Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, pH-empfindliche Nanosensoren und selbstberichtende Gerüste herzustellen, die in Echtzeit und vor Ort überwacht werden können, um zum Verständnis der Bedingungen beizutragen, die das Zellwachstum beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst biokompatible, auf Analyten ansprechende Nanosensoren hergestellt werden, die den pH-Wert über Fluoreszenzsignale überwachen können. In einem zweiten Schritt werden die pH-empfindlichen Nanosensoren in polymeren, elektrogesponnenen Gerüsten eingebettet, wodurch eine dreidimensionale Umgebung entsteht, auf der Zellen kultiviert und überwacht werden können.

Danach werden Säugetierzellen auf den elektrogesponnenen Gerüsten ausgesät, und Nanosensoren werden ebenfalls in ihr intrazelluläres Milieu eingebracht, um den intrazellulären pH-Wert zu überwachen. Während der Experimente werden Ergebnisse erzielt, die die Fähigkeit intrazellulärer Nanosensoren und selbstberichtender Gerüste zeigen, den pH-Wert in gewebeengineeringbasierten Umgebungen anhand von Fluoreszenzverhältnissen, die mittels konfokaler Mikroskopie gewonnen wurden, zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren, wie beispielsweise der Verwendung elektronischer pH-Elektroden, liegt darin, dass Messungen in situ und in Echtzeit durchgeführt werden können, ohne das Zellwachstum stören zu müssen.

Beginnen Sie damit, die Fluoreszenzfarbstoffe vorzubereiten, indem Sie 1,5 Milligramm Fam-SE in einem Milliliter Dimethylformamid, bekannt als DMF, in einem Rundkolben lösen. Lösen Sie außerdem 1,5 Milligramm Tamara-SE in einem Milliliter DMF in einem zweiten Kolben. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter Triaminopropyltriethylsilan zu jedem Kolben hinzu und rühren Sie kontinuierlich im Dunkeln unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre bei 21 °C über 24 Stunden.

Fügen Sie anschließend 250 µL beider Farbstofflösungen zu einer Mischung aus sechs mL Ethanol und vier mL Ammoniumhydroxid in einem Rundkolben hinzu. Rühren Sie diese neue Mischung nach einer Stunde bei 21 °C. Geben Sie langsam 0,5 mL Tetraethylorthosilikat zur Mischung hinzu und rühren Sie weitere zwei Stunden fort.

Während dieser Zeit ist zu erwarten, dass die Mischung trüb wird; sammeln Sie anschließend die Nanosensoren durch Rotationsevaporation und lagern Sie sie in einem Glasfläschchen bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung. Fügen Sie danach die getrockneten pH-Nanosensoren in einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter in Sorensen-Phosphatpuffern hinzu, die sich im pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5 in Schritten von pH 0,5 erstrecken. Resuspendieren Sie die Nanosensoren, indem Sie die Proben drei Minuten lang verwirbeln, und behandeln Sie sie anschließend fünf Minuten lang im Ultraschallbad oder bis die Lösung trüb wird.

Sammeln Sie Kalibrierungsdaten, indem Sie die Proben bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern für FAM und 568 Nanometern messen. Erfassen Sie für Tamara die Emissionen bei 500 bis 530 Nanometern für FAM und 558 bis 580 Nanometern für Tamara und berechnen Sie das Verhältnis der Emissionsmaxima, die bei jedem pH-Wert erzeugt wurden. Bereiten Sie anschließend die Probe für die REM-Bildgebung vor, indem Sie eine Probe der Nanosensoren auf einen mit Kohlenstoff beschichteten Elektronenmikroskop-Prüfling aufbringen und die Partikel fünf Minuten lang unter Argonatmosphäre mit Gold sputterbeschichten.

Nach der Beschichtung die Proben in das Elektronenmikroskop geben und den Arbeitsabstand, die Spannung und die Vergrößerung so einstellen, dass die Elektronenaufladung minimiert und die besten Bilder in einer Abzugshaube erzielt werden. Eine 20%ige PLGA-Lösung in Dichlormethan mit 1% Formiat herstellen. Die Lösung in eine 10-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 18-Gauge-Füllnadel laden und sicher auf einer Spritzenpumpe befestigen.

