Die Produktion von Apolipoprotein C-III-Knockout Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuartige Kaninchenmodelle zur Erforschung menschlicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst Zinkfingernukleasen entworfen und synthetisiert werden, die das gewünschte Gen gezielt ansprechen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die ZFN-RNAs in das Zytoplasma von Pronukleus-Stadium-Embryonen einzuspritzen.

Der dritte Schritt besteht darin, die Embryonen chirurgisch in ein Empfängerkaninchen zu übertragen. Der letzte Schritt ist die Genotypisierung der Neugeborenen, um transgene Tiere zu identifizieren. Die gesamte gezielte Genmodifikation mittels ZFN ist äußerst effektiv und wird hier durch die Erzeugung eines A OC drei Knockout-Kaninchens belegt.

Diese Technik ist ein Meilenstein der Gentechnik, da sie erstmals die Herstellung von No-Code-Kaninchen ermöglicht. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie zahlreicher menschlicher Erkrankungen, wie beispielsweise Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Es wird zunehmend erkannt, dass große Tiermodelle erforderlich sind, um die Physiologie und Pathologie des Menschen besser nachzuahmen.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir 2009 den Artikel über die erfolgreiche Genzielrichtung unter Verwendung einer signifikanten Nuklease in Rot lasen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie die mikroinjektion von Konstrukten in das Zytoplasma erfordert. Obwohl diese Methode Einblicke in die Genzielrichtung bei Kaninchen ermöglichen kann, ließe sie sich auch auf andere Systeme wie Schweine anwenden.

Beginnen Sie mit der Superovulation geschlechtsreifer weißer Neuseeland-Kaninchen durch subkutane Injektion von FSH zweimal täglich über einen Zeitraum von drei Tagen, wobei die Dosis täglich erhöht wird. 72 Stunden nach der letzten FSH-Injektion injizieren Sie 200 IE HCG intravenös, um die Ovulation auszulösen; die superovulierten Weibchen werden unmittelbar danach einzeln begattet. Zu diesem Zeitpunkt muss auch ein Empfängertier vorbereitet sein.

16 bis 18 Stunden nach der Besamung euthanasieren Sie die superovulierte Spendin mit Natriumpentobarbital. Gewinnen Sie den UFT-Pulk, indem Sie den gesamten Uterus vorsichtig entnehmen. Spülen Sie die Eileiter und Eierstockstrukturen aus, indem Sie jeden UFT mit 10 Milliliter Manipulationsmedium durch Spülung von der Uterusseite des UFT befüllen.

Sammeln Sie das durchströmte Medium am Eierstockende des UCT in einer Petrischale. Die gewonnenen Embryonen befinden sich im durchströmten Medium. Waschen Sie die Embryonen anschließend dreimal mit Manipulationsmedium.

Danach die Embryonen im Manipulationsmedium bei 38,5 Grad Celsius in normaler Luft inkubieren. 19 bis 21 Stunden nach der Besamung die Embryonen mittels eines Stereomikroskops auswählen.

Sammeln Sie etwa 30 Embryonen im Pronukleusstadium für jede Injektionsbedingung; erwarten Sie 30 bis 40 solcher Embryonen pro superovulierter weiblicher Maus. Beschaffen Sie im Voraus ZFN-Sätze für das Gen der Interesse von einem Hersteller.

Auswahl derjenigen mit den besten ZFN-Scores. In diesem Beispiel ist das Gen von Interesse A OC three. Um die ZFN-mRNA vorzubereiten, transkribieren Sie zunächst die ZFN-Messenger-RNA in vitro und polyadenylieren die Transkripte.

Als Nächstes das resultierende mRNA reinigen und resuspendieren. In RNA-Sprühlösung 0,1 × E suspendieren. Anschließend die RNA-Konzentration mittels eines Spektrophotometers messen und Aliquote der mRNA, die ZFN-Paare kodieren, in einer Konzentration von vier bis 10 Nanogramm pro Mikroliter in 10-Mikroliter-Vials zur Lagerung vorbereiten. Beginnen Sie mit dem Aufheizen der Mikroinjektionsplattform auf 38 Grad Celsius.

Um die Mikroinjektionsplattform vorzubereiten, entfernen Sie zuerst die Mediumkammer von einem Einzelkammer-Objektträger, geben dann einen Tropfen von fünf Mikrolitern Manipulationsmedium auf den Objektträger und bedecken diesen mit Mineralöl. Stellen Sie den vorbereiteten Objektträger auf die beheizte Mikroskopbühne.

Befestigen Sie als Nächstes eine Haltepipette mit einem Durchmesser von 120 Mikrometern an einem Mikromanipulator und positionieren Sie die Pipette in den Tropfen Medium auf der Plattform. Tauchen Sie die mRNA, die injiziert werden soll, nun auf Eis auf. Füllen Sie sie in eine Injektionspipette, die aus einem borosilikatglasartigen Kapillarrohr mittels eines Mikropipettenzuggeräts hergestellt wurde.

Schalten Sie als Nächstes die an den Mikroinjektor angeschlossene Druckluftversorgung ein. Befestigen Sie dann die Injektionspipette an ihrem Halter und verbinden Sie diesen mit einem zweiten Mikromanipulator. Positionieren Sie diese Pipette ebenfalls in den Tropfen Medium.

Konfigurieren Sie nun den Mikroinjektor für ein Injektionsvolumen von ein bis fünf Pikolitern. Um die Spitze der Injektionspipette zu öffnen, klopfen Sie vorsichtig dagegen auf die Haltepipette.

Überführen Sie mithilfe einer Glaspipette 30 bis 50 Embryonen auf den Mikromanipulations-Tropfen auf der Plattform. Anschließend bei 100-facher Vergrößerung.

