Name: Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem Standardmikroskop zelluläre Masse, Volumen und Dichte quantitativ bestimmen. Diese nicht-invasive Methode nutzt Hellfeld- und Differentialinterferenzkontrast-Mikroskopie für lebende Zellen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (U54CA143906 zu KGP, OJTM und R01HL101972 zu OJTM) und einem Oregon Medical Research Foundation Frühe klinische Investigator Award (KGP) unterstützt. OJTM ist ein American Heart Association Gegründet Investigator (13EIA12630000). Wir danken Dr. Eric Anderson von dem Ritter Cancer Institute für die Herstellung von Zellproben in dieser Arbeit verwendet.

1. Mikroskop Technische Daten Zur Durchführung Bildgebung in der richtigen Art und Weise das Mikroskop sollte den folgenden Spezifikationen: <ol><li> Besitzen beide Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Hellfeld (BF) Kontrast. </li><li> Haben Computer-gesteuerten z-Achsen-Bewegung. </li><li> Haben Sie eine verstellbare Blende, um die Sammellinse numerische Apertur variieren. Eine Öffnung mit einer abgestuften Regel oder elektronische Auslesung erforderlich ist, um den Wert der numerischen Apertur zu kennen. Die numerische Apertur von 0,1 sollte für NIQPM bis 0.9 (oder höher) für HTDIC reichen. </li><li> Das Mikroskop sollte eine Schmalband-Farbfilter müssen für Hellfeld-Bildgebung genutzt werden. Dieser Filter ist erforderlich, um den Brechungsschritt, eine wellenlängenabhängige lung zur Phase der Massendichte für NIQP konvertieren zu beheben. </li></ol> 2. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Öffnen Sie die Slidebook Software einnd erstellen Sie eine neue Folie für die Bildsammlung. </li><li> Dann öffnen Sie den Fokus-Fenster. Unter dem Filter-Set Wählen Sie im Abschnitt DIC. Auf der Registerkarte Bereich unter der Kondensator Abschnitt, stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten rechten Position (in alle Richtungen öffnen). Dies sorgt für hohe numerische Apertur Beleuchtung und verbessert optische Schnitte der Probe. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Probe mit Hilfe eines DIC Ziel. Einstellen der Halogenlampenintensität, bis die Probe leicht sichtbar ist. Um sicherzustellen, dass die Kamera nicht gesättigt ist, wählen Sie die Registerkarte Kamera in der Focus-Fenster und überprüfen Sie, dass das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb der Dynamikbereich der Kamera. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. In dem Abschnitt Aufnahmetyp, überprüfen Sie die 3D-Box. In der 3D-Capture-Abschnitt, wählen Sie den Bereich um das Zentrum und zurück zu aktuellen Standort </strong&gt; Boxen und geben Sie den Z-Richtung Bereich, die Anzahl der Flugzeuge und Schrittweite. Die Z-Richtung Bereich sollte die gesamte Probe zu integrieren. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bild-Capture Fenster die DIC Kästchen und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um die Abbildung zu initiieren. </li></ol> 3. Hellfeld (BF) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Sobald das Mikroskop Sammeln der DIC Z-Stapel von der Probe beendet ist, öffnen Sie den Fokus-Fenster und wählen Sie unter dem Filter-Set Abschnitt Öffnen. Stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten links (geschlossen den ganzen Weg) zum niedrigen NA Beleuchtung zu bieten. </li><li> Ändern Sie den Mikroskoplicht-Pfad-Filter auf grün. Stellen Sie die Halogenlampe Intensität, bis die Probe sichtbar ist. Sicherzustellen, dass keine Sättigung der Kamera durch Auswahl der <strong&gt; Kamera-Registerkarte in der Focus-Fenster und überprüfen, ob das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb des angegebenen Bereichs. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. Die 3D-Capture-Einstellungen aus der Z-Stapel Erwerb DIC wird angezeigt. