Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, pH-empfindliche Nanosensoren und selbstmeldende Gerüste herzustellen, die in Echtzeit und in situ überwacht werden können, um das Verständnis der Bedingungen zu unterstützen, die das Zellwachstum beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst biokompatible Analyt-responsive Nanosensoren hergestellt werden, die den pH-Wert durch Fluoreszenzausgänge überwachen können. In einem zweiten Schritt werden pH-empfindliche Nanosensoren in polymere elektrogesponnene Gerüste eingebaut, die eine 3D-Umgebung bilden, in der Zellen kultiviert und überwacht werden können.

Als nächstes werden Säugetierzellen auf die Elektrosponnen gesponnen, Gerüste und Nanosensoren in ihre intrazelluläre Umgebung gebracht, um den intrazellulären pH-Wert zu überwachen. Während der Experimente werden Ergebnisse erzielt, die die Fähigkeit von intrazellulären Nanosensoren und selbstberichtenden Gerüsten zeigen, den pH-Wert in Tissue-Engineering-Umgebungen auf der Grundlage von Fluoreszenzverhältnissen zu überwachen, die durch konfokale Mikroskopie erfasst wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Verwendung elektronischer pH-Sonden, besteht darin, dass Messungen in situ und in Echtzeit durchgeführt werden können, ohne das Zellwachstum stören zu müssen.

Bereiten Sie zunächst die Fluorophore her, indem Sie 1,5 Milligramm fam SE in einem Milliliter Dimethylformamid, bekannt als DMF, in einem runden Boden auflösen. Der Kolben löst außerdem 1,5 Milligramm Tamara SE in einem zweiten Kolben in einem Milliliter DMF auf. Dann gibst du 1,5 Milliliter drei Aminopropyltriethyl in jeden Kolben und rührst 24 Stunden lang im Dunkeln unter trockener Stickstoffatmosphäre bei 21 Grad Celsius kontinuierlich um.

Sodann werden 250 Mikroliter beider Farbstofflösungen zu einem Gemisch gegeben, das sechs Milliliter Ethanol und vier Milliliter Ammoniumhydroxid enthält, die in einem Rundkolben enthalten sind. Rühren Sie diese neue Mischung nach einer Stunde bei 21 Grad Celsius um. Fügen Sie der Mischung langsam 0,5 Milliliter Tetraethylorthos-Silikat hinzu und rühren Sie sie weitere zwei Stunden lang weiter.

Während dieser Zeit können Sie damit rechnen, dass sich das Gemisch trüb verfärbt, dann sammeln Sie die Nanosensoren durch Rotationsverdampfung und lagern Sie sie in einem Glasfläschchen bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Fügen Sie als Nächstes die getrockneten pH-Nanosensoren mit fünf Milligramm pro Milliliter in Sorenson-Phosphatpuffern hinzu, die von pH 5,5 bis pH 7,5 in Schritten von pH 0,5 reichen. Resuspendieren Sie die Nanosensoren, indem Sie die Proben drei Minuten lang vortexen und dann fünf Minuten lang beschallen oder bis die Lösung trüb wird.

Sammeln Sie Kalibrierungsdaten, indem Sie die Proben bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern für FAM und 568 Nanometern messen. Erfassen Sie für Tamara die Emissionen bei 500 bis 530 Nanometern für FAM und 558 bis 580 Nanometern für Tamara und berechnen Sie das Verhältnis der Emissionsmaxima, die bei jedem pH-Wert erzeugt werden. Bereiten Sie dann die Probe für die REM-Bildgebung vor, indem Sie eine Probe von Nanosensoren auf ein kohlenstoffbeschichtetes Elektronenmikroskop legen und die Partikel fünf Minuten lang unter Argonatmosphäre mit Gold beschichten.

Legen Sie die Proben nach der Beschichtung in das Elektronenmikroskop und passen Sie den Arbeitsabstand, die Spannung und die Vergrößerung an, um die Elektronenladung zu minimieren und die besten Bilder in einem Abzug zu erzeugen. Stellen Sie eine 20%ige PLGA-Lösung in Dichlormethan mit 1%Perineumformiat her. Laden Sie die Lösung in eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel mit stumpfer Füllung und setzen Sie sie sicher auf eine Spritzenpumpe.

