Name: Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie die verbesserte Kokulturmethode von Astrozyten und Hirnendothelzellen für ein realistisches Blut-Hirn-Schranken-Modell. Diese Technik ermöglicht präzise Permeabilitätsstudien und die Untersuchung pharmakologischer Effekte auf die BBB-Integrität.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council of Australia (Zuschuss # 606658) an RLM ausgezeichnet finanziert.

1. Cell Culture (3-7 Tage vor BBB Versammlung) 1.1. Primary Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (BEK) BECs wurden im Handel erhalten. Die Zellen wurden durch Dispase Dissoziation von normalen menschlichen Hirnrinde Gewebe hergestellt und bereitgestellt bei Passage 3 (&lt;12 Populationsverdopplungen) eingefroren. <ol><li> Substrat: Mantel Gewebekulturgefäße mit &quot;Anhang Factor&quot; nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Zellenpflege: Pflegen BECs in serumhaltigem Vollmedium. Für Experimente, die Kultur in BECs komplette Serum-freien Medium. Aufrechterhaltung der Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2, 21% O 2-Inkubator bei 37 ° C Hinweis: Als Alternative zu Spezialreagenzien, 0,1% (w / v) Gelatine-Lösung kann als eine Beschichtung Reagenz dienen, während DMEM/F-12, supplementiert mit 15 mM HEPES, 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 50 ug/ Ml Gentamycin, 20 ug / ml Heparin und 20 ug / ml Endothelzellen Wachstumsergänzung für BEC Wartung verwendet werden. </li><li> Subkultivierung für Experimente: Split konfluenten BECs in einem Verhältnis von 1:3 bis 1:6, je nach der vorgesehenen Zeit für die nächste Nutzung (3-7 Tage). Ändern Sie den Erhaltungsmedium alle 3 Tage. Verwenden BECs bis zu 15 Passagen. </li></ol> 1.2. SVG menschlichen fetalen Zellen Astroglia-line SVG menschlichen fetalen Zellen Astroglia-22 wurden ursprünglich aus Primärkulturen von menschlichen fetalen Gehirns mit replikationsdefizient Simian Virus 40 umgewandelt abgeleitet. <ol><li> Wartungs: Kultur SVG Zellen in Minimalmedium mit Earle-balancierter Salzlösung mit 20% (v / v) FCS (gleiche Serumprozent zur Elternprimärzellen 22 zu halten), 2 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und ergänzt 50 ug / ml Streptomycin. Aufrechterhaltung der Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2, 21% O 2 </sub&gt; Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Subkultivierung für Experimente: Split konfluenten SVG in einem Verhältnis von 1:5 bis 1:10, abhängig von der beabsichtigten Verwendung für das nächste Mal (3-7 Tage). Entfernung von Trypsin ist nicht durch den hohen Gehalt an Serum im Medium erforderlich. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage. Verwenden Sie SVG-Dateien bis zu 20 Passagen. </li></ol> 2. Montage-und Co-Kultivierung der menschlichen In-vitro-Modell BBB (Tag 0) Kommentar: Der Mensch in vitro Kontakt BBB Modell ist nach den veröffentlichten Protokollen 13,23 vorbereitet, mit Modifikationen. 