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bildaufnahme-Fenster, überprüfen Sie die OPEN-Box und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um den Z-Stapel-Bildakquisition zu initiieren. </li></ol> 4. Exportieren Z-Stapel-Bilder <ol><li> Öffnen Sie ein Z-Stapel-Aufnahme. Ändern Sie die Ansicht auf 100%. Einstellen des Histogramms der Pixelwerte zwischen 0 angezeigt, und der maximale Pixelwert der Kamera (4.095 für 12-Bit-Kameras, 65.535 für 16 Bit.). </li><li> Wählen Sie Ansicht&gt; Exportieren&gt; TIFF-Serie. Dadurch wird die Z-Stapel als eine Reihe von TIFF exportieren(Eine für jede Z-Ebene). Speichern Sie die TIFF-Serie in einem separaten Ordner mit einem Namen, der einen Unterstrich am Ende (dh &quot;DIC Stapel 1_&quot;) hat. Wiederholen Sie dies mit jedem DIC oder BF Z-Stapel. </li></ol> 5. Volumenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die HTDIC MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des HTDIC Programm, aktualisieren Sie die Abhängigkeiten Verzeichnis variabel. Kopieren Sie das Verzeichnis mit der hilbert_transform_dic.m und sobel_edge_detect.m Dateien aus dem Explorer (PC) in zwischen den einfachen Anführungszeichen folgenden &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 des JoVE_HTDIC_v1.m Programm. </li><li> In Abschnitt 1, aktualisieren Sie die &quot;images_directory&quot;. Auch Kopieren Sie das Verzeichnis mit den durch-Fokus-Bilder in. Tif Form zwischen den einfachen Anführungszeichen. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Ausrichtung und Drehung der Bilder für Hilbert-Transformation Run Abschnitt 2 des Codes. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define HTDIC Parameter&quot; wird angezeigt. Fünf numbeRS sind für den Benutzer erforderlich, die Brennebene Nummer, die DIC-Bild der Probe fokussiert ist, laterale Auflösung (&amp;mgr; m / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist 0,1 für die Bildaufnahme in 0,1 um axiale Stufen), der Drehwinkel der DIC-Bild benötigt, um die Hilbert-Transformation durchzuführen, sind 45 und -135 typische Werte. Schließlich geben Sie die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite der Box, die später erscheinen werden - typischer Wert ist 400. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben DIC Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. Positionieren Sie die Box auf das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Sobald die Box über den gewünschten Bereich, doppelklicken Sie in der Box positioniert. </li><li> Eine weitere Zahl wird nun angezeigt: Diese Zahl enthält eine beschnittene und gedrehte Bild der Region von Interesse in der vorherigen Schritt ausgewählt. Der Kontrast des Bildes sollte so sein,dass dunkle Funktionen erscheinen auf der linken Seite, während helle Funktionen erscheinen auf der rechten Seite. Ziehen Sie die blaue Box auf dem Gebiet von Interesse, neu zu gestalten wie nötig. </li><li> Abschnitt 3 erzeugt eine Maske für die z-Stapel Würfel. Es gibt zwei Arten von Masken zur Verfügung: eine rechteckige Maske, um ein Rechteck um die Zelle und ein Freihandwerkzeug, um die Zelle von Interesse von Hand skizzieren erstellen. </li><li> Um eine rechteckige Maske, entfernen Linie 167 und Linie 170 Kommentar (Kommentar einer Linie durchgeführt, indem ein &quot;%&quot; am Anfang der Zeile) zu erzeugen. Führen Abschnitt 3 des Programms. Klicken Sie in das Bild und ziehen Sie die Maus, die rechteckige Maske definieren, um zu beginnen. Doppelklicken Sie auf das Feld, um es zu akzeptieren. </li><li> Um eine von Hand gezeichnete Maske Kommentarzeile 167 und Kommentar-Linie 170 zu generieren und auszuführen Abschnitt 3. Klicken Sie auf und ziehen Sie die gewünschte Maske mit der Maus. Doppelklicken Sie auf die Maske, es zu akzeptieren. </li><li> Führen Abschnitt 4to der Hilbert-Konstrukt transformiert DIC Bildstapel und die entsprechende DIC Bildstapel der Bereich von Interesse.Die in Abschnitt 3 aufgebaut Maske wird dem Hilbert-Transformation angewendet werden DIC-Stack und die regelmäßige DIC Stapel, wenn &quot;Maskon&quot; auf 1 in Zeile 179 festgelegt ist. Einstellung &quot;Maskon&quot; wird auf 0 Bildstapeln ohne Auftragen der Maske zu konstruieren. </li><li> Laufabschnitt 5, um die Bildsegmentierung der xz-Querschnittsbilder von dem interessierenden Bereich zu optimieren. Figur 500, durch das Programm erzeugt wird, erscheint die Anzeige drei verschiedene Arten von Kontrast. Der Erfolg des Algorithmus, um die Grenzen der Zelle zu finden, ist abhängig von einer Kombination der Maske verwendet, und der Wert der &quot;Schwellenwert&quot; in Zeile 229 des Programms. