Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Dieses Verfahren zielt auf eine In-vitro-Simulation der Blut-Hirn-Schranke ab, indem Astrozyten und endotheliale Zellen auf gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran koinkubiert werden. Beschichten Sie zunächst die luminalen Oberfläche der porösen Membran mit einer extrazellulären Matrix. Tragen Sie ein Protein wie Kollagen auf, und passen Sie den invertierten Insert mit einem äußeren Silikonrohr und einem inneren Silikonstopfen an, um einen abnehmbaren Brustkammer über der abluminalen Oberfläche der Membran zu bilden.

Seeden Sie nun die Astrozyten auf dem invertierten Insert, sodass sie an der abluminalen Oberfläche haften. Entfernen Sie anschließend die Tubing und setzen Sie das Insert in seiner normalen Orientierung in eine mit Medium gefüllte Vertiefung ein. Seeden Sie danach die endothelialen Zellen in den luminalen Kompartiment des Inserts und kultivieren Sie sie gemeinsam mit den gegenüberliegenden Astrozyten.

Schließlich wird der Durchtritt fluoreszierender Tracer oder die Aufzeichnung des transendothelialen elektrischen Widerstands verwendet, um Permeabilitätsänderungen in der in-vitro-Blut-Hirn-Schranke als Reaktion auf verschiedene stimulierende Agentien zu messen. Dieses Verfahren wird von Herrn Barry Nigo, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert, der im Verlauf seiner Doktorarbeit diesen modifizierten Ansiedlungsprotokoll entwickelte, den wir zur Simulation der Blut-Hirn-Schranke verwendet haben. Wir hatten ursprünglich die Idee zu diesem Verfahren, nachdem wir grobere Ansiedlungsmethoden getestet und erhebliche Probleme mit dem Durchsickern des Mediums durch die Pausen sowie mit geringen Mediumvolumina hatten.

Dies führte zu kurzen und unzureichenden Inkubationszeiten für Astrozyten, die wir in unserem Verfahren zu beheben versuchen. Geben Sie die Gewebekultur-Einlagen in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Fügen Sie dann 50 Mikroliter einer 132 Mikrogramm pro Milliliter Rattenkollagen-Lösung hinzu, um die luminalen Oberflächen der Einlagen zu beschichten, inkubieren Sie über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, um sämtliche Reste von Säure zu entfernen, und waschen Sie sowohl die ab- als auch die luminalen Seiten der Einlagen mit doppelt destilliertem Wasser.

Danach die Inserts umdrehen und vorsichtig ein kurzes Stück elastischen Silikon-Schlauch um den Rand der porösen Membran legen. Dadurch entsteht im Wesentlichen ein neues Gewebe über der abluminalen Oberfläche, um die Unterseite abzudichten.

Stellen Sie einen Stopfen aus Silikonrohr her, der an einem Ende mit der abgeschnittenen Spitze einer 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen verschlossen ist. Führen Sie nun mit einer sterilen Pinzette den Silikonstopfen in den luminalen Hohlraum ein und schieben Sie ihn vorwärts, bis er etwa ein bis zwei Millimeter vor der Membran liegt. Anschließend geben Sie 40.000 Astrozyten in 200 Mikrolitern ihres Pflegemediums direkt in den Silikonbrunnen oberhalb der abluminalen Membranfläche.

Um den Adhäsionszustand der Astrozyten zu überwachen, verwenden Sie eine standardmäßige 96-Loch-Platte, da diese die gleiche Oberfläche wie der 6,5-Millimeter-Insert besitzt und eine einfachere Visualisierung der Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht. Säen Sie ein identisches Volumen der Astrozyten-Zellsuspension in die 96-Loch-Platte aus. Diese wird im Zeitverlauf überwacht, um festzustellen, wann die Astrozyten in der 96-Loch-Platte – und damit auch auf der Insertmembran – ausreichend angeheftet sind, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.

Transportieren Sie die zusammengesetzten Inserts zwischen zwei Sechs-Loch-Platten, um die Exposition gegenüber ungefilterter Luft zu minimieren. Stellen Sie die Zellen in den Inkubator, um die Adhärenz der Astrozyten zu ermöglichen. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt ebenfalls die Kontroll-96-Loch-Platte in den Inkubator.

