Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, grundlegende physikalische Merkmale von Zellproben, einschließlich Masse und Volumen, mit einem Standard-Lichtmikroskop und Bildverarbeitung zu quantifizieren. Dazu werden zunächst Zellproben, die auf Deckgläsern gezüchtet wurden, auf Objektträger montiert. Anschließend werden Aufnahmen im Durchlichtverfahren mit Fokusserie sowie differentieller Interferenzkontrastbilder aufgenommen.

Dann wird jeder Z-Stack von Bildern in separate MATLAB-Bildverarbeitungsprogramme eingegeben, die die physikalischen Daten extrahieren. Letztendlich werden die grundlegenden physikalischen Eigenschaften zellulärer Proben mittels Intensitätsmessungen über den Fokus hinweg unter Hellfeldkontrast und Differentialinterferenzkontrastmikroskopie ermittelt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass zelluläre Proben nicht fixiert, permeabilisiert oder gefärbt werden müssen.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie beantworten, beispielsweise wie die subzelluläre Dichte während des Zellzyklus oder unter verschiedenen Zellpopulationen, die zu einem Krankheitszustand beitragen, organisiert ist. Beginnen Sie unter Verwendung eines Mikroskops mit sowohl DIC- als auch Hellfeld-Funktion und weiteren Spezifikationen gemäß dem Textprotokoll damit, die Slide-Book-Software zu öffnen und eine neue Folie für die Bildaufnahme anzulegen. Öffnen Sie anschließend das Fokusfenster und wählen im Bereich „Filter Set“ die Option DIC aus. Passen Sie auf der Registerkarte „Scope“ im Bereich „Condenser“ den Blendenregler auf die äußerste rechte Position an. Dadurch wird eine Beleuchtung mit hoher numerischer Apertur bereitgestellt und die optische Schichtung der Probe verbessert.

Nachdem ein DIC-Stapel der Probe aufgenommen wurde, öffnen Sie das Fokusfenster und wählen Sie „Öffnen“. Stellen Sie im Bereich „Filter Set“ den Blendenregler ganz nach links bis zum Anschlag geschlossen, um eine Beleuchtung mit niedriger numerischer Apertur (NA) zu gewährleisten. Nach der Anpassung der Signalintensität öffnen Sie das Fenster zur Bildaufnahme.

Die 3D-Aufnahmeeinstellungen aus der DICZ-Stapel-Aufnahme werden im Filtersatzbereich des Bildaufnahmefensters angezeigt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen und geben Sie die Belichtungszeit an. Benennen Sie im Bereich Bildinformationen das Bild und wählen Sie „Start“, um die Zack-Bildaufnahme zu beginnen.

Exportieren Sie dann die Z-Stapel gemäß dem Textprotokoll, um Volumenmessungen im H-T-D-I-C-MATLAB-Programm mit dem Titel JoVE HT DCO V one M unter Abschnitt null durchzuführen. Aktualisieren Sie die Verzeichnisvariable für Abhängigkeiten, indem Sie das Verzeichnis kopieren und einfügen, das die Dateien hilbert.Transform DM und sobel edge Detect M aus Explorer enthält. Führen Sie zwischen den einfachen Anführungszeichen nach „Abhängigkeitsverzeichnis =“ den Abschnitt null des joco HT DCO V one M-Programms aus.

Im ersten Abschnitt aktualisieren Sie das Bilder-Verzeichnis, indem Sie das Verzeichnis mit den durch Fokus-Bildern im Format .TIF kopieren und einfügen. Führen Sie diesen Abschnitt nur einmal zwischen den einfachen Anführungszeichen aus, um die Bilder auszurichten und zu drehen. Führen Sie für die Hilbert-Transformation Abschnitt zwei des Codes aus. Ein Dialogfeld mit dem Titel HT DIC-Parameter definieren wird angezeigt.

Geben Sie dann die Fokalebene-Nummer ein, bei der das DIC-Bild der Probe scharf ist, die laterale Auflösung, die axiale Auflösung, den Drehwinkel des DIC-Bildes, der für die Durchführung der Hilbert-Transformation benötigt wird, und schließlich die Größe des interessierenden Bereichs. Klicken Sie dann auf „Okay“. Ein Bild der durch die Fokalebene-Nummer angegebenen DIC-Fokalebene erscheint mit einem blauen Kasten.