2.1. Beschichtung von Inserts <ol><li> Platzieren Gewebekultureinsätze (6,5 mm Durchmesser, mit Polyester poröse Membran, 3 &amp;mgr; m Porengrße) in die Vertiefungen der zugeführten 24-Well-Platte. Beschichtung der Lumenoberfläche der Einsätze <s> </s> über Nacht in einer feuchten 37 º C-Inkubator mit Ratten-Kollagen I (20 &amp;mgr; g / cm 2, 50 &amp;mgr; l 132 &amp;mgr; g/ Ml Kollagen I in 0,02% Essigsäure in Milli-Q-Wasser (MQH 2 O)). Einmal zu waschen die Einsätze (beide von der abluminalen und luminalen Seite) mit MQH 2 O, um die restliche Säure zu entfernen. Hinweis: Basalmembran der Kapillaren des Gehirns enthält keine Kollagen I, sondern vor allem Lamininen, Kollagen Typ IV-Isoformen, Nidogene und Heparansulfatproteoglycanen 9. Aus diesem Grund verwenden einige Forscher Beschichtungsmittel wie Collagen IV, Fibronectin 13 oder Matrigel (BD Biosciences) 16 für eine authentische BBB Modellierung. </li></ol> 2.2. Seeding SVG auf der Unterseite (abluminale) Membranfläche <ol><li> Kehren Sie die Einsatz und sanft passen rund um den Rand der porösen Membran ein kurzes Stück elastischen Silikonschlauch (&quot;externe Schläuche&quot;, ~ 10 mm lang, 8 mm Innendurchmesser, 1,6 mm Wand), im Wesentlichen die Schaffung eines neuen deutlich über der Oberfläche abluminale (Fig. 2A). </li><li> Die Unterseite des Einsatzes geb.ds abzudichtenden Medien Auslaufen zu verhindern. Zuerst bereiten einen Stecker (2A und 2B) aus einem Silikonschlauch (&quot;innere Schlauch&quot; bezeichnet; ~ 8 mm lang, 3,2 mm Innendurchmesser, 1,6 mm Wand; 2B) gemacht, an einem Ende mit einem Kunststoffdichtkegel versiegelt (~ 3 mm lang; vorbereitet, indem die Unterseite einer 0,2 ml-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Rohr; 2B). Dieser Kegel dichtet nicht nur die internen Rohr Lumen, sondern auch erweitert seine Kante für engere Fitting in den Einsatz. Danach wird unter Verwendung einer sterilen Pinzette, legen Sie die Silikon-Stecker in die Lumenhöhle und voraus, bis es up-to ~ 1-2 mm von der Membran (2A) erreicht. </li><li> Nächstes Saatgut 4 x 10 4 SVG Zellen in 200 ul SVG Erhaltungsmedium (section 1.2.2) direkt in die Silikon deutlich über der abluminalen Membranoberfläche (2A). SVG ermöglichen, für mindestens 4 Stunden in den Inkubator zu haften. Hinweis: Zur Aufrechterhaltung der Sterilität transportieren die versammelten Einsätze zwischen zwei 6-Well-Platten (eine Platte über die andere umgekehrt, 2C), um die Exposition gegenüber ungefilterter Luft während des Verfahrens zu minimieren. Silikonschläuche und Stecker werden in Ethanol gewaschen und für eine spätere Verwendung autoklaviert. Hinweis: Verwenden Sie Stecker (Abschnitt 2.2.2) nur für Einsätze mit Membranporengrößen größer als 1 um. Membranen mit Porendurchmesser ≤ 1 um selten auslaufen und benötigen nur die Montage der externen Silikonschlauch (Abschnitt 2.2.1). Darüber hinaus sind einige andere als Beschichtungsmittel Kollagen I (siehe Anmerkung zu Abschnitt 2.1) kann auch durch Undichtigkeit 3 ​​um Poren zu verhindern. Bestimmen Sie diese empirisch. </li><li> Um die Einhaltung Zustand Ihrer Astrozyten zu überwachen, Saatgut parallel inein Standard-96-Well eine identische Volumen der Astrozyten-Zellsuspension. Dies hat auch den gleichen Oberflächenbereich wie der 6,5-mm-Einsatz (0,33 cm 2) und eine einfachere Visualisierung