Diese Lösung wird verwendet, um Kontroll-PLGA-Gerüste dazu zu bringen, die Nadelspitze 20 Zentimeter von einer 20 x 15 Zentimeter großen Aluminiumsammelplatte zu entfernen und die Elektrode eines Hochspannungsnetzteils an der Spitze der Spritze zu befestigen und den Draht an der Aluminiumsammelplatte zu erden. Schalten Sie anschließend das Netzteil ein und stellen Sie die Spannung auf 12 Kilovolt ein. Schalten Sie dann die Spritzenpumpe ein und geben Sie die Lösung zwei Stunden lang mit einer konstanten Durchflussmenge von 3,5 Millilitern pro Stunde ab.

Dadurch wird eine Gerüsttiefe von ca. 60 Mikrometern erreicht. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das Gerät aus und lassen Sie das Gerüst 24 Stunden lang im Abzug, damit die Lösungsmittelrückstände verdunsten können. Um Gerüste herzustellen, die mit pH-empfindlichen Nanosensoren ausgestattet sind, bereiten Sie die PLGA-Lösung wie zuvor vor, fügen Sie diesmal jedoch auch fünf Milligramm pro Milliliter der Nanosensoren hinzu.

Drehen Sie dann den pH-Wert mit den gleichen Einstellungen wie zuvor auf den pH-Wert ein. Als nächstes kalibrieren Sie die pH-Reaktionsfähigkeit des Gerüsts, indem Sie kleine Proben des getrockneten Gerüsts mit eingebauten Nanosensoren in 35-Millimeter-Kulturplatten legen und sie in zwei Milliliter Sorensenphosphatpuffer zwischen pH 5,5 und 7,5 in Schritten von 0,5 auf einem konfokalen Mikroskop eintauchen. Verwenden Sie einen 488-Nanometer-Argon-Laser, um FAM anzuregen, und einen 568-Nanometer-Krypton-Laser, um Tamara innerhalb der Nanosensoren anzuregen.

Beobachten Sie die Emission bei 500 bis 530 Nanometern für FAM und 558 bis 580 Nanometern für Tamara und berechnen Sie dann das Verhältnis der Emissionsmaxima, die bei jedem pH-Wert erzeugt werden. Sterilisieren Sie zunächst die Oberflächen der Gerüste mit einer UV-Lichtquelle im Abstand von acht Zentimetern für 15 Minuten auf jeder Seite. Übertragen Sie dann die Gerüste steril auf eine 12-Well-Kulturplatte und platzieren Sie einen Stahlring mit einem Innendurchmesser von einem Zentimeter und einem Außendurchmesser von zwei Zentimetern über dem Gerüst.

Geben Sie anschließend PBS mit 5%-Stiftstreifen auf die Innen- und Außenseite des Stahlrings und inkubieren Sie die Proben über Nacht. Am nächsten Tag. Entfernen Sie das PBS mit 5%Pen Streptokokken und waschen Sie die Gerüste mit PBS.

Geben Sie dann 500 Mikroliter Zellkulturmedium auf die Innen- und Außenseite des Stahlrings und wärmen Sie die Platte in einem Inkubator vor. Ernten Sie als Nächstes die interessierenden Zellen und bereiten Sie eine Zellsuspension von eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter vor. Wenn die Zellen fertig sind, nehmen Sie das Medium aus der Vertiefung und geben Sie einen Milliliter frisches Medium an die Außenseite des Stahlrings.

Geben Sie dann 300 Mikroliter der Zellsuspension in die Innenseite des Stahlrings und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2 und inkubieren Sie die Zellen so lange wie nötig. Aktualisieren Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, säen Sie die Zellen auf die Gerüste, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, und lassen Sie sie 72 Stunden lang ununterbrochen wachsen.

Spülen Sie dann die Zellen mit PBS und fügen Sie 500 Mikroliter serumfreies Medium an der Außenseite des Rings und 300 Mikroliter im Inneren des Rings hinzu. Inkubieren Sie die Platte während der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie fünf Milligramm der Nanosensoren mit 50 Mikrolitern Optimum hinzufügen und kurz Unzucht treiben.

Mischen Sie dann Lösung B, indem Sie fünf Mikroliter Lipektomie 2000 bis 45 Mikroliter Optum hinzufügen und lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann Lösung A zu Lösung B hinzu und inkubieren Sie sie dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um Lösung C zu bilden, bei der es sich um den Nanosensor-Liposomenkomplex handelt. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und geben Sie 100 Mikroliter der komplexen Lösung in die Innenseite des Stahlrings.