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5. Stellen Sie den Wert der Schwelle, und wiederholen Sie diesen Abschnitt des Programms, bis die richtige Gliederung in eine der Spalten erreicht. </li><li> Wenn die Gliederung besten in Spalte 1 war, verwenden Sie Abschnitt 6, um die Lautstärke zu bestimmen, unter Verwendung von DIC Bildsegmentierung. Wenn Spalte 2 gab optimale Ergebnisse laufen Abschnitt 7 zu Zellvolumen von Hilbert-transformierten DIC Bildern zu bestimmen. Wenn Spalte 3 GAVe die optimalen Ergebnisse, Abschnitt 8 laufen, um die Lautstärke zu bestimmen, mit Fourier-gefilterten Hilbert-transformierten DIC Bilder. </li><li> Das gemessene Volumen der Probe in Kubik um (fl) gemeldet wird im Titel von Fig. 600, 700 oder 800 von dem Programm in Abhängigkeit von dem Volumenmessung gewählt hergestellt vorgestellt. </li></ol> 6. Massenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die NIQPM MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des NIQPM Programm, aktualisieren Sie die Lage der drei Verzeichnisse benötigt, um das Programm auszuführen. Dies sind die &quot;dependencies_directory&quot;, die &quot;brightfield_directory&quot; und die &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 1. Dieser Codeabschnitt erzeugt ein helles Feld Bild Würfel des vollen Feld der gesamte Satz von Bildern. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 2. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define NIQPM Parameter&quot; wird angezeigt. Vier Zahlen sind für den Benutzer erforderlich: Anzahl der Brennebene, wo das helle Feld Bild desProbe im Fokus, laterale Auflösung (um / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist für die Bildaufnahme 0,1 in 0,1 Schritten um axial) und die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite ein Box, die später erscheinen werden - ein typischer Wert ist 200. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben Hellfeld-Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. <ol><li> Wenn das Bild nicht fokussiert ist, doppelklicken Sie in der blauen Box und erneut Abschnitt 2, achten Sie darauf, um die Brennebene Nummer im Dialogfeld einstellen. </li><li> Wenn das Bild scharf ist, ziehen Sie den blauen Kasten um das Bild und Größe ändern, indem Sie die Knoten der Box und ziehen Sie diese gegebenenfalls. Positionieren Sie den Rahmen um das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Doppelklicken Sie in der Box, es zu akzeptieren. </li></ol></li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 3, einen Stapel von Hellfeld-Bilder zu konstruieren abgeschnitten, um in der RegionInteresse. </li><li> Um die Phasenkarte, Pseudobild DIC, und Vergleiche mit Hellfeld-Bildern und dem wahren Bild DIC generieren, führen Sie Abschnitt 4. </li><li> Mit der Pseudo DIC und wahre DIC Bilder so ähnlich wie möglich der Massendichte Karte, Gesamtmasse und Histogramm der Zelldichte kann durch Ausführen von § 5a oder 5b bestimmt werden. § 5a führt automatische Erkennung der Grenze des Feldes - optimieren &quot;Schwelle&quot; in Zeile 300 - typische Werte liegen zwischen 0,1-1. Führen Sie erneut diesen Abschnitt wie notwendig, um den Wert der Schwelle zu optimieren. 5b führt Massenbestimmung usw., nachdem der Benutzer den interessierenden Zelle skizziert. </li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen in der vorliegenden Arbeit.

Im allgemeinen ist NIQPM ein beugungsbegrenzter Technik auf optische Weglängen zwischen 0,25-44,7 validiert. Validierung auf n = 1.596 durchgeführt Polystyrolkugeln im Durchmesserbereich von 0,11 bis 9,8 &amp;mgr; m in Fluoromount G suspendiert (Daten nicht gezeigt). Zellen besitzen optischen Weglängen, die von fast 0-7 liegen. Bei der Messung der Dichteverteilung einer Probe kann man feststellen, dass die Pseudo-Bild DIC sieht gut aus, während die Dichtekarte besitzt unerwünschte Hintergrun...