Diese Lösung wird verwendet, um Kontroll-PLGA-Gerüste herzustellen, wobei die Nadelspitze in einem Abstand von 20 Zentimetern zu einer 20 mal 15 Zentimeter großen Aluminiumsammelelektrode positioniert wird. Anschließend wird die Elektrode einer Hochspannungsstromquelle mit der Spitze der Spritze verbunden und der Masseleiter mit der Aluminiumsammelelektrode geerdet. Danach wird die Stromquelle eingeschaltet und die Spannung auf 12 Kilovolt eingestellt. Anschließend wird die Spritzenpumpe eingeschaltet und die Lösung zwei Stunden lang mit einer konstanten Flussrate von 3,5 Millilitern pro Stunde appliziert.

Dadurch ergibt sich eine Scaffoldtiefe von etwa 60 Mikrometern. Nach Beendigung schalten Sie das Gerät aus und lassen das Scaffold 24 Stunden im Abzug stehen, damit sich die Lösungsmittelrückstände verflüchtigen können. Um Scaffolds mit pH-empfindlichen Nanosensoren herzustellen, bereiten Sie die PLGA-Lösung wie zuvor vor, fügen Sie diesmal jedoch zusätzlich fünf Milligramm pro Milliliter der Nanosensoren hinzu.

Danach das pH-responsive mittels Elektrospinnen unter Verwendung der gleichen Einstellungen wie zuvor herstellen. Anschließend kalibrieren Sie die pH-Antwortfähigkeit des Gerüsts, indem Sie kleine Proben des getrockneten Gerüsts mit eingebetteten Nanosensoren in 35-Millimeter-Kulturplatten geben und diese in je zwei Milliliter Sørensen-Phosphatpuffer mit pH-Werten zwischen 5,5 und 7,5 in 0,5er-Schritten auf einem konfokalen Mikroskop tauchen. Verwenden Sie einen 488-Nanometer-Argonlaser zur Anregung von FAM und einen 568-Nanometer-Kryptonlaser zur Anregung von Tamara innerhalb der Nanosensoren.

Beobachten Sie die Emission bei 500 bis 530 Nanometern für FAM und bei 558 bis 580 Nanometern für Tamara und berechnen Sie anschließend das Verhältnis der Emissionsmaxima, die bei jedem pH-Wert erzeugt werden. Sterilisieren Sie zunächst die Oberflächen der Scaffolds mithilfe einer UV-Lichtquelle in einem Abstand von acht Zentimetern, wobei jede Seite 15 Minuten lang bestrahlt wird. Überführen Sie die Scaffolds danach unter sterilen Bedingungen in eine 12-Loch-Kulturplatte und legen Sie einen Stahlring mit einem Innendurchmesser von einem Zentimeter und einem Außendurchmesser von zwei Zentimetern über den Scaffold.

Fügen Sie anschließend PBS mit 5 % Pen/Strep auf die Innenseite und Außenseite des Stahlrings hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht. Am nächsten Tag entfernen Sie das PBS mit 5 % Pen/Strep und waschen die Scaffoldstrukturen mit PBS.

Anschießend 500 Mikroliter Zellkulturmedium innen und außen auf den Stahlring geben und die Platte in einem Inkubator vorwärmen. Danach die gewünschten Zellen gewinnen und eine Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter herstellen. Sobald die Zellen bereit sind, das Medium aus der Vertiefung entfernen und ein Milliliter frisches Medium außen auf den Stahlring geben.

Gegeben Sie anschließend 300 Mikroliter der Zellsuspension auf die Innenseite des Stahlrings und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 und inkubieren Sie die Zellen je nach Anforderung für den benötigten Zeitraum. Erneuern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, säen Sie die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben auf die Scaffolds aus und lassen Sie sie für 72 Stunden ungestört wachsen.

Spülen Sie die Zellen anschließend mit PBS und geben Sie 500 Mikroliter serumfreies Medium auf die Außenseite des Rings sowie 300 Mikroliter auf die Innenseite des Rings. Inkubieren Sie die Platte während der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie fünf Milligramm der Nanosensoren mit 50 Mikrolitern Optimum versetzen und kurz vortexen.

Dann wurde Lösung B hergestellt, indem fünf µL Lipo2000 zu 45 µL OptiMEM gegeben wurden, und das Gemisch fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Anschließend wurde Lösung A zum Gemisch aus Lösung B hinzugefügt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um Lösung C zu bilden, den Nanosensor-Liposomen-Komplex. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und geben Sie 100 µL der komplexen Lösung auf die Innenseite des Stahlrings.