Setzen Sie dann die Platte wieder in den Inkubator ein und inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation drei Stunden lang mit den Lipektomie-Reagenzkomplexen. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit erwärmtem PBS, bevor Sie das zellsitzende Gerüst in Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten eintauchen, um die Reaktion der Nanosensoren zu überwachen. Im Inneren der Zellen können Sie die Zellen nun mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie abbilden, um die Position der Nanosensoren in Säugetierzellen zu verfolgen.

Erstens: Bereiten Sie nur Fässer mit Nanosensoren vor und liefern Sie sie an Zellen, die auf PLGA-Gerüsten sitzen. Geben Sie dann zwei Mikroliter 50 nanomolaren lyo tracker red auf 300 Mikroliter Medium und inkubieren Sie nach der Inkubationszeit eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.

Fügen Sie dann entweder zwei Mikroliter PBS oder ein anderes phenolrotfreies Medium hinzu, um die Zellen während der konfokalen Bildgebung abzudecken. Als nächstes fügen Sie fünf Mikromolare des Kernflecks hinzu, drac fünf in das PBS und inkubieren Sie mit den Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie nach drei Minuten die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie auf den konfokalen Tisch für die Bildgebung des Bildes, die sauren Organellen und den Zellkern der Nanosensoren unter Verwendung verschiedener Anregungs- und Emissionswellenlängen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, während sequentielles Scannen verwendet wurde, um eine Ansammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden, wurde die Größenverteilung der vorbereiteten pH-empfindlichen Nanosensoren mit Hilfe von REM charakterisiert, wobei die Population der abgebildeten Nanosensoren gemessen und als haben Nanometerabmessungen im Bereich von 240 bis 470 Nanometern.

Links ist ein Bild von elektrogesponnenen PLGA-Fasern zu sehen, und rechts sind elektrogesponnene PLGA-Fasern mit Nanosensoren zu sehen. Die REM-Mikroskopaufnahmen der Fasern liefern Hinweise auf die Assoziation von Nanosensoren auf der Oberfläche der Fasern. Sie können aber auch in die Gerüstfasern eingearbeitet werden.

Einmal gedrehte Elektros, behalten die Nanosensoren ihre Fähigkeit, optisch und chemisch aktiv zu bleiben, und sind hier in Verbindung mit den Gerüstfasern zu sehen. Links ist der Fam-Farbstoff in Grün und auf der rechten Seite der Tamara-Farbstoff in Rot dargestellt. Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis erzeugt eine Kalibrierkurve, wie hier gezeigt.

Nanosensoren, die allein bewertet wurden, und wenn sie in elektrogesponnene PLGA-Gerüste eingebaut wurden, spiegelten sich gegenseitig, was zeigt, dass die Nanosensoren ihre optische Aktivität nach dem Einbau in die Gerüste beibehalten. Die eingebauten Nanosensoren reagieren auch reversibel gut auf sich ändernde pH-Werte, da der Puffer zwischen einem pH-Wert von 5,5 und 7,5 wechselte. Das fam-Tamra-Verhältnis reagierte vorhersehbar jedes Mal, wenn es gezeigt wurde.

Hier sind konfokale Bilder von Fibroblasten, bei denen Nanosensoren intrazellulär über ein Transfektionsreagenz verabreicht wurden. Die punktuelle Kolokalisation der Fam- und Tamara-Farbstoffe deutet darauf hin, dass die Farbstoffe in der Nanosensormatrix eingeschlossen blieben. Die intrazelluläre Verabreichung der Nanosensoren kann durch Messung des fam-Tamara-Verhältnisses von Zellen bestätigt werden, die in verschiedenen Puffern platziert wurden.

Wie Sie hier sehen können, steigt das Verhältnis bei der Messung der gerüstbasierten Nanosensoren, bleibt aber konstant, wenn die Sensoren innerhalb der Zellen gemessen werden. Nach der Entwicklung dieser Technik können Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering in situ und in Echtzeit untersuchen. Der intrazelluläre pH-Wert der Mikroumgebung ändert sich innerhalb von 3D-Zellkonstrukten, ohne das laufende Experiment zu stören.