Die Verwendung optischer Mikroskopie ist nun überall in der Untersuchung von zellulären Organismen. Aufgrund ihrer geringen endogenen Absorption und schwache Streueigenschaften über den sichtbaren Lichtspektrum, ich Zellen nicht stark auf die Amplitude der Lichtwellen durchqueren sie und erscheinen halbtransparent, wenn sie mit Standard-Hellfeld-Mikroskop abgebildet. Zellproben haben jedoch verlangsamen optischen Wellen, die sich durch sie in einer Weise, die linear zur Höhe der lokalen Massendichte in einem bestimmten Raumbereich, durch den das Licht in Beziehung steht. Die Nutzung dieser heterogenen Zeitverzögerung oder &quot;Phase&quot;-Profil von optischen Wellen durch mikroskopische Präparate übertragen wurde erstmals 1935 von Frits Zernike 1 beschrieben und experimentell durch Zernikein 1942 2 realisiert. Zernike den Nobelpreis im Jahr 1953 für diese Leistung ausgezeichnet. Zeiss kommerzialisiert dieses Instrument im Jahr 1945 3. Im Jahr 1955, Smith und Nomarskich würde ihre ersten Arbeiten über die Verwendung 4 und 5 von Theorie Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, eine Modalität, die die räumliche Gradienten von Phase als Kontrastmechanismus verwendet zu präsentieren. DIC wurde von Zeiss in 1965in enger Zusammenarbeit mit Nomarski 6 kommerzialisiert. Im Jahr 1981 zeigten zwei Labors die erste aufgezeichnete Live-Cell-DIC Bilder mit dem Einbau von Videokameras in die Optik Zug der DIC-Mikroskop 7, 8. Die Ära der Live Cell Imaging war geboren. Seit dieser Zeit hat sich die Ausführung der beiden Phasenkontrast und DIC auf kommerziellen Mikroskope weitgehend unverändert geblieben. Diese Methoden werden hauptsächlich von Biologen genutzt werden, um Bilder von Zellen für qualitative Zwecke zu produzieren: Überwachung der Morphologie, Tracking subzellulärer Strukturen, und Untersuchungen von Membrandynamik 9. Diese Techniken sind in ihrer qualitativen &quot;off-the-shelf&quot;-Konfiguration und Phase DIC lassen sich beliebige Funktionen der Intensität der Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik Einstellungen und CCD-Kamera Verstärkung, Gamma-und Belichtungseinstellungen. Eine kleine Legion von Physikern und Ingenieuren optischen hat sich bemüht, zu kommerziellen bildgebenden Verfahren quantitativ. Zu den ersten Bemühungen waren zwei Briefe an die Natur in 1952 und 1953, in denen der Arzt-turned-Biophysiker Robert Barer demonstriert die Verwendung von Phasenmikroskopie, um Zelltrockenmasse von Zellen durch Schätzung Phasenverschiebungen durch diesen Zelltypen mit einem handelsüblichen Phasen Mikroskop bestimmen 10, 11. Phasenmikroskopie 10,11, DIC-Mikroskopie 12-17, 18-22 und Hellfeld auf optische Weglänge, Phase, Masse zu bestimmen: Das Feld hat eine Vielzahl von Techniken in den folgenden Jahren auf Basis drei Grundmarkierungsfreie Kontrastmechanismen entwickelt Dichte, Brechungsindex, und Zellvolumen. In Abs.llel, eine große Sammlung von kundenspezifischen optischen Instrumenten wurden auch seit den 1950er Jahren entwickelt worden und haben weitreichende optische Messungen im Bereich von Anwendungen in der Parasitenwachstum 23, zu dokumentieren, die den Zellzyklus 24 bis sucht Membrandynamik der roten Blutzellen 25. Insbesondere hat die vergangenen zehn Jahren eine Fülle von kennzeichnungsfreien quantitativen Mikroskopie in Form von Beugungsphasenmikroskopie 26, 27 tomographischen Phasenmikroskopie, digitale holographische Mikroskopie 28, phasensensitive optische Kohärenzmikroskopie 29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie 30. Hilbert gesehen Phasenmikroskopie 31 und quantitative Phasenmikroskopie 32. Trotz ihrer gemeinsamen Erfolge, haben diese Instrumente nicht zu den größeren Bereich der biologischen Forscher durch, meist, um ihre komplexen Mess-und Rechenanforderungen verbreitet. Hier beschreiben wir dEscribe die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und DIC Bildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Zugänglichkeit. Die für die erfolgreiche Ausführung erforderlich Abbildungsbedingungen sind im Rahmen des normalen Betriebs der meisten kommerziell erhältlichen Mikroskope. Darüber hinaus sind die Post-Processing-Algorithmen stabil, schnell und robust - worden in MATLAB mit Hilfe von schnellen Fourier-Transformation (FFT) basierte Algorithmen, wann immer möglich umgesetzt. NIQPM ist eine Methode zur Phasen-und den axial integriert Massendichte cel rekonstruierenzellulären Proben von Hellfeld-Bilder. Summation dieser axial integrierten Massendichte über die Fläche der Probe gibt die Gesamttrockenmassegehalt der Probe. , In dem sie gezeigt werden, dass die Phasenprofil einer Zelle konnte von durch-Fokus-Hellfeldbildern der Probe rekonstruiert