von Zellen, die durch Phasenkontrastmikroskopie als der Einsatz Membran. Wenn Sie ausreichende Haftung der Astrozyten in der Steuer beobachten 96-well, die Astrozyten haben ausreichend auch für den Einsatz Membran geklebt. </li><li> Wenn Astrozyten haben ausreichend in der Steuer 96-Loch geklebt, übertragen Sie die Einsatzanordnungen zu der Gewebekultur Haube (siehe Hinweis oben) und vorsichtig die äußere Silikonschlauch und Stecker entfernen. Zurück Einsätze in den normalen (also aufrecht)-Orientierung in den mitgelieferten Vertiefungen mit 800 ul / BEC Erhaltungsmedium (Abschnitt 1.1.2 oben). </li></ol> 2.3. Seeding von BECs in die Luminal Kammer über den Astrozyten Seed 2x10 4 BECs in 200 ul auf die Kollagen-beschichteten Lumenoberfläche und geben die inserts in den Brutschrank. 2.4. Co-Kultivierung Co-Kultur der SVG / BEC ausgesät Einsätze für 3 Tage im BEC-Medium ohne Medienwechsel vor dem Experiment. 3. Experimentieren mit dem Human BBB-Modell (Tag 3) <ol><li> Um die in vitro BBB ersten Wasch Zellen zu stimulieren, indem die luminalen und abluminalen Medium mit 600 &amp;mgr; l und 100 &amp;mgr; l serumfreien Medium BECs sind. </li><li> Saugen Sie den Lumen Medium wieder und ersetzen mit 100 ul Serum-freien Medium mit stimulierenden Substanzen. Hinweis: Wenn die Stimulation des abluminale Kammer erforderlich ist (um die in-vitro-BBB aus der Astrozyten Fach zu aktivieren) absaugen abluminale Medium und ersetzen mit 600 ul Serum-freiem Medium mit stimulierenden Substanzen. </li><li> Testen Sie jede Versuchsgruppe in dreifacher Ausfertigung (also wenn Lumen Stimulation durchgeführt, die 3 x 100 ul erfordert, empfehlen wir die Verdünnung der Wieder<html> Mittel, um ihre Endkonzentrationen in 350 &amp;mgr; l serumfreiem Medium pro Gruppe Pipettierfehlern zwischen den Wells zu minimieren). </li><li> Führen Standardparazellulären und / oder transzellulären Assays markierter Tracer 16,24 (bei ​​letzterem wir Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Albumin) und / oder die Messung der TEER 13,16,25, wie zuvor beschrieben. </li></ol> Um Schwankungen der Ausgangsdurchlässigkeit Konto zwischen Experimenten analysiert Änderungen in der Permeabilität relativ zu einem beschichteten Einsatzes ohne Zellen (die als Referenz für die maximale Durchlässigkeit dient) und der Träger-behandelten Gruppe mit der Formel: Durchlässigkeit (% max) = ( Durchlässigkeitswert von Versuchseinsatz - mittlere Permeabilität Wert der Fahrzeuggruppe) / (Durchlässigkeitswert des Rohlings Einsatz - mittlere Permeabilität Wert der Fahrzeuggruppe) X 100. 4. Visualisierung von Zellen auf porösen Membranen nt &quot;&gt; Kommentar: ungefärbte Zellen auf Einsatz Membranen sind schwer zu Phasenkontrast-oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie beobachten, da die Membran ist ziemlich undurchsichtig und stört Lichttransmission Um mit diesem Problem, das wir verschiedene Färbeverfahren von Zellen auf entwickelt umzugehen. Einsätze, die eine wesentlich bessere Zell Aussehen auf der Membran. Allgemeinen färben die Einlage Membranen während sie noch an dem Einsatz angebracht ist, in den Vertiefungen. Die Membranen erst am Ende des Färbeverfahrens zu Montagezwecken entfernt werden. 