Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Anfälligkeit von Bakterien für die interessierenden Antibiotika schnell zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Bakterien in der logarithmischen Phase zunächst am Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. Im zweiten Schritt werden dann Medien, die das Antibiotikum und einen lebenden toten Fluoreszenzfleck enthalten, mit einer hohen Durchflussrate durch den Kanal gedrückt, wodurch die Bakterien gestresst und ihre antibiotischen biochemischen Signalwege aktiviert werden.

Anschließend werden automatisch alle zwei Minuten für eine Stunde Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder aufgenommen, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu überwachen, wobei die normalisierten Prozentsätze des bakteriellen Todes aus den aufgenommenen Bildern zu jedem Zeitpunkt des Experiments berechnet werden. Letztendlich wird der Antibiotika-Empfindlichkeitsphänotyp der Bakterien aus einer Zunahme des normalisierten Zelltods im Laufe der Zeit bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden phänotypischen Suszeptibilitätstestmethoden wie Brühe, Verdünnung oder Mikrokultur besteht darin, dass unsere Methode keine Überwachung der Bakterienteilung erfordert.

Vielmehr können wir direkt aus der vorhandenen kleinen Population auf ihr Anfälligkeitsprofil zugreifen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose resistenter bakterieller Infektionen, da die Methode schnell ist, leicht gemultiplext und automatisiert werden kann. Um die PDMS-Schicht zu erzeugen, beginnen Sie mit der Entgasung eines frisch zubereiteten viskosen PDMS-Gemisches in einer Vakuumkammer bei Raumtemperatur nach einer Stunde, verwenden Sie eine Waage, um die Aluminiumform mit einer vordefinierten Masse der DGAs PDMS-Mischung zu füllen. Gießen Sie das PDMS langsam über die Mitte der Form und achten Sie darauf, dass die Form nivelliert und die Stifte unbedeckt bleiben.

Härten Sie das PDMS über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen aus. Lösen Sie am nächsten Morgen die obere Formplatte und entfernen Sie vorsichtig das ausgehärtete PDMS aus der Form, um die Durchflusszelle zusammenzubauen. Setzen Sie zunächst die Glasscheibe in die Durchflusszellentasche ein.

Legen Sie dann einen beschichteten Glasobjektträger mit der aktiven Seite nach oben über das Glasfenster in der Tasche der Durchflusszelle. Die neu erstellte PDMS-Schicht mit den Kanälen nach unten, so dass die Kanaleingänge mit den Durchgangslöchern in der Metallplatte ausgerichtet sind. Drücken Sie die Luft vorsichtig zwischen den Schichten heraus und drehen Sie dann die PDMS-Glasschlittenbaugruppe so um, dass das PDMS zur Glasscheibe zeigt.

Überlappen Sie die PDMS-Kanaleingänge mit den Durchgangslöchern in der Metallplatte, setzen Sie dann die Druckplatte darauf und ziehen Sie die Schrauben fest. Platzieren Sie nun die zusammengesetzte Durchflusszelle unter dem Mikroskop, stellen Sie die Mikroskopvergrößerung auf 60x ein und richten Sie die Kanalpositionen vor, um die Bakterien in der logaritmischen Phase für das Laden in die Durchflusszelle mischten 50 Mikroliter der über Nacht kultivierten Bakterienkolonie von Interesse in 50 Milliliter frische MH-Zwei-Brühe. Drei Stunden unter Schütteln bei 250 U/min und 37 Grad Celsius inkubieren, nach der Subkultur 10 Milliliter der Kultur zwei Minuten lang bei 1.650 mal G und Raumtemperatur zentrifugieren.

Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem MH zwei Medien. Befestigen Sie als Nächstes ein kurzes Schlauchstück an einer Ein-Milliliter-Spritze und spülen Sie den Schlauch mit einem Milliliter Medium, wobei Sie eine kleine Menge Medium im Schlauch lassen, um Luftblasen beim Einsaugen der Bakteriensuspension zu vermeiden. Laden Sie dann 0,7 Milliliter der Bakterien in die Spritze und füllen Sie zwei Kanäle der Flusszelle mit der Bakterienzellkultur.

Die Transparenz des Kanals ändert sich, wenn er mit den Bakterien gefüllt wird. Inkubieren Sie die Durchflusszelle dann 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Bakterien an der Objektträgeroberfläche festsetzen können. Um die Lösungen für das Experiment vorzubereiten.

Füllen Sie zunächst zwei 60-Milliliter-Spritzen mit frisch zubereiteter Kontrolllösung und zwei 60-Milliliter-Spritzen mit frisch zubereiteter Antibiotikalösung. Schnippen Sie mit den Spritzen, um alle Luftblasen zu entfernen, und befestigen Sie dann den Eingangsschlauch, indem Sie die entsprechenden Lösungen durch das Ende des Schlauchs drücken. Bewahren Sie die Lösungen in Aluminiumfolie ein, um eine lichtinduzierte Degradation der Reagenzien zu vermeiden.

Montieren Sie nun die Spritzen mit der experimentellen Lösung nacheinander auf die Pumpe. Drücken Sie die Kolben nach Bedarf zusammen, um sie auf die Pumpe zu montieren. Verriegeln Sie die Spritzen mit der Spritze, die den Querbalken hält.

Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf einen Milliliter pro Minute und das Pumpenvolumen auf 60 Milliliter ein und spülen Sie die Pumpe, bis ein gleichmäßiger Flüssigkeitsfluss aus allen Spritzen zu sehen ist. Starten Sie nun das Experiment, indem Sie die Durchflusszelle aus dem Inkubator nehmen und auf den vorverstellten Mikroskoptisch montieren. Verbinden Sie als Nächstes einen Eingangsschlauch aus einer Spritze und einen Ausgangsschlauch aus einer Abfallflasche mit jedem der Durchflusszellenkanäle.

Zu diesem Zeitpunkt ist das Experiment vollständig eingerichtet und kann beginnen. Stellen Sie die Phasenkontrast-Erfassungszeit auf 10 Millisekunden und die Fluoreszenz-Erfassungszeit auf 1600 Millisekunden ein und erhalten Sie dann Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder für jede Position, bevor Sie den Fluss einleiten. Bitte beachten Sie, dass vor dem Start des Strömungsbildes die Fokussierung auf den Boden des Kanals aufgrund der hohen Dichte an geladenen Bakterien innerhalb des Kanals möglicherweise nicht möglich ist.

Starten Sie nun den Flüssigkeitsfluss. Überprüfen Sie sofort, ob das Mikroskop auf den Boden der Kanäle fokussiert ist. Nehmen Sie dann Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder der Zielbereiche innerhalb der ersten Minute der Strömung auf.

Erfassen Sie Bilder alle zwei Minuten nach dem ersten Satz von Bildern, bis 60 Minuten Fluss aufgetreten sind. Bei Bedarf kann eine Neufokussierung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Experiment ordnungsgemäß verläuft, und die erfassten Phasenkontrast- und Fluoreszenzdaten können untersucht werden. In dieser Datenstichprobe wurde ein anfälliger Stamm in die Kanäle eins und zwei geladen, während sich ein Widerstandsstamm in den Kanälen drei und vier befand.

Führen Sie am Ende des Versuchs einen Reinigungszyklus mit nachfolgendem Auftragen von Bleichmittel und Wasser durch. Füllen Sie vier 20-Milliliter-Spritzen mit 10 Millilitern einer 10%igen Bleichlösung und vier 60-Milliliter-Spritzen mit Wasser. Befestigen Sie nach dem Entblasen die mit Bleiche gefüllten Spritzen an der Durchflusszelle und stellen Sie die Pumpendrehzahl auf einen Milliliter pro Minute und das Pumpenvolumen auf drei Milliliter ein.

