Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, grundlegende physikalische Merkmale von zellulären Proben, einschließlich Masse und Volumen, mit einem Standard-Lichtmikroskop und Bildverarbeitung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst zelluläre Proben, die auf gläsernen Deckgläsern gezüchtet wurden, auf Objektträger montiert werden. Als nächstes werden durch Fokus, Hellfeld und differentielle Interferenz Kontrastbilder erhalten.

Dann wird jeder Z-Stapel von Bildern in separate MATLAB-Bildverarbeitungsprogramme eingegeben, die die physischen Daten extrahieren. Letztendlich werden die grundlegenden physikalischen Eigenschaften zellulärer Proben durch Fokusintensitätsmessungen, unter Hellfeldkontrast und differentielle Interferenzkontrastmikroskopie ermittelt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass zelluläre Proben nicht fixiert, durchdrungen oder gefärbt werden müssen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie die subzelluläre Dichte während des Zellzyklus organisiert ist oder wie verschiedene Zellpopulationen zu einem Krankheitszustand beitragen. Die Verwendung eines Mikroskops mit DIC- und Hellfeldfunktionen und zusätzlichen Spezifikationen gemäß dem Textprotokoll beginnt mit dem Öffnen der Diabuch-Software und der Erstellung eines neuen Objektträgers für die Bildsammlung. Öffnen Sie als Nächstes das Fokusfenster und wählen Sie im Abschnitt Filtersatz DIC aus. Stellen Sie auf der Registerkarte "Oszilloskop" unter dem Kondensorbereich den Schieberegler der Blende auf die äußerste rechte Position ein. Dies sorgt für eine Beleuchtung mit hoher numerischer Apertur und verbessert die optische Schnittbildung der Probe.

Nachdem Sie einen DIC-Stack des Samples aufgenommen haben, öffnen Sie das Fokusfenster und wählen Sie Öffnen. Stellen Sie den Schieberegler unter dem Filtersatz auf die äußerste linke Position ein, die ganz geschlossen ist, um eine Beleuchtung bei niedrigem NA-Wert zu erzielen. Öffnen Sie nach dem Einstellen der Signalintensität das Bildaufnahmefenster.

Die 3D-Erfassungseinstellungen aus der DICZ-Stapelerfassung werden im Abschnitt "Filtersatz" des Bildaufnahmefensters angezeigt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Öffnen und geben Sie die Belichtungszeit an. Benennen Sie das Bild im Abschnitt "Bildinformationen" und wählen Sie "Start" aus, um die Zack-Bildaufnahme zu starten.

Exportieren Sie dann die Z-Stacks gemäß dem Textprotokoll, um Volumenmessungen einmalig im H-T-D-I-C MATLAB-Programm mit dem Titel JoVE HT DCO V one M durchzuführen. Aktualisieren Sie unter Abschnitt Null die Verzeichnisvariable dependencies, indem Sie das Verzeichnis, das den Hilbert enthält, kopieren und einfügen. Transformieren Sie DM und Sobel Edge Erkennen Sie M-Dateien aus dem Explorer. Zwischen den einfachen Anführungszeichen folgt dependencies directory equals execute section zero des joco HT DCO V one M Programms.

Aktualisieren Sie im ersten Abschnitt das Bildverzeichnis, indem Sie das Verzeichnis kopieren und einfügen, das die Through-Focus-Bilder im Punkt-TIF-Format enthält. Zwischen den einfachen Anführungszeichen führen Sie diesen Abschnitt nur einmal aus, um Bilder auszurichten und zu drehen. Führen Sie für hilbert transform den zweiten Abschnitt des Codes aus Ein Dialogfeld mit dem Titel HT-DIC-Parameter definieren wird angezeigt.

Geben Sie dann die Nummer der Brennebene ein, in der das DIC-Bild der Probe scharf ist, die laterale Auflösung, die axiale Auflösung, den Rotationswinkel des DIC-Bildes, der für die Durchführung der Hilbert-Transformation erforderlich ist, und schließlich die Größe des interessierenden Bereichs. Klicken Sie dann auf OK. Ein Bild der DIC-Fokusebene, die durch die Nummer der Fokusebene angegeben wird, wird mit einem blauen Feld angezeigt.

Positionieren Sie den Quader über dem interessierenden Feature, z. B. einer Zelle. Sobald der Rahmen über dem gewünschten Bereich positioniert wurde, doppelklicken Sie in das B.Der Kontrast des Bildes sollte so sein, dass auf der linken Seite dunkle Merkmale und auf der rechten Seite helle Merkmale erscheinen. Ziehen Sie das blaue Feld über den gewünschten Bereich, und ändern Sie die Form nach Bedarf.

Als nächstes, unter Abschnitt drei, um eine rechteckige Maske zu erzeugen, kommentieren Sie Zeile 1 6 7 und kommentieren Sie Zeile 1 7 0 führen Sie Abschnitt drei des Programms aus, indem Sie in das Bild klicken und die Maus ziehen, um mit der Definition der rechteckigen Maske zu beginnen. Doppelklicken Sie dann auf das Kästchen, um es zu übernehmen. Um eine handgezeichnete Maske zu erzeugen, kommentieren Sie Zeile 1 6 7 und kommentieren Sie Zeile 1 7 0 aus, bevor Sie den dritten Abschnitt ausführen. Indem Sie die gewünschte Maske anklicken und mit der Maus zeichnen, doppelklicken Sie auf die Maske, um sie nach dem Ausführen des vierten Abschnitts zu übernehmen, um hilbert-transformierte Bildstapel gemäß dem Textprotokoll zu erstellen, führt Abschnitt fünf aus.

Optimierung der Bildsegmentierung der xz-Querschnittsbilder des interessierenden Bereichs. Die vom Programm erzeugte Figur 500 wird angezeigt und zeigt drei verschiedene Arten von Kontrast