Nach etwa vier Stunden überprüfen Sie die Kontroll-96-Well-Platte, um festzustellen, ob die Astrozyten angeheftet haben. Falls ja, bringen Sie die Insert-Baugruppe zurück in die Zellkulturwerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die äußeren Silikonrohre und Stopfen.

Danach kehren Sie die Inserts in die normale aufrechte Position in die Vertiefungen zurück, die 800 Mikroliter pro Vertiefung Endothelzell-Maintenanzmedium enthalten. Säen Sie 20.000 Gehirnendothelzellen in 200 Mikrolitern auf die kollagenbeschichtete luminalen Oberfläche für eine Co-Kultur über drei Tage in BEC-Medium, ohne dass ein Mediumwechsel erfolgt. Vor der Durchführung der Experimente.

Spülen Sie die Silikonschläuche und -stopfen vor der Autoklavierung für die spätere Verwendung mit Ethanol. Um die Blut-Hirn-Schranke in vitro zu stimulieren, ersetzen Sie zunächst das ab luminal gelegene und das luminal gelegene Medium mit jeweils 600 µL und 100 µL serumfreiem BECS-Medium. Aspirieren Sie das luminal gelegene Medium und ersetzen Sie es durch 100 µL serumfreies Medium, das stimulierende Substanzen enthält.

Wenn die in-vitro-Blut-Hirn-Schranke aus dem astrogliären Kompartiment induziert wird, dann das ab luminal gelegene Medium abpipettieren und durch 600 µL serumfreies Medium ersetzen. Das Medium, das stimulierende Substanzen enthält, weiterhin in den standardmäßigen parazellulären oder transzellulären Permeabilitätsassays mit markierten Tracern verwenden, um ein humanes Kontaktmodell der Blut-Hirn-Schranke zu etablieren. Humanisierte, immortalisierte Astrozyten und Gehirnendothelzellen werden auf porösen Membranen mit einer Porengröße von drei Mikrometern kultiviert, die den Durchtritt von Astrozytenfortsätzen ermöglichen, sodass diese in Kontakt mit den Endothelzellen treten können.

Die Methode ermöglichte eine optimale, ununterbrochene Ansiedlungsphase von Astrozyten und BECs, die wiederum stark an der porösen Oberfläche haften, mit minimalem Zellverlust und wachsen innerhalb von drei Tagen bis zur Konfluenz heran. Nach der Ansiedlung behalten beide Zelltypen ihre zellspezifischen Marker auf porösen Membranen bei, wie durch die Expressionsmuster des glialen fibrillären sauren Proteins GFAP in SVGs und des von Willebrand-Faktors VWF in NECs angezeigt.

Im Einklang mit der grundlegendsten Eigenschaft eines kontaktbasierten BBB-Modells können die astrogialen NFE durch die drei Mikrometer großen Poren in den luminalen Kompartiment gelangen. Daher kann potenziell ein Kontakt zwischen SVGs und BES bestehen, die auf Poren dieser Größe sitzen. Darüber hinaus zeigt die REM-Bildgebung, dass SVGs und BBCs in der Lage waren, direkt über die Membranporen zu wachsen – ein Phänomen, das künstlich zur physikalischen Barrierefunktion von in-vitro-BBB-Kontaktmodellen beiträgt.

In dieser Studie wird das humane kontaktbasierte BBB-Modell verwendet, um die Wirkung des fibrinolytischen Wirkstoffs TPAA auf die BBB zu untersuchen. Diese In-vitro-Studien bestätigen, dass TPA tatsächlich die Permeabilität der intakten BBB in konzentrations- und zeitabhängiger Weise erhöht, wobei sowohl Konzentration als auch Zeit im pharmakologisch relevanten Bereich lagen. Deutliche morphologische Veränderungen der SVG-Astrozyten sind auf den porösen Membranen nach Exposition gegenüber TPA erkennbar, was darauf hindeutet, dass die astrozytäre Reaktion auf TPA der TPA-induzierten Öffnung der BBB zugrunde liegt.

Diese Methode spielte eine Schlüsselrolle in unserer Forschung, die darauf abzielte, zu untersuchen, wie die Blut-Hirn-Schranke auf das thrombolytische Medikament TPAA reagiert, das bei Schlaganfallpatienten zur Auflösung von Blutgerinnseln eingesetzt wird. Es handelt sich um die erste Darstellung dieser Methode in der Literatur, und wir hoffen, dass andere Forscher sie für ihre eigenen Zwecke übernehmen können.