenfalls alle Funktionen für eine Langzeitkultur, jedoch muss ein Protokoll für die Zellpassage entwickelt werden. Zusätzliche Module können über die mikrokapillaren Anschlüsse in das digitale Mikrofluidik-System integriert werden. Auf diese Weise dient das DMF als zentraler Knotenpunkt, um periphere Module anzuschließen und komplexe Arbeitsabläufe durchzuführen.Wir konzentrierten uns hauptsächlich auf die Charakterisierung der transkriptionellen Reaktionen des Wirts auf infektiöse Agenten, aber die Plattform ist so konzipiert, dass sie äußerst vielseitig ist und daher eine breite Vielfalt von Forschungsanwendungen unterstützen sollte.

a-versatile-automated-platform-for-micro-scale-cell-stimulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines extrazellulären Matrix-beschichteten Mikrofluidik-Chips zur Unterscheidung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen oder NPCs durch elektrische Stimulation. Nach der Aussaat und dem Anhaften an der beschichteten Region wachsen NPCs, und die Anwendung eines Gleichstroms löst ihre Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten aus.

Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Eine neue statische Plattform wird verwendet, um Proteinstruktur- und Interaktionsstellen in der nativen Zellumgebung zu charakterisieren, indem eine Protein-Footprinting-Technik verwendet wird, die als schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IC-FPOP) in der Zelle bezeichnet wird.

Plattform-Inkubator mit beweglicher XY-Stufe: Eine neue Plattform zur Implementierung der in-Cell schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen

Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.

Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Erfahren Sie die automatisierte Mikrofluidik-Plattform zur Zellkultur und Stimulation kleiner Zellpopulationen mit DMF-Modul. Diese Methode ermöglicht präzise Reagenziensteuerung und Lysatgewinnung für molekulare Analysen.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Weitere Videos entdecken