Platzieren Sie das Kästchen über dem gewünschten Merkmal, beispielsweise einer Zelle. Sobald das Kästchen über dem gewünschten Bereich positioniert ist, doppelklicken Sie innerhalb des B. Der Kontrast des Bildes sollte so eingestellt sein, dass dunkle Strukturen links erscheinen, während helle Strukturen rechts erscheinen. Ziehen Sie das blaue Kästchen über den interessierenden Bereich und passen Sie gegebenenfalls seine Form an.

Danach, im Abschnitt drei, um eine rechteckige Maske zu erzeugen, heben Sie die Auskommentierung der Zeile 1 6 7 auf und kommentieren Sie Zeile 1 7 0 aus. Führen Sie Abschnitt drei des Programms aus, indem Sie auf das Bild klicken und die Maus ziehen, um die rechteckige Maske zu definieren. Doppelklicken Sie anschließend auf das Feld, um diese zu bestätigen. Um eine frei gezeichnete Maske zu erzeugen, kommentieren Sie Zeile 1 6 7 aus und heben Sie die Auskommentierung von Zeile 1 7 0 auf, bevor Sie Abschnitt drei ausführen. Klicken und zeichnen Sie mit der Maus die gewünschte Maske, und doppelklicken Sie nach dem Zeichnen auf die Maske, um sie zu akzeptieren. Nach Ausführung von Abschnitt vier führen Sie Abschnitt fünf aus, um die nach dem Textprotokoll beschriebenen Hilbert-transformierten Bildstapel zu erstellen.

Um die Bildsegmentierung der xz-Schnittbilder des interessierenden Bereichs zu optimieren. Die vom Programm erzeugte Abbildung 500 erscheint mit drei verschiedenen Kontrasttypen. Der Erfolg des Algorithmus bei der Erkennung der Zellgrenzen hängt von einer Kombination aus der verwendeten Maske und dem Schwellenwert in Zeile 2, 2, 9 des Programms ab. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5 und passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie diesen Programmbereich erneut ausführen, bis eine geeignete Umrandung in einer der Spalten erreicht ist.

Wenn die Umrisserkennung in Spalte eins am besten war, verwenden Sie Abschnitt sechs, um das Volumen in der DIC-Segmentierung zu bestimmen. Wenn Spalte zwei optimale Ergebnisse lieferte, führen Sie Abschnitt sieben aus, um das Zellvolumen aus der Hilbert-transformierten DIC-Bildgebung zu ermitteln. Falls Spalte drei die besten Ergebnisse zeigte, verwenden Sie die vorab gefilterte Hilbert-transformierte DIC-Bildgebung und führen Sie Abschnitt acht aus, um das Volumen zur Bestimmung der Masse im NIQ PM MATLAB-Programm mit dem Titel JO VCO NI qpm V1 M unter Abschnitt null zu berechnen. Aktualisieren Sie den Speicherort der drei Verzeichnisabhängigkeiten, BRIGHTFIELD und DIC-Verzeichnis. Nachdem Sie Abschnitt eins ausgeführt haben, führen Sie Abschnitt zwei im Dialogfeld mit dem Titel „define N-I-Q-P-M parameters“ aus und geben Sie die Fokalebene-Nummer ein, in der das Hellfeldbild der Probe scharf ist, sowie die laterale Auflösung, die axiale Auflösung und die Größe des interessierenden Bereichs.

Klicken Sie dann auf „Okay“. Ein Bild der durch die Fokusebenennummer festgelegten Hellfeld-Fokusebene wird mit einem blauen Kasten angezeigt. Nachdem ggf. die Fokussierung durch erneutes Ausführen von Abschnitt zwei angepasst wurde, ziehen Sie den Kasten um das Bild herum, wählen Sie die Knotpunkte des Kastens aus und ziehen Sie diese, um die Größe anzupassen, bevor Sie doppelt in den Kasten klicken, um die Auswahl zu bestätigen.