werden - - Die NIQPM Protokoll basiert auf den experimentellen Grundlagen von Paganin und Nugent 18, 19 aufgestellt hat und die theoretische Arbeit von Frank , Altmeyer und Wernicke 20 - auf die Lösung der paraxialen Wellen Modelle in einer effizienten FFT-basierte Weise. Die Verbindung der Phase auf die Trockenmasse Dichte beruht auf der Arbeit von Barer 10, 11 und 33 Popescu basiert. Volumen Informationen können durch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Beleuchtungsbedingungen, die optische Schnitte der Probe entlang der optischen Achse zu ermöglichen, erhalten werden. Hilbert-Transformation Verarbeitung der DIC-Bildstapeln stark erhöhtRanderfassungsalgorithmen zur Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Diese Arbeit stammt mit Arinson et al. 34. obwohl wir beide Fourier-Filter-Methoden eingeführt, um den Kontrast und einen Sobel-Kantenerkennung basierend Verfahren zur automatischen Volumen Analyse der Probe zu verbessern. Wir haben auch bestätigt HTDIC vorher für Polystyrolkugeln in der Größe von der Beugungsgrenze von bis zu 20 um Durchmesser 36. Während sowohl NIQPM und HTDIC technologisch erreichbar aufgrund ihrer Entwicklung zu kommerziellen Mikroskope sind die Verfahren im wesentlichen durch die Hardware-Konfiguration der Mikroskope selbst begrenzt. Die primären Grenzen dieser Techniken sind zweifach: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf kommerziellen Bereiche, die durch Übersetzung der gesamten Probenbühne im Gegensatz zu nur die ObjektivlinseBegrenzt gegenwärtig die Untersuchung von Phänomenen schneller als etwa 1 Bild / min und zweitens Beugungseffekte begrenzen die Nützlichkeit NIQPM und HTDIC auf Objekte in der Größe von 0,2 bis 10 und 20 um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden auf typische &quot;off-the-shelf&quot; Instrumente zu ermöglichen. Spannend, die meisten festen zellulären Proben leicht mit diesen Methoden untersucht. Eine Übersicht über den NIQPM und HTDIC Protokolle sind in Fig. 1 angegeben. In Abbildung 2 veranschaulichen wir optimale und suboptimale Durch Schwerpunkt Bildgebung unter niedrigen und hohen NA Beleuchtungsbedingungen sowohl für Hellfeld-und DIC-Bilder. Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus auf der erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen. <strong&gt; 5 veranschaulicht die Schritte in der HTDIC Bildverarbeitungs-Algorithmus beteiligt und zeigt die optimale Implementierung des Algorithmus, um Zellvolumen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Deutschland</td><td>Axio Imager D2</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Grünfilter (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Grünfilter</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>Bildaufnahmesoftware</td></tr><tr><td>Polystyrol Mikrosphären</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Polystyrol-Kugeln</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Eindeckmedien</td></tr></tbody></table>

quantitative optische mikroskopie: messung der cellular biophysikalische eigenschaften mit einem standard optisches mikroskop

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Wir beschreiben die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und Differentialinterferenzkontrastbildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. NIQPM auf einem vereinfachten Modell der Wellenausbreitung auf der Basis, der sogenannten paraxialen Näherung mit drei zugrunde liegenden Annahmen: niedriger numerischer Apertur (NA) Beleuchtung, Schwach Streuung, und schwache Lichtabsorption durch die Probe. Glücklicherweise ungefärbten zellulären Proben erfüllen diese Annahmen und niedrigen NA Beleuchtung ist leicht zu kommerziellen Mikroskopen erreicht. HTDIC wird verwendet, um Informationen von Volumendurch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Aufhellung erhaltenation Bedingungen. Hohe NA Beleuchtung ermöglicht verbesserte Schneide der Probe entlang der optischen Achse. Hilbert-Transformationsverarbeitung auf der DIC Bildstapeln stark erhöht Kantenerkennungsalgorithmen für die Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Erreichbarkeit mit &quot;off-the-shelf&quot;-Mikroskope. Es gibt zwei grundlegende Einschränkungen dieser Methoden: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf gewerbliche Bereiche hebt derzeit die Untersuchung von Phänomenen schneller als 1 Bild / Minute, und zweitens, Beugungseffekte beschränken den Nutzen der NIQPM und HTDIC, um Objekte von 0,2 bis zu 10 (NIQPM) und 20 (HTDIC) um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden zu ermöglichen. Aufregend, die meisten Fest cellular Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.