Verwenden Sie die Haltepipette, um ein Embryo zu erfassen. Richten Sie die Haltepipette und den Embryo unter 400× nun auf die Injektionsnadel aus. Führen Sie die Injektionspipette durch den Embryo hindurch.

Seien Sie vorsichtig, um den Zellkern zu meiden. Sobald die Plasmamembran durchstoßen ist, drücken Sie das Fußpedal, um die mRNA zu injizieren. Ziehen Sie nach der Injektion die Nadel heraus und geben Sie den Embryo frei. Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Embryonen.

Nach der Injektion waschen Sie die Embryonen dreimal im Embryokulturmedium, wobei jede Wäsche 30 Sekunden dauert. Anschließend inkubieren Sie die Embryonen eine bis zwei Stunden bei 38,5 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid, bevor Sie sie in die synchronisierte Empfängerin übertragen.

Weibliches Kaninchen. Um die Embryonen bis zum Blastozystenstadium kultivieren zu können, muss der Inkubator über befeuchtete Luft verfügen. Wählen Sie ein fünf bis zwölf Monate altes weibliches NZW-Kaninchen aus, das sich in guter Gesundheit befindet und vier bis fünf Kilogramm wiegt.

Bereiten Sie das Empfängertier vor, indem Sie zunächst Gonadotropin freisetzendes Hormon intramuskulär verabreichen. 16 bis 24 Stunden nach der Hormoninjektion betäuben Sie das Kaninchen mit Ketamin und/oder vaporisiertem Isofluran. Wenn das Kaninchen vollständig bewusstlos ist, zeigt es keine Fußreflexe mehr.

Wenn vor der Operation der Fußpolster zusammengedrückt wird, schützen Sie die Augen mit einem Augensalbe und bereiten Sie den Bauchraum vor. Während der Operation erfassen Sie die Vitalfunktionen des Kaninchens. Beginnen Sie alle 15 Minuten damit, einen Schnitt von etwa 2,5 Zentimetern Länge durch die Haut und anschließend entlang der Muskelschicht zu führen.

Legen Sie jeden mit dem zugehörigen Uterushorn verbundenen Eierstock frei, indem Sie einen Eierstock zwischen Daumen und Zeigefinger halten. Überführen Sie die Embryonen mittels einer sorgfältig eingeführten sterilen Pipette in die Eileiter. Gewöhnlich sind 10 bis 25 von jeweils 30 injizierten Embryonen lebensfähig, und alle können in eine Empfängerin übertragen werden.

Schließen Sie die Operation durch Naht der Muskelschicht mit einer beschichteten resorbierbaren Naht ab. Nähen Sie die Haut entweder mit einer resorbierbaren intrakutanen Naht oder mit einfachen unterbrochenen nicht-resorbierbaren Hautnähten. Anschließend halten Sie das Tier warm und überwachen Sie es, bis es sternale Lagerung erreicht hat.

Die liegende Position wird erreicht. Zunächst wurden 16 ZFN-Paare entworfen. Die gezielte Unterbrechungssequenz des ersten Satzes befindet sich im Exon zwei von OC drei Sätzen.

Eins, zwei und drei wurden ausgewählt und dem Hefe-MEL1-Reporter-Assay unterzogen, um die ZFN-Aktivitäten zu bestimmen. Satz eins wies eine ZFN-Aktivität von 224,2 % auf, was höher lag als die von Sätzen zwei und drei und deutlich über der Auswahl-Schwelle von 50 % der internen positiven Kontrolle lag. Daher wurde Satz eins für die Validierungsexperimente in vitro ausgewählt. mRNA aus Satz eins wurde in 35 Kaninchen-Embryonen mikroinjiziert.

Die BL-Rate der mikroinjizierten Gruppe war im Vergleich zu den nicht mikroinjizierten Embryonen niedriger, was auf eine leicht eingeschränkte Entwicklungskompetenz hindeutet. 18 Embryonen der mikroinjizierten Gruppe entwickelten sich bis zum BL-Stadium am fünften Tag, von denen 16 sequenziert wurden. Die Häufigkeit von vier Mutationen an der Zielstelle war deutlich höher als die Auswahlschwelle, wodurch sich zeigte, dass das festgelegte ZFN-Paar in insgesamt 145 Embryonen wirksam war.

Mikroinjizierte Embryonen mit der ersten ZFN-mRNA wurden in sieben falsch trächtige Empfängnis-Kaninchen übertragen. Frisch ausgespülte Embryonen ohne ZFN-Mikroinjektion wurden nach 30 Tagen Tragzeit als Kontrollgruppe in Empfängerinnen übertragen. In der mikroinjizierten Gruppe wurden 21 Jungtiere geboren.

Die PCR-Sequenzierung identifizierte fünf als positive Knockouts. Die Indels an der Target-Sequenz umfassten zwei Insertionen und drei Deletionen. Mithilfe bioinformatischer Analyse wurden mögliche Off-Target-Stellen für ZFN mit sieben oder weniger Mismatches zur Sequenz der Gruppe eins identifiziert; dabei wurde nur eine mögliche Off-Target-Stelle gefunden, und mittels PCR ließen sich an dieser Stelle keine Ereignisse bei irgendeinem der Founder-Tiere nachweisen.

Eine Uhr, dieses Video anzusehen. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knockout-Kaninchen mittels Zink-Finger-Nuklease-Mikroinjektion erzeugt.

Nachdem die Embryogewinnung beherrscht ist, können Mikroinjektion und Transfer innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass das Injektionsmaterial RNA ist, was besondere Vorsicht erfordert. Im Anschluss an dieses Verfahren wird eine Phänotypisierung durchgeführt, um die biologischen Regeln der gezielten Gene zu verstehen.