Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Dieses Verfahren zielt auf eine in vitro Simulation der Blut-Hirn-Schranke ab, indem Astrozyten und Endothelzellen auf gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran kokultiviert werden. Beschichten Sie zunächst die luminale Oberfläche der porösen Membran mit einer extrazellulären Matrix. Proteinartiges Kollagen passt den umgekehrten Einsatz mit einem externen Silikonschlauch und einem internen Silikonstopfen an, um einen abnehmbaren Brunnen über der abluminalen Oberfläche der Membran zu schaffen.

Nun säen Sie die Astrozytenzellen auf dem umgedrehten Einsatz aus, so dass sie an der abluminalen Oberfläche haften. Entfernen Sie dann den Schlauch und legen Sie den Einsatz in seiner normalen Ausrichtung in eine mit Medium gefüllte Vertiefung. Als nächstes säen Sie die Endothelzellen in das luminale Kompartiment des Einsatzes und co-kulturieren mit den gegenüberliegenden Astrozyten.

Letztendlich wird die Passage von fluoreszierenden Tracern oder die Aufzeichnung des transendothelialen elektrischen Widerstands verwendet, um Permeabilitätsänderungen in der in vitro BHS als Reaktion auf verschiedene Stimulationsmittel zu messen. Dieses Verfahren wird Herr Barry Nigo, ein Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren, der im Laufe seiner Doktorarbeit dieses modifizierte Seeding-Protokoll entwickelt hat, mit dem wir die Blut-Hirn-Schranke simuliert haben. Wir hatten zum ersten Mal eine Idee zu diesem Verfahren, nachdem wir grobere Sitzmethoden getestet hatten und sehr frustriert über das Austreten von Medium durch die Pause sowie kleine mittlere Volumina waren.

Dies führte zu kurzen und unzureichenden Sitzzeiten der Astrozyten, die wir in unserem Verfahren zu bekämpfen versuchen. Platzieren Sie die Gewebekultureinsätze in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Fügen Sie dann 50 Mikroliter 132 Mikrogramm pro Milliliter Rattenkollagen hinzu, eins zur Beschichtung der luminalen Oberfläche der Einsätze, inkubieren Sie über Nacht in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator, um jegliche Säurereste zu entfernen, waschen Sie sowohl die abluminale als auch die luminale Seite der Einsätze mit doppelt destilliertem Wasser.

Drehen Sie dann die Einsätze um und legen Sie vorsichtig ein kurzes Stück elastischen Silikonschlauch um den Rand der porösen Membran. Im Wesentlichen entsteht eine neue Vertiefung über der abluminalen Oberfläche. Zur Versiegelung der Unterseite.

Bereiten Sie einen Stopfen aus Silikonschlauch vor, der an einem Ende mit der abgeschnittenen Spitze eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens versiegelt ist. Führen Sie nun mit einer sterilen Pinzette den Silikonstopfen in den Leuchthohlraum ein und schieben Sie ihn vor, bis er etwa ein bis zwei Millimeter von der Membran entfernt ist. Nächster Samen, 40.000 Astrozyten in 200 Mikrolitern ihres Erhaltungsmediums direkt in das Silikon weit über der Oberfläche der abluminalen Membran.

Um den Adhärenzzustand der Astrozyten zu überwachen, verwenden Sie eine Standardplatte mit 96 Vertiefungen, da sie die gleiche Oberfläche wie der 6,5-Millimeter-Einsatz hat und dies zulässt. Einfachere Visualisierung von Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie-Seed, ein identisches Volumen der Astrozytenzellsuspension in die 96-Well-Platte acht. Dies wird im Laufe der Zeit überwacht, um festzustellen, wann die Astrozyten in der 96-Vertiefung und damit in der Insert-Membran ausreichend adhäsiert haben, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.

Transportieren Sie die zusammengebauten Einsätze zwischen zwei Sechs-Well-Platten, um die Exposition gegenüber ungefilterter Luft zu minimieren. Legen Sie die Zellen in den Inkubator, damit die Astrozyten anhaften können. Setzen Sie zu diesem Zeitpunkt auch die 96-Well-Platte der Steuerung in den Inkubator ein.

