Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine schnelle und verallgemeinerbare Strategie zur reversiblen, immobilisierenden Immobilisierung kleiner Moleküle und funktionalisierter Nanopartikel auf der Oberfläche von Sensorchips zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Anti-GST-Antikörper auf einer Sensoroberfläche immobilisiert werden. In einem zweiten Schritt wird das GST-Antigen erfasst.

Funktionalisiert mit trans-Cyclo-, Octin- oder Tetrazingruppen bietet eine reaktive Oberfläche für nachfolgende Cyclo-Edition-Reaktionen mit niedermolekularen Tet-Sinus-Derivaten oder Nanopartikel-Trend-Cyclo-Octan-Konjugaten, die anschließend mit niedermolekularen Tet-Sinus-Derivaten funktionalisiert werden. Als nächstes kann die funktionalisierte Oberfläche für die Interaktionsanalyse mit einem gewünschten löslichen Ziel verwendet werden. Im letzten Schritt wird die Oberfläche regeneriert, was eine anschließende Einfangzyklen-Editionszyklen ermöglicht. Die Bindungsergebnisse zeigen auf dem Schiff: Bioorthogonale Reaktionen bewahren die Fähigkeit immobilisierter kleiner Moleküle oder situieren zwei funktionalisierte Nanopartikel, mit dem FK BP 12-Target zu interagieren, und veranschaulichen, wie dieser Ansatz das Anwendungsspektrum von SPR erweitern kann.

Der Hauptvorteil dieser On-Chip-Capture-Cycle-Edition-Technik besteht darin, dass sie eine schnelle Reversibilität und Mobilisierung kleiner Moleküle mit Kontrolle über die Orientierung und die I-Mobilisierungsdichte ermöglicht. In der Regel kann der Capture-Cycle-Edition-Prozess innerhalb von Minuten durchgeführt werden, wodurch die Oberflächenvorbereitungszeiten erheblich verkürzt werden, was zeigt, dass das Verfahren von Jason Sandler, einem Studenten aus unserem Labor, durchgeführt wird. Um dieses Verfahren bei acht Mikrolitern einer 50 Millimolare T-C-O-N-H-S-Lösung in DMSO bis zu 100 Mikrolitern einer GST-Lösung von einem Milligramm pro Milliliter in PBS zu beginnen. Nachdem Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt haben, entfernen Sie das überschüssige Reagenz mit einer Zeba-Spin-Entsalzungssäule.

Als nächstes fügen Sie sechs Mikroliter einer 25 Millimolare Tetra NHS Ester-Lösung in DMF zu 75 Mikrolitern einer 1 Milligramm pro Milliliter GST Lösung in PBS hinzu und schütteln Sie die Mischung nach einer Stunde bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wird mit 25 Mikrolitern PBS verdünnt und mit einer Schleuderentsalzungssäule gereinigt. Geben Sie dann 100 Mikroliter der 50 millimolaren T-C-O-N-H-S-Lösung zu 150 Mikrolitern einer emanierten Nanopartikellösung und schütteln Sie die Mischung auf die gleiche Weise wie zuvor.

Entfernen Sie nach dem Mischen das überschüssige Reagenz durch Gelfiltration mit einer NAP 10-Säule. Angespielt mit PBS-Puffer. Sammeln Sie das farbige Band mit dem N-P-T-C-O-Produkt.

Die gereinigte Probe wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das eine Zentrifugalfiltervorrichtung mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100.000 enthält. Anschließend wird die Probe nach der Zentrifugation auf ein Endvolumen von etwa 150 Mikrolitern konzentriert. Geben Sie 50 Mikroliter 0,1 molare Cynikanhydridlösung in DMSO zur N-P-T-C-O-Lösung.

Nachdem Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt haben, reinigen Sie das N-P-T-C-O-Produkt mit einer NAP-10-Säule, die mit PBS ausweicht, unter Verwendung eines Oberflächenplasma-in-Resonanz-Instruments, wählen Sie die Immobilisierung an den Durchflusszellen eins und zwei in der Vorlage des AM-Immobilisierungsassistenten. Modifizieren Sie die Amin-Methode so, dass Oberflächencarbonsäuregruppen durch Injektion einer Eins-zu-Eins-Lösung aus 0,4 molaren EDC und 0,1 molaren NHS für 480 Sekunden aktiviert werden. Bei einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute wird die Injektion von Ethanolamin so eingestellt, dass die verbleibenden aktivierten Ester auf eine 422. Kontaktzeit bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute abgeschreckt werden.

Geben Sie den Ligandennamen anti GST ein und stellen Sie ihn so ein, dass er für eine Kontaktzeit von 420 Sekunden bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute injiziert. Legen Sie anschließend die zuvor vorbereiteten Lösungsfläschchen in das zweite Reagenzienrack. Stellen Sie sicher, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen, nachdem Sie den Dateinamen und das Ziel zugewiesen haben, an dem die Daten gespeichert werden.