Korrekte Probenbeleuchtung während durch Fokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung des NIQPM nd HTDIC Algorithmen. In Abbildung 2 veranschaulichen wir niedrigen und hohen NA Beleuchtung sowohl unter DIC und Hellfeld-Kontrast für eine Polystyrol-Kugel und der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW620. Fig. 2A, 2C, 2I, 2K und demonstrieren eine optimale Bildgebung für NIQPM. 2F, 2H, 2N und 2P demonstrieren optimale B...

Wir beschreiben die Verwendung eines Standard-Lichtmikroskops, um quantitative Messungen der zellulären Masse, des Volumens und der Dichte durch eine Kombination von Hellfeld- und differentiellen Interferenzkontrastbildern durchzuführen.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, grundlegende physikalische Merkmale von Zellproben, einschließlich Masse und Volumen, mit einem Standard-Lichtmikroskop und Bildverarbeitung zu quantifizieren. Dazu werden zunächst Zellproben, die auf Deckgläsern gezüchtet wurden, auf Objektträger montiert. Anschließend werden Aufnahmen im Durchlichtverfahren mit Fokusserie sowie differentieller Interferenzkontrastbilder aufgenommen.Dann wird jeder Z-Stack von Bildern in separate MATLAB-Bildverarbeitungsprogramme eingegeben, die die physikalischen Daten extrahieren. Letztendlich werden die grundlegenden physikalischen Eigenschaften zellulärer Proben mittels Intensitätsmessungen über den Fokus hinweg unter Hellfeldkontrast und Differentialinterferenzkontrastmikroskopie ermittelt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass zelluläre Proben nicht fixiert, permeabilisiert oder gefärbt werden müssen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie beantworten, beispielsweise wie die subzelluläre Dichte während des Zellzyklus oder unter verschiedenen Zellpopulationen, die zu einem Krankheitszustand beitragen, organisiert ist. Beginnen Sie unter Verwendung eines Mikroskops mit sowohl DIC- als auch Hellfeld-Funktion und weiteren Spezifikationen gemäß dem Textprotokoll damit, die Slide-Book-Software zu öffnen und eine neue Folie für die Bildaufnahme anzulegen. Öffnen Sie anschließend das Fokusfenster und wählen im Bereich „Filter Set“ die Option DIC aus. Passen Sie auf der Registerkarte „Scope“ im Bereich „Condenser“ den Blendenregler auf die äußerste rechte Position an. Dadurch wird eine Beleuchtung mit hoher numerischer Apertur bereitgestellt und die optische Schichtung der Probe verbessert.Nachdem ein DIC-Stapel der Probe aufgenommen wurde, öffnen Sie das Fokusfenster und wählen Sie „Öffnen“. Stellen Sie im Bereich „Filter Set“ den Blendenregler ganz nach links bis zum Anschlag geschlossen, um eine Beleuchtung mit niedriger numerischer Apertur (NA) zu gewährleisten. Nach der Anpassung der Signalintensität öffnen Sie das Fenster zur Bildaufnahme.Die 3D-Aufnahmeeinstellungen aus der DICZ-Stapel-Aufnahme werden im Filtersatzbereich des Bildaufnahmefensters angezeigt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen und geben Sie die Belichtungszeit an. Benennen Sie im Bereich Bildinformationen das Bild und wählen Sie „Start“, um die Zack-Bildaufnahme zu beginnen.Exportieren Sie dann die Z-Stapel gemäß dem Textprotokoll, um Volumenmessungen im H-T-D-I-C-MATLAB-Programm mit dem Titel JoVE HT DCO V one M unter Abschnitt null durchzuführen. Aktualisieren Sie die Verzeichnisvariable für Abhängigkeiten, indem Sie das Verzeichnis kopieren und einfügen, das die Dateien hilbert.Transform DM und sobel edge Detect M aus Explorer enthält. Führen Sie zwischen den einfachen Anführungszeichen nach „Abhängigkeitsverzeichnis =“ den Abschnitt null des joco HT DCO V one M-Programms aus.Im ersten Abschnitt aktualisieren Sie das Bilder-Verzeichnis, indem Sie das Verzeichnis mit den durch Fokus-Bildern im Format .TIF kopieren und