Wenn ein Stapel von Hellfeldbildern durch Ausführen von Abschnitt drei erstellt wurde, führen Sie Abschnitt vier aus, um die Phasenkarte, Pseudo-DIC-Bilder und Vergleiche mit Hellfeldbildern sowie das echte DIC-Bild zu generieren. Wenn die Pseudo-DIC- und die echten DIC-Bilder so ähnlich wie möglich sind, führen Sie Abschnitt fünf A oder fünf B aus, die es dem Benutzer ermöglichen, die Zelle zu umreißen, um die Massendichtekarte, die Gesamtmasse und das Histogramm der korrekten Zelldichte zu erzeugen. Die Beleuchtung der Probe während der Aufnahme von Fokusdurchlaufbildern ist entscheidend für die erfolgreiche Durchführung des N-I-Q-P-M- und H-T-D-I-C-Algorithmus. Diese Abbildung zeigt Beleuchtung mit niedriger und hoher NA sowohl unter DIC- als auch unter Hellfeldkontrast für eine Polystyrolkugel und die humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie SW six 20.

Diese Bilder zeigen die optimale Bildgebung für N-I-Q-P-M und diese zeigen die optimale Bildgebung für HT DIC. Diese Aufnahmen veranschaulichen die Parameterabhängigkeit des NIQ-PM-Algorithmus und verdeutlichen sowohl erfolgreiche als auch nicht erfolgreiche Implementierungen. Hier untersuchen wir das Phasenprofil einer Polystyrolkugel mit einem Durchmesser von 4,8 µm.

Das erwartete Profil ist theoretisch bekannt und kann daher direkt mit der NIQ-PM-Rekonstruktion verglichen werden. Diese Abbildungen zeigen die bestmögliche Rekonstruktion, die für die Beugungseffekte an der Kugel erreichbar ist; jedoch verhindern Effekte sowohl an den Grenzen der Kugel als auch im Inneren eine stabile Rekonstruktion an allen Punkten der Kugel. Der zentrale Bereich der Kugel kann mittels N-I-Q-P-M mit einem prozentualen Fehler von ein bis 5 % erfasst werden, wie in Abbildung L zu sehen ist, zelluläre Proben, deren Phaseneigenschaften nicht bekannt sind.

A priori kann unter Verwendung von NIQ PMM in Verbindung mit einem Verfahren zur Vergleichung eines Pseudo-DIC-Bildes mit einem tatsächlichen DIC-Bild rekonstruiert werden. N-I-Q-P-M weist einen freien Parameter auf: die Ebene im rechten Feldbild-Stack, in der die Berechnung zentriert ist.

Diese zentrale Fokusebene sollte so lange angepasst werden, bis die Pseudo-DIC- und die echte DIC-Bilder so ähnlich wie möglich erscheinen. Dargestellt sind hier ein unscharfes Pseudo-DIC-Bild, ein optimales Pseudo-DIC-Bild und das entsprechende DIC-Bild der Zelle, aufgenommen mit einer Beleuchtungs-NA von 0,9. Interessanterweise entsprechen das beste Phasenbild und das zugehörige Pseudo-DIC-Bild nicht notwendigerweise einem scharfen Hellfeldbild, wie in diesen Darstellungen gezeigt.

Als Letztes sind hier die Schritte des H-T-D-I-C-Bildverarbeitungsalgorithmus dargestellt, beginnend mit der DIC-Bildgebung durch Fokus unter NA = 0,9 Beleuchtung. Die Hilbert-Transformation wird durchgeführt, um das Grundrelief der DIC-Bilder zu entfernen. Dies führt zu einer leichten Unschärfe entlang der optischen Achse, die mithilfe eines Hochpass-Vorwärtsfilters beseitigt werden kann. Diese endgültigen Bilder lassen sich leicht segmentieren, um die Fläche in jeder Querschnittsebene der Probe zu bestimmen und daraus das gesamte zelluläre Volumen abzuleiten.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die korrekte Beleuchtung für die Hellfeld- oder Differenzialkontrast-Aufnahme nach diesem Verfahren zu beachten. Andere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen mittels der Kolokalisation von Bodenkraft mit Dichtekarten der Probe zu beantworten.