4.1. Hämatoxylin-Färbung <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) für 20 min. Einmal in PBS waschen. </li><li> Tauchen Sie den Einsatz in 0,1% Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. </li><li> Vorsichtig waschen den Einsatz mit Leitungswasser (durch Eintauchen die Insin ein Becherglas mit Leitungswasser ert und vorsichtiges Pipettieren das überschüssige Wasser aus). Übertragen des Einsatzes an Scotts Leitungswasser-Lösung (2 g / l NaHCO 3, 20 g / l MgSO 4) für ~ 20 Sekunden, bis die gewünschte blaue Farbe entwickelt. Waschen Sie den Einsatz wieder mit Leitungswasser (Abschnitt 4.1.3). Eine optionale Eosin-Färbung kann dabei durch Eintauchen des Einsatzes in 1% Eosin-Lösung für 10 Sekunden, gefolgt von einer Leitungswasserwäsche eingebracht werden. </li><li> Luft trocknen den Einsatz Membran. Mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand) entfernen Sie die Membran und klebe sie auf einen Glasobjektträger für Hellfeldaufnahme Hinweis: Wenn di-N-butylphthalateinxylene (DPX) Montagemedium verwendet wird, waschen Sie den Einsatz mit 100% Ethanol, gefolgt von Xylol vor dem Entfernen und Montage der Membran. </li></ol> 4.2. Rasterelektronenmikroskop (SEM) <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) PFA in PBS für 20min. Dreimal in PBS waschen. </li><li> Post fixieren die Membranen für 30 min in 1% (w / v) Osmiumtetroxid in MQH 2 O. </li><li> Waschen Einsätze in Wasser (Abschnitt 4.1.3) und entwässern in einer eskalierenden Ethanol-Gradienten (50%, 70%, 90% für jeweils 5 Minuten, dann 3x mit 100% Ethanol für 10 Minuten pro Intervall). </li><li> Behandlung von dehydrierten Einsätze mit einer Mischung aus Hexamethyldisilazan (HMDS): Ethanol (2:1 01.02 dann 5 min). </li><li> Gönnen Einsätze mit 100% HMDS für 5 min an der Luft trocknen und lagern unter Bedingungen trocknet. </li><li> Entfernen Sie die Membran mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand). Untersuchen Membranen durch Rasterelektronenmikroskopie. </li></ol> 4.3. Immunfluoreszenz <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) PFA in PBS für 20 Minuten, einmal Waschen in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 um gefiltert). </li><li> Führen Immunfärbung der Zellen auf der Membraneinsatz 26, wie zuvor beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die Membran mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand) und klebe sie auf aglass Schlitten mit Fluoreszenz-Eindeckmedium. Untersuchen Membran durch Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Medizinische Forschung in Hirnerkrankungen leidet viel translationale Schwierigkeiten. Im Bereich des akuten ischämischen Schlaganfalls, zum Beispiel viele Medikamente, die große Verheißung in Tiermodellen zeigten, scheiterte an der Klinik 38,39. Die Gründe für diese enttäuschende Ergebnisse sind vielfältig und umfassen Untreue der präklinischen Testsysteme auf den menschlichen Schlaganfall-Szenario und Überbewertung der Ergebnisse aus Tierstudien, 21 erhalten. Eine Strategie, um den Vorhersagewert...