einfügen. Führen Sie diesen Abschnitt nur einmal zwischen den einfachen Anführungszeichen aus, um die Bilder auszurichten und zu drehen. Führen Sie für die Hilbert-Transformation Abschnitt zwei des Codes aus. Ein Dialogfeld mit dem Titel HT DIC-Parameter definieren wird angezeigt.Geben Sie dann die Fokalebene-Nummer ein, bei der das DIC-Bild der Probe scharf ist, die laterale Auflösung, die axiale Auflösung, den Drehwinkel des DIC-Bildes, der für die Durchführung der Hilbert-Transformation benötigt wird, und schließlich die Größe des interessierenden Bereichs. Klicken Sie dann auf „Okay“. Ein Bild der durch die Fokalebene-Nummer angegebenen DIC-Fokalebene erscheint mit einem blauen Kasten.Platzieren Sie das Kästchen über dem gewünschten Merkmal, beispielsweise einer Zelle. Sobald das Kästchen über dem gewünschten Bereich positioniert ist, doppelklicken Sie innerhalb des B. Der Kontrast des Bildes sollte so eingestellt sein, dass dunkle Strukturen links erscheinen, während helle Strukturen rechts erscheinen. Ziehen Sie das blaue Kästchen über den interessierenden Bereich und passen Sie gegebenenfalls seine Form an.Danach, im Abschnitt drei, um eine rechteckige Maske zu erzeugen, heben Sie die Auskommentierung der Zeile 1 6 7 auf und kommentieren Sie Zeile 1 7 0 aus. Führen Sie Abschnitt drei des Programms aus, indem Sie auf das Bild klicken und die Maus ziehen, um die rechteckige Maske zu definieren. Doppelklicken Sie anschließend auf das Feld, um diese zu bestätigen. Um eine frei gezeichnete Maske zu erzeugen, kommentieren Sie Zeile 1 6 7 aus und heben Sie die Auskommentierung von Zeile 1 7 0 auf, bevor Sie Abschnitt drei ausführen. Klicken und zeichnen Sie mit der Maus die gewünschte Maske, und doppelklicken Sie nach dem Zeichnen auf die Maske, um sie zu akzeptieren. Nach Ausführung von Abschnitt vier führen Sie Abschnitt fünf aus, um die nach dem Textprotokoll beschriebenen Hilbert-transformierten Bildstapel zu erstellen.Um die Bildsegmentierung der xz-Schnittbilder des interessierenden Bereichs zu optimieren. Die vom Programm erzeugte Abbildung 500 erscheint mit drei verschiedenen Kontrasttypen. Der Erfolg des Algorithmus bei der Erkennung der Zellgrenzen hängt von einer Kombination aus der verwendeten Maske und dem Schwellenwert in Zeile 2, 2, 9 des Programms ab. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5 und passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie diesen Programmbereich erneut ausführen, bis eine geeignete Umrandung in einer der Spalten erreicht ist.Wenn die Umrisserkennung in Spalte eins am besten war, verwenden Sie Abschnitt sechs, um das Volumen in der DIC-Segmentierung zu bestimmen. Wenn Spalte zwei optimale Ergebnisse lieferte, führen Sie Abschnitt sieben aus, um das Zellvolumen aus der Hilbert-transformierten DIC-Bildgebung zu ermitteln. Falls Spalte drei die besten Ergebnisse zeigte, verwenden Sie die vorab gefilterte Hilbert-transformierte DIC-Bildgebung und führen Sie Abschnitt acht aus, um das Volumen zur Bestimmung der Masse im NIQ PM MATLAB-Programm mit dem Titel JO VCO NI qpm V1 M unter Abschnitt null zu berechnen. Aktualisieren Sie den Speicherort der drei Verzeichnisabhängigkeiten, BRIGHTFIELD und DIC-Verzeichnis. Nachdem Sie Abschnitt eins ausgeführt haben, führen Sie Abschnitt zwei im Dialogfeld mit dem Titel „define N-I-Q-P-M parameters“ aus und geben Sie die Fokalebene-Nummer ein, in der das Hellfeldbild der Probe scharf ist, sowie die laterale Auflösung, die axiale Auflösung und die Größe des interessierenden Bereichs.Klicken Sie dann auf „Okay“. Ein Bild der durch die Fokusebenennummer festgelegten Hellfeld-Fokusebene wird mit einem blauen Kasten angezeigt. Nachdem ggf. die Fokussierung durch erneutes Ausführen von Abschnitt zwei angepasst wurde, ziehen Sie den