Starten Sie die Immobilisierung. Bearbeiten Sie den Immobilisierungsassistenten so, dass nur 20 Mikrogramm pro Milliliter der GST-Ligandenlösung für 420 Sekunden bei fünf Mikrolitern pro Minute über die Referenz-Durchflusszelle eins injiziert werden. Die Durchstechflaschen mit G-S-T-T-C-O-A, der zuvor hergestellten 10 mikromolaren TERAZ-Oleinlösung und der Regenerationslösung in das zweite Reagenziengestell legen.

Wählen Sie die manuelle Laufmethode, stellen Sie die Durchflussrate auf fünf Mikroliter pro Minute und den Durchflussweg auf die zweite Durchflusszelle ein. Injizieren Sie die G-S-T-T-C-O-Lösung für 420 Sekunden, gefolgt von der Teraz Benz Lamine Lösung für 600 Sekunden. Anschließend die Oberfläche mit zwei 32. Injektionen der Regenerationslösung regenerieren.

Nachdem Sie das GST TERAZ-Zine, das N-P-T-C-O, teraz Belamin und die Regenerationslösungsfläschchen in das zweite Reagenziengestell gelegt haben, wählen Sie die Methode des manuellen Gerätelaufs aus, stellen Sie dann die Durchflussrate auf fünf Mikroliter pro Minute und den Flussweg zur Durchflusszelle zwei ein. Eine Lösung von GST Tetra Zine wird 60 Sekunden lang injiziert, gefolgt von einer Lösung von N-P-T-C-O für 60 Sekunden. Zum Schluss injizieren Sie eine Lösung von Tetras Zine Belamine für 60 Sekunden.

Wenn Sie fertig sind, regenerieren Sie die Oberfläche auf die gleiche Weise wie zuvor. Wählen Sie als Nächstes eine neue Methode aus und geben Sie die allgemeinen Parameter ein, darunter Datenerfassung, Ratenerkennung, Probenfach, Temperatur, Konzentrationseinheiten und Puffereinstellungen. Erstellen Sie im Bereich "Assay-Schritte" einen neuen Schritt, und nennen Sie ihn "Probe".

Legen Sie dann im Bedienfeld "Zyklustypen" die auf Zweck und Verbindung basierenden Einstellungen auf "Sample" fest, erstellen Sie einen neuen Zyklusschritt und fügen Sie die folgenden Befehle ein. Erfassen Sie die Probenregeneration eins und die zweite Regeneration. Wählen Sie den Erfassungsbefehl und geben Sie G-S-T-T-C-O als Liganden ein.

Nennen Sie als Kontaktzeit 120 Sekunden, als Durchflussmenge fünf Mikroliter pro Minute. Und stellen Sie den Strömungsweg auf den zweiten ein. Wählen Sie dann den Beispielbefehl aus und geben Sie eine 182. Kontaktzeit, eine 62. Dissoziationszeit und eine Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute ein und stellen Sie den Durchflussweg auf beide ein.

Wählen Sie anschließend den Befehl regeneration one aus, und geben Sie die Regenerationslösung ein. Nennen Sie eine 32. Kontaktzeit bei 30 Mikrolitern pro Minute und stellen Sie den Strömungsweg auf eine Sekunde ein. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Regeneration.

Mit zwei Befehlen wählen Sie set, run und legen Sie den Flusspfad auf zwei Striche eins fest. Wählen Sie Weiter und füllen Sie die Probenliste mit der Tetra-Belamin-Analytlösung und einer Konzentrationsreihe von 1,5 bis 20 Mikromolar in einer Verdünnung von ein bis zwei. Wählen Sie dann neben dem Rack-Positionsfeld die Option aus.

Nachdem Sie die Lösungsfläschchen in das zweite Reagenziengestell gestellt haben, platzieren Sie die Verdünnungsreihe. In einer 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen.

Speichern Sie die Methodenvorlage und starten Sie den Bindungsassay. Angenommen, sobald eine neue Methode und die allgemeinen Parameter ausgewählt wurden, erstellen und benennen Sie die Schritte für die Erfassungsprobe und die Regeneration im Bereich "Assay-Schritte". Wählen Sie anschließend den entsprechenden Verwendungszweck aus und verbinden Sie die Basiseinstellungen.

Wählen Sie dann den Bereich Zyklustypen aus und erstellen Sie drei Zyklusschritte. Erfassen, Proben nehmen und regenerieren. Fügen Sie den Aufnahmebefehl zweimal unter dem Aufnahmezyklus ein.

Treten Sie in das Capture One-Panel ein. Wählen Sie die Erfassungslösung als Variable aus. Stellen Sie dann die Kontaktzeit auf 300 Sekunden bei einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute ein und stellen Sie den Strömungsweg im Capture-Two-Panel auf den zweiten ein.

Wählen Sie die Erfassungslösung als Variable aus. Stellen Sie die Kontaktzeit auf 250 Sekunden bei einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute und stellen Sie den Durchflussweg auf Sekunden ein. Fügen Sie als Nächstes den Beispielbefehl unter dem Schritt des Beispielzyklus ein.

Wählen Sie das Beispielpanel aus und stellen Sie die Kontaktzeit auf 60 Sekunden ein. Die Dissoziationszeit beträgt 200 Sekunden bei einer Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute und stellt den Strömungsweg auf beide ein. Fügen Sie den Regenerierungsbefehl zweimal unter dem Schritt Regenerierungszyklus ein, wählen Sie das Feld Regenerierung ein, und geben Sie die Regenerierungslösung ein.