Die BBB ist eine spezielle Schnittstelle zwischen der peripheren Durchblutung und des zentralen Nervensystems, entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hämostase Gehirn verantwortlich. Es umfasst verschiedene Hirnmikrovaskulären Endothelzellen (BEK), die funktional durch wenige zellulären und zellfreien Komponenten (unten) beeinflusst werden, um eine enge und dynamische Gateway in das Gehirn bilden. Unter physiologischen Bedingungen ist die BBB schränkt den Durchtritt von Blutzellen, Plasmabestandteile und Schadstoffe, alle potentiell neurotoxische, in das Gehirn. Parallel dazu wird die BBB selektiv tauscht Schlüssel-Ionen und Nährstoffe (Glukose und Aminosäuren) und Stoffwechselabfallprodukte zwischen dem Gehirn und den Kreislauf, genau die Gehirnumgebung 1,2 zu halten. In den letzten Jahren ist es immer deutlicher, dass Versagen der BBB in einer Vielzahl von chronischen Hirnerkrankungen, wie z. B. neurodegenerative oder entzündungsbedingten Krankheiten (z. B. Alzheimer-Krankheit und tritt multiple Sklerose, beziehungsweise) 3, sowie bei akuten Erkrankungen wie Schlaganfall 4. Die einzigartigen Eigenschaften von BBB Hirnendothelzellen (BECs) sind weitgehend durch ihre Gehirnumgebung 5 induziert, insbesondere durch Astrozyten 6,7. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass andere Zelltypen, wie Perizyten 8, Nervenzellen und Mikroglia 1,3 sowie die Basalmembran 9, unterstützt BECs und bilden zusammen eine Funktionseinheit als der &quot;neurovaskuläre Einheit&quot; (NVU), die gleichzeitig Paare neuronalen Stoffwechselanforderungen, um ihre Versorgung Kapillaren 10. Die Beteiligung des BBB in pathologischen Situationen zugrunde zahlreiche Versuche, in-vitro-Modelle zu entwickeln, um BBB in BBB-Forschung 11,12 unterstützen. Diese Modelle versuchen, so nah wie möglich in vivo nachahmen BBB Eigenschaften nach der NVU-Prinzip. In-vitro- </em&gt; BBB-Modelle basieren im Allgemeinen auf einer Monolage von Tight-Junction-bildenden BECs (vor allem aus Rinder 13, Menschen 14, 15 Ratte, Maus 16, 17,18 und Schweine Herkunft), auf einer porösen Membran kultiviert zusammen mit unterstützenden Astrozyten (ausführlich bis zum Jahr 2005 11 Deli et al. prüft). Astrozyten in der berührungslosen Bedingungen auf dem Boden einer Gewebekulturvertiefung, von BECs (auf der oberen Oberfläche der Membran kultiviert) noch durch das Kulturmedium mit BECs Kommunikation über lösliche Faktoren 16 getrennt gehalten werden. In fortgeschritteneren Modelle, die besser ähneln die anatomische Struktur der BBB in vivo werden in Astrozyten Kontaktbedingungen und unmittelbar auf der gegenüberliegenden Seite der Membran in nächster Nähe zu BECs 13,15,17 (Fig. 1) kultiviert gehalten. Diese Konfiguration ermöglicht physischen Kontakt zwischen BEK und Astrozyten gegründet, als Astrozyten Projektihre Prozesse durch die poröse Membran. Wichtig ist, dass für einen echten Kontakt zu treten die Poren sollte 1 um im Durchmesser ≥ werden, da Astrozyten End-Füße können nicht durch kleinere Porengrößen (dh 0,4 um) 14,15 geben. Insbesondere werden Kontakt BBB Systeme in einigen Studien gezeigt, überlegen ihrer berührungsGegen hinsichtlich ihrer trans-endothelialen elektrische Widerstand (TEER) und endotheliale Permeabilität Werte verschiedener Tracer 13,17,18 sein. Eine zusätzliche Dimension der Medienfluss wurde kürzlich in einer Reihe von in vitro-Modellen BBB Scherkräfte am Endothel engere Simulation des Hirngefäßsystems gelten 12,19 aufgenommen. Ein technisches Hindernis bei der Erzeugung eines Kontakt BBB Modell zu überwinden, ist das Impfen von Astrozyten gegen die Schwerkraft auf der abluminalen Oberfläche der porösen Membran. Vorherige Protokolle 13,20, wo Astrozyten wurden einfach in einem Tropfen Medien nicht auf eine in ausgesätumgewandelt Einsatz, erlaubt nur kurze Aussaatzeiten (dh 10 min 13 oder 2 Std. 20), die in unseren Händen gefunden wurden, nicht ausreichend für die ordnungsgemäße Zellhaftung zu sein. Unter Verwendung dieses Grundverfahren eine längere Periode Astrozyten Befestigung erfordert eine ständige Überwachung der Einsätze durch häufiges Öffnen des Inkubators (was Schwankungen in Temperatur, pH und Luftfeuchtigkeit) und ist auch anfällig für ungleichmäßige Zellaussaat durch Leckage von Medium durch die Poren, insbesondere Wenn Poren größer als 1 &amp;mgr; m verwendet. Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die Herstellung einer Kontakt BBB Modell. Unser Verfahren schließt ein alternatives Verfahren für die Zellaussaat auf invertierte Einsätze, die die oben genannten Einschränkungen Adressen. Das Verfahren ermöglicht die Einhaltung von Astrozyten ungestört auf der abluminalen Membranoberfläche, äquilibriert in einem Inkubator, für einen längeren Zeitraum. Als Ergebnis wird eine gleichmäßige Aussaat von Astrozyten erreicht, die Barrierequalität erhöhtund minimiert die basale Durchlässigkeit Variationen zwischen den Einsätzen. Da die Verwendung von menschlichen Zellen ist wichtig für die Mensch-relevanten Forschungs 21, zusätzlich haben wir in diesem Artikel zeigen, die spezifische Nutzung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und verewigt menschlichen Astrozyten für die Einrichtung einer Kontakt menschlichen BBB-Modell mit einem Hochdurchsatz-Screening-Kapazität . Da die Anzeige von Zellen auf porösen Membranen kann schwierig wir auch ausführlich Färbetechniken, die bei der Bestimmung der Zusammenfluss und Zellmorphologie auf den porösen Membranen unterstützen kann. Schließlich veranschaulichen wir, wie unsere menschlichen BBB-Modell kann genutzt werden, um die Wirkung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zu untersuchen - ein Blutgerinnsel Zerschlagung Enzym, das als einzige Behandlungsoption für akuten ischämischen Schlaganfall dient - auf der BBB.