Kasten um das Bild herum, wählen Sie die Knotpunkte des Kastens aus und ziehen Sie diese, um die Größe anzupassen, bevor Sie doppelt in den Kasten klicken, um die Auswahl zu bestätigen.Wenn ein Stapel von Hellfeldbildern durch Ausführen von Abschnitt drei erstellt wurde, führen Sie Abschnitt vier aus, um die Phasenkarte, Pseudo-DIC-Bilder und Vergleiche mit Hellfeldbildern sowie das echte DIC-Bild zu generieren. Wenn die Pseudo-DIC- und die echten DIC-Bilder so ähnlich wie möglich sind, führen Sie Abschnitt fünf A oder fünf B aus, die es dem Benutzer ermöglichen, die Zelle zu umreißen, um die Massendichtekarte, die Gesamtmasse und das Histogramm der korrekten Zelldichte zu erzeugen. Die Beleuchtung der Probe während der Aufnahme von Fokusdurchlaufbildern ist entscheidend für die erfolgreiche Durchführung des N-I-Q-P-M- und H-T-D-I-C-Algorithmus. Diese Abbildung zeigt Beleuchtung mit niedriger und hoher NA sowohl unter DIC- als auch unter Hellfeldkontrast für eine Polystyrolkugel und die humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie SW six 20.Diese Bilder zeigen die optimale Bildgebung für N-I-Q-P-M und diese zeigen die optimale Bildgebung für HT DIC. Diese Aufnahmen veranschaulichen die Parameterabhängigkeit des NIQ-PM-Algorithmus und verdeutlichen sowohl erfolgreiche als auch nicht erfolgreiche Implementierungen. Hier untersuchen wir das Phasenprofil einer Polystyrolkugel mit einem Durchmesser von 4,8 µm.Das erwartete Profil ist theoretisch bekannt und kann daher direkt mit der NIQ-PM-Rekonstruktion verglichen werden. Diese Abbildungen zeigen die bestmögliche Rekonstruktion, die für die Beugungseffekte an der Kugel erreichbar ist; jedoch verhindern Effekte sowohl an den Grenzen der Kugel als auch im Inneren eine stabile Rekonstruktion an allen Punkten der Kugel. Der zentrale Bereich der Kugel kann mittels N-I-Q-P-M mit einem prozentualen Fehler von ein bis 5 % erfasst werden, wie in Abbildung L zu sehen ist, zelluläre Proben, deren Phaseneigenschaften nicht bekannt sind.A priori kann unter Verwendung von NIQ PMM in Verbindung mit einem Verfahren zur Vergleichung eines Pseudo-DIC-Bildes mit einem tatsächlichen DIC-Bild rekonstruiert werden. N-I-Q-P-M weist einen freien Parameter auf: die Ebene im rechten Feldbild-Stack, in der die Berechnung zentriert ist.Diese zentrale Fokusebene sollte so lange angepasst werden, bis die Pseudo-DIC- und die echte DIC-Bilder so ähnlich wie möglich erscheinen. Dargestellt sind hier ein unscharfes Pseudo-DIC-Bild, ein optimales Pseudo-DIC-Bild und das entsprechende DIC-Bild der Zelle, aufgenommen mit einer Beleuchtungs-NA von 0,9. Interessanterweise entsprechen das beste Phasenbild und das zugehörige Pseudo-DIC-Bild nicht notwendigerweise einem scharfen Hellfeldbild, wie in diesen Darstellungen gezeigt.Als Letztes sind hier die Schritte des H-T-D-I-C-Bildverarbeitungsalgorithmus dargestellt, beginnend mit der DIC-Bildgebung durch Fokus unter NA = 0,9 Beleuchtung. Die Hilbert-Transformation wird durchgeführt, um das Grundrelief der DIC-Bilder zu entfernen. Dies führt zu einer leichten Unschärfe entlang der optischen Achse, die mithilfe eines Hochpass-Vorwärtsfilters beseitigt werden kann. Diese endgültigen Bilder lassen sich leicht segmentieren, um die Fläche in jeder Querschnittsebene der Probe zu bestimmen und daraus das gesamte zelluläre Volumen abzuleiten.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die korrekte Beleuchtung für die Hellfeld- oder Differenzialkontrast-Aufnahme nach diesem Verfahren zu beachten. Andere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen mittels der Kolokalisation von Bodenkraft mit Dichtekarten der Probe zu beantworten.

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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