Legen Sie die Platte anschließend erneut in den Inkubator und inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang mit den Lipectomie-Reagenz-Komplexen. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit erwärmtem PBS, bevor Sie das zellbesiedelte Gerüst in Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten tauchen, um die Reaktion der Nanosensoren zu überwachen. Bilden Sie die Zellen nun innerhalb der Zellen mittels fluoreszenzbasierter konfokaler Mikroskopie ab, um die Lokalisation der Nanosensoren in Säugetierzellen zu verfolgen.

Bereiten Sie zunächst nur fam-haltige Nanosensoren vor und geben Sie diese auf Zellen, die auf PLGA-Gerüsten sitzen. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter eines 50 Nanomolar-Lyo-Tracker-Red zu 300 Mikrolitern Medium hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubationszeit entfernen Sie das Medium und waschen die Zellen zweimal mit PBS.

Fügen Sie anschließend entweder zwei Mikroliter PBS oder ein anderes phenolrotfreies Medium hinzu, um die Zellen während der konfokalen Bildgebung zu bedecken. Danach geben Sie fünf Mikromolar des Kernfarbstoffs Drac-5 zum PBS hinzu und inkubieren die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach drei Minuten entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und platzieren sie auf dem konfokalen Mikroskoptisch zur Bildaufnahme. Bilden Sie mithilfe verschiedener Anregungs- und Emissionswellenlängen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, die nanoskaligen Sensoren, sauren Organellen und den Zellkern ab, wobei Sie eine sequenzielle Abtastung verwenden, um die Erfassung von Übersprechanregungswellenlängen zu vermeiden. Die Größenverteilung der hergestellten pH-empfindlichen Nanosensoren wurde mittels REM charakterisiert, wobei die abgebildete Population der Nanosensoren vermessen wurde und nanometrische Abmessungen im Bereich von 240 bis 470 Nanometern aufwies.

Links ist ein Bild von elektrogesponnenen PLGA-Fasern zu sehen, rechts elektrogesponnene PLGA-Fasern mit Nanosensoren. Die REM-Aufnahmen der Fasern liefern Hinweise auf die Assoziation der Nanosensoren mit der Oberfläche der Fasern. Allerdings können sie auch innerhalb der Gerüstfasern eingebaut sein.

Nach dem Elektrospinnen behalten die Nanosensoren ihre Fähigkeit, optisch und chemisch aktiv zu bleiben, bei und sind hier in Verbindung mit den Gerüstfasern dargestellt. Links ist der Fam-Farbstoff in grün und rechts der Tamara-Farbstoff in rot dargestellt. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität ergibt eine Kalibrierungskurve, wie hier gezeigt.

Nanosensoren, die allein und nach Einbau in elektrogesponnene PLGA-Gerüste untersucht wurden, zeigten übereinstimmende Ergebnisse, was darauf hinweist, dass die Nanosensoren ihre optische Aktivität nach der Integration in die Gerüste beibehalten. Die eingebauten Nanosensoren reagierten außerdem umkehrbar gut auf wechselnde pH-Werte, während der Puffer zwischen einem pH-Wert von 5,5 und 7,5 alterniert wurde. Das FAM-TAMRA-Verhältnis reagierte jedes Mal vorhersehbar.

Hier sind konfokale Aufnahmen von Fibroblasten, denen Nanosensoren mittels Transfektionsreagenz intrazellulär zugeführt wurden. Die punktförmige Kolokalisation der Fam- und Tamara-Farbstoffe deutet darauf hin, dass die Farbstoffe weiterhin in der Nanosensor-Matrix eingeschlossen blieben. Die intrazelluläre Abgabe der Nanosensoren kann bestätigt werden, indem das Fam/Tamara-Verhältnis von Zellen gemessen wird, die in verschiedene Puffer gegeben wurden.

Wie hier zu sehen ist, steigt das Verhältnis bei der Messung der Gerüst-basierten Nanosensoren an, bleibt jedoch bei der Messung der Sensoren innerhalb der Zellen konstant. Nach der Entwicklung dieser Technik können Forscher im Bereich des Gewebegeneration in situ und in Echtzeit untersuchen. Mikroumgebungsbedingte intrazelluläre pH-Änderungen innerhalb dreidimensionaler zellulärer Konstrukte, ohne den laufenden Versuch zu stören.