<table><tbody><tr><td>Attachment Factor</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovaskuläre Endothelzellen (BECs) des Gehirns, primär, human</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Komplettes Medium</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>Ergänzt mit CSC JetFuel</td></tr><tr><td>Komplettes serumfreies Medium</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td><td>Ergänzt mit CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 mit 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (aus Rindern)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Externer Silikonschlauch</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Marke Pumpsil, 8 mm Innendurchmesser, 1,6 mm</td></tr><tr><td>Wandstärke Fötales Kälberserum</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Pfizer</td><td></td><td>1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Interner Silikonschlauch</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A032.016</td><td>Marke Pumpsil, 3,2 mm Innendurchmesser, 1,6 mm Wandstärke</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s Hämatoxylin-Lösung</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentielles Medium mit Earle' s ausgewogene Salzlösung</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Rattenkollagen I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Marke Cultrex</td></tr><tr><td>Gewebekultureinsätze</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>Marke Transwell, 6,5 mm Durchmesser, mit poröser Polyestermembran, 3 & Mikro; M Porengröße</td></tr></tbody></table>

verbesserte methode zur präparation einer menschlichen zelle-basierte, kontakt modell der blut-hirn-schranke

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​umfasst undurchlässig, aber anpassungsfähig Gehirn Kapillaren, die genau steuern das Gehirn Umwelt. Ausfall der BBB hat in der Ätiologie von vielen Hirnerkrankungen deutet worden, entsteht ein Bedarf für die Entwicklung von humanen in vitro Modellen BBB in klinisch relevanten Forschung zu unterstützen. Unter den zahlreichen BBB-Modelle bisher beschrieben, eine statische (ohne Strömung), wenden BBB-Modell, bei dem Astrozyten und Gehirn-Endothelzellen (BEK) auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran kokultiviert, entpuppte sich als ein vereinfachtes System, um noch authentisch zu simulieren, die BBB mit Hochdurchsatz-Screening Kapazität. Dennoch ist die Erzeugung eines solchen Modells stellt einige technische Herausforderungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung eines Humankontakt BBB Modell unter Verwendung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und immortalisierten menschlichen Astrozyten. Insbesondere haben wir ausführlich eine innovative Methode zur Zellaussaat auf invertiert Einsätze sowie Insertion angebent Färbetechniken und veranschau, wie wir unser Modell für BBB-Forschung zu verwenden.