Nach etwa vier Stunden überprüfen Sie die Vertiefung der Kontrolle 96, um zu sehen, ob die Astrozyten anhaften. Wenn ja, übertragen Sie die Einsatzeinheit zurück in die Gewebekulturhaube. Entfernen Sie vorsichtig den externen Silikonschlauch und die Stopfen.

Bringen Sie dann die Einsätze wieder in die normale aufrechte Ausrichtung in Vertiefungen mit 800 Mikrolitern pro Vertiefung Endothelzellerhaltungsmedium zurück. Sehen Sie 20.000 Gehirn-Endothelzellen in 200 Mikrolitern auf der kollagenbeschichteten luminalen Oberflächen-Co-Kultur für drei Tage in BEC-Medium ohne Medienwechsel. Vor dem Experimentieren.

Waschen Sie die Silikonschläuche und -stopfen in Ethanol, bevor Sie sie für den späteren Gebrauch autoklavieren. Um die In-vitro-Blut-Hirn-Schranke zu stimulieren, ersetzen Sie zunächst das abluminale und das luminale Medium durch 600 Mikroliter bzw. 100 Mikroliter serumfreies Becs-Medium. Aspirieren Sie das Luminal Wash und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter serumfreies Medium, das stimulierende Wirkstoffe enthält.

Wenn Sie die in vitro BHS aus dem astrozytären Kompartiment induzieren, aspirieren Sie das abluminale Medium und ersetzen Sie es durch 600 Mikroliter freies Serum. Bei medienhaltigen Stimulierungsmitteln wird mit den standardmäßigen parazellulären oder transzellulären Permeabilitätsassays der Markierungstracer fortgefahren, um ein Modell der menschlichen Kontakt-Blut-Hirn-Schranke zu etablieren. Menschlich immortalisierte Astrozyten und Endothelzellen des Gehirns werden auf drei Mikrometern porösen Membranen kultiviert, die den Durchgang von Astrozyten und Füßen für den Kontakt mit Endothelzellen ermöglichen.

Die Methode ermöglichte eine optimale, ununterbrochene Aussaatzeit von Astrozyten und Becs, die sich wiederum mit minimalem Zellverlust stark an die poröse Oberfläche anheften und innerhalb von drei Tagen zur Kofluenz heranwachsen. Nach der Setzliste. Beide Zelltypen behalten ihre zellspezifischen Marker auf porösen Membranen bei, wie die Expressionsmuster des sauren Proteins GFAP in SVGs und der von-Vand-Faktor VWF NECs zeigen.

In Übereinstimmung mit dem grundlegendsten Merkmal eines Kontakt-BHS-Modells kann das astrozytäre NFE durch die drei Mikrometer-Poren in das luminale Kompartiment gelangen. Daher kann möglicherweise ein Kontakt zwischen SVGs und BES bestehen, die auf Poren dieser Dimension sitzen. Darüber hinaus deutet die REM-Bildgebung darauf hin, dass SVGs und BBCs in der Lage waren, direkt über die Membranporen zu wachsen, ein Phänomen, das künstlich zur physikalischen Barrierefunktion von in vitro BHS-Kontaktmodellen beiträgt.

In dieser Studie wird das humane Kontakt-BHS-Modell verwendet, um die Wirkung des fibrinolytischen Mittels TPAA auf die BHS zu untersuchen. Diese in vitro Studien bestätigen, dass TPA die Permeabilität der intakten BHS tatsächlich konzentrations- und zeitabhängig erhöhte, was beides in einem pharmakologisch relevanten Bereich lag. Dramatische morphologische Veränderungen der SVG-Astrozyten sind auf den porösen Membranen nach TPA-Exposition offensichtlich, was darauf hindeutet, dass die astrozytäre Reaktion auf TPA der TPA-induzierten BHS-Öffnung zugrunde liegt.

Diese Methode spielte eine Schlüsselrolle in unserer Forschung, die darauf abzielte, zu untersuchen, wie die Blut-Hirn-Schranke auf das thrombolytische Medikament TPAA reagiert, das bei Schlaganfallpatienten zur Auflösung von Blutgerinnseln eingesetzt wird. Es ist die erste Demonstration dieser Methode in der Literatur, und wir hoffen, dass andere Forscher sie für ihre eigenen Zwecke übernehmen können.