Lassen Sie die Pumpe drei Minuten lang laufen und überwachen Sie die Reinigung des Kanals auf dem Bildschirm. Ersetzen Sie nach drei Minuten die Bleichspritzen durch Wasserspritzen und lassen Sie sie 30 Minuten lang mit einem Milliliter pro Minute laufen. Zählen Sie abschließend die Anzahl der Bakterien in jedem Bild mit Hilfe einer Bildverarbeitungssoftware.

Berechnen Sie den normalisierten Prozentsatz des bakteriellen Zelltods als Funktion der Zeit mit dieser Formel, wobei NF der Anzahl der toten Bakterien entspricht, die in der Fluoreszenzbildzählung gezählt werden. Und NP entspricht der Gesamtzahl der Bakterien, die aus dem Phasenkontrastbild bestimmt wurde. Die hier gezeigten Bilder veranschaulichen die zeitabhängige Reaktion eines anfälligen Staphylococcus aria-Stammes auf Oxacillin in einer mikrofluidischen Durchflusszelle.

Diese Quadranten zeigen Phasenkontrastbilder, die eine Minute nach Beginn des Experiments aufgenommen wurden, und eine Stunde später mit den entsprechenden Fluoreszenzbildern, die hier gezeigt werden. Am Ende des Experiments wird ein signifikanter Anstieg der Anzahl fluoreszierender Bakterien beobachtet, was auf den Zelltod innerhalb des Kanals und die Anfälligkeit des Stammes gegenüber dem Antibiotikum hinweist, was auf die stochastische Ungleichmäßigkeit der einzelnen epoxidbeschichteten Objektträger zurückzuführen ist. Es kann während des gesamten Experiments unter anhaltendem Stress zu bakteriellem Zellverlust kommen, um diese Variation zu erklären. Jedes Fluoreszenzbild einer toten Zellpopulation wird normalisiert, wobei das gemeinsam aufgenommene Phasenkontrastbild die Gesamtzellpopulation auf eine Sekunde vom gleichen Zeitpunkt genau anzeigt.

Diese Vergrößerungen zeigen, dass der Zählalgorithmus bei der genauen Zählung einzelner Bakterien in Fluoreszenzbildern erfolgreicher ist als in dicht besiedelten Phasenkontrastbildern. Die Totzellenfärbung ergibt einen hohen Fluoreszenzkontrast für einzelne abgestorbene Bakterien. Da die Anzahl der fluoreszierenden Bakterien selten 5% der Gesamtzahl übersteigt, ist jedes Bakterium im Vergleich zum Hintergrund sehr hell.

Daher können die fluoreszierenden Bakterien leicht und mit hoher Genauigkeit gezählt werden. Zum Beispiel wurden in diesem Experiment von den insgesamt 5.828 nachgewiesenen Bakterien, die rot markiert sind, 174 als tot bestimmt. Normalisierte MSSA- und Mr.RSA-Daten für drei verschiedene Experimente sind wie für resistente Stämme erwartet dargestellt, der normalisierte Zelltod ist gering in der Größenordnung von weniger als 0,5% und ändert sich im Verlauf des Experiments nicht.

Anfällige Stämme zeigen jedoch einen stetigen Anstieg des Zelltods und einen höheren Wert von mehr als 1 % am Ende des Experiments. Der Beginn des Zelltods bei anfälligen Stämmen variiert leicht zwischen den Experimenten, tritt aber in der Regel zwischen 10 und 30 Minuten auf. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit antibiotikaresistenten Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie eine septische Technik getroffen werden sollten.

Diese Technik wird Forschern den Weg ebnen, um zu erforschen, wie Bakterien auf Stress reagieren, und die Entwicklung neuartiger Schnelldiagnostika und die Entdeckung neuer Medikamente beeinflussen.