Um einen Menschen, Kontakt BBB Modell mussten wir SVG-Dateien und BECs auf porösen Membranen mit einem 3 um Porengröße, um den Durchgang gezeigt Astrozyten End-Füße für den Kontakt mit Endothelzellen 14,15,27,28 erlauben pflegen zu etablieren. Eine schematische Darstellung des kompletten Kontaktmodell ist in Abbildung 1 (linke Abbildung) dargestellt. Die wichtigsten technischen Herausforderungen durch ein Kontaktsystem dargestellt ist die Notwendigkeit, Astrozyten gegen die Schwerkraft auf de...

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Dieses Verfahren zielt auf eine In-vitro-Simulation der Blut-Hirn-Schranke ab, indem Astrozyten und endotheliale Zellen auf gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran koinkubiert werden. Beschichten Sie zunächst die luminalen Oberfläche der porösen Membran mit einer extrazellulären Matrix. Tragen Sie ein Protein wie Kollagen auf, und passen Sie den invertierten Insert mit einem äußeren Silikonrohr und einem inneren Silikonstopfen an, um einen abnehmbaren Brustkammer über der abluminalen Oberfläche der Membran zu bilden.Seeden Sie nun die Astrozyten auf dem invertierten Insert, sodass sie an der abluminalen Oberfläche haften. Entfernen Sie anschließend die Tubing und setzen Sie das Insert in seiner normalen Orientierung in eine mit Medium gefüllte Vertiefung ein. Seeden Sie danach die endothelialen Zellen in den luminalen Kompartiment des Inserts und kultivieren Sie sie gemeinsam mit den gegenüberliegenden Astrozyten. Schließlich wird der Durchtritt fluoreszierender Tracer oder die Aufzeichnung des transendothelialen elektrischen Widerstands verwendet, um Permeabilitätsänderungen in der in-vitro-Blut-Hirn-Schranke als Reaktion auf verschiedene stimulierende Agentien zu messen.

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt die gemeinsame Kultivierung von menschlichen Gehirnperizyten, Astrozyten und Endothelzellen. Jede Zellschicht wird separat gebildet und dann zusammen kultiviert, wodurch ein dreischichtiges System entsteht, das die zelluläre Anordnung der Blut-Hirn-Schranke...

Entwicklung eines Dreifachzellkulturmodells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke

Die Epithelzellen des Plexus choroideus (CP) bilden die Blut-Liquor-Schranke (BCSFB). Ein In-vitro-Modell des BCSFB verwendet humane Zellen des Plexus choroidus papillom (HIBCPP). Dieser Artikel beschreibt die Kultivierung und basolaterale Infektion von HIBCPP-Zellen mit Hilfe eines Zellkultur-Filtereinsatzsystems.

Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Hier beschreiben wir die Methode zur Etablierung eines Dreifachzellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke basierend auf primären mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns, Astrozyten und Perizyten. Dieses multizelluläre Modell eignet sich für Studien zur neurovaskulären Einheitendysfunktion während eines ischämischen Schlaganfalls in vitro oder für das Screening von Arzneimittelkandidaten.

Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Erfahren Sie die verbesserte Kokulturmethode von Astrozyten und Hirnendothelzellen für ein realistisches Blut-Hirn-Schranken-Modell. Diese Technik ermöglicht präzise Permeabilitätsstudien und die Untersuchung pharmakologischer Effekte auf die BBB-Integrität.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

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