Benennen Sie eine Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 30 Mikrolitern pro Minute und stellen Sie den Strömungsweg auf Sekunden ein. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Regeneration. Zwei Panels wählen Setup, Run und stellen den Flussweg auf zwei Striche ein, wählen Sie Next und geben Sie G-S-T-T-C-O und teraz AP 1, 497 konjugieren, da die Auffanglösung FKBP 12 als Probenname und 1,5 bis 96 Nanomolar bei einer Verdünnung von eins bis zwei als Konzentrationsreihe benennt.

Nachdem Sie die Lösungsfläschchen in das zweite Reagenzienrack und die Verdünnungsserie in eine 96-Well-Platte gelegt haben, speichern Sie die Methodenvorlage und starten Sie den Bindungsassay. Die effiziente reversible Immobilisierung bioaktiver kleiner Moleküle mit Kontrolle über Orientierung und Dichte spielt eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung neuer Biosensoranwendungen. Hier ist die Echtzeitüberwachung der Benzoe-Immobilisierung des Teraz-Zines zu sehen.

Eine Lösung von G-S-T-T-C-O wird über eine vorimmobilisierte Anti-GST-Oberfläche injiziert, was zu einem Anstieg von ca. 400 R RU führt. Als Reaktion darauf zeigt eine zweite Injektion mit Teraz zine Benzo Lamine einen schnellen Anstieg von 15 HE als Reaktion. Nach der Umstellung auf Laufpuffer wurde keine Dissoziation des Derd-Antigens beobachtet, was einen Hinweis auf die Strukturstabilität liefert.

Die Oberfläche wurde im letzten Schritt des Zyklus regeneriert, um mehrere Erfassungszyklen-Editionszyklen zu ermöglichen. Unter Verwendung dieses Verfahrens und unter Substitution des Tetrazines erzeugt die Benzyllamin-Einheit mit dem Teraz-Zin-Konjugat AP 1, 497 eine bioaktive Oberfläche, die für Interaktionsstudien mit ihrem Ziel verwendet wird. Die Störung der Antikörper-Antigen-Interaktion durch FK BP 12 regeneriert die Anti-GST-Oberfläche, wodurch eine neue molekulare Anordnung aufgebaut werden kann.

In diesem Fall folgt auf eine GST-TERAZ-Zin-Injektion eine Injektion von N-P-T-C-O, wodurch das Nanopartikel effektiv an der Sensoroberfläche immobilisiert wird. Nicht rereagierte TCO-Gruppen auf den Nanopartikeln sind für die Cyclo-Edition mit injiziertem Teraz-Zin-Benzolamin erhältlich. Alternativ wird das TET INE AP 1, 497-Konjugat verwendet, um funktionalisierte Nanopartikel-FK BP 12-Wechselwirkungen zu überwachen.

Es wurde keine Dissoziation der Mehrkomponentenstrukturen beobachtet, was einen Beweis für die Strukturstabilität und Bioaktivität mit Möglichkeiten zur Echtzeit-Immobilisierung, Reaktionsüberwachung und Oberflächenregeneration liefert. Die einfache Charakterisierung der Assoziationsrate KA erfolgt wie hier gezeigt. Das Wissen über die Reaktionskinetik bietet Richtlinien für die Kontrolle der Immobilisierungsdichte und wichtiger Parameter für Biosensor-Assays.

Durch die Injektion zunehmender Konzentrationen von teraz BELAMINE oder N-P-T-C-O in doppelter Ausführung über G-S-T-T-C-O bzw. GST teraz zine Oberflächen werden die Bindungsdaten erzeugt. Die Bindungsdaten für zwei sequentielle Analytproben derselben Konzentration auf derselben Oberfläche sind nahezu überlagerbar, was einen minimalen Verlust der Antikörperbindungskapazität widerspiegelt. Aufgrund mehrerer Zyklen der Capture-Cyclo-Edition und der Regeneration bietet die Auswertesoftware die am besten geeignete kinetische Analyse für die Reaktionsgeschwindigkeiten der Cyclo-Edition.

Wir haben einen Ansatz entwickelt, der den Antikörper-Antigen-Capture in Verbindung mit schnellen, hochspezifischen Cyclo-Edition-Reaktionen zwischen Teraz Zin und Transcyclin nutzt und eine schnelle reversible Immobilisierung kleiner Moleküle ermöglicht. Für SPR-Chip-basierte Studien erfordert die Capture-Cycle-Edition-Methode kurze Kontaktzeiten mit weniger als 10 mikromolaren Konzentrationen von niedermolekularen Liganden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kleine Moleküle oder Mehrkomponentenstrukturen auf einer Sensoroberfläche mit der Capture-Cyclo-Edition-Methode immobilisieren können.

Um dies zu erreichen, ist es wichtig, Reagenzien von guter Qualität für Konjugationsreaktionen zu verwenden und die Assay-Parameter auf dem SPR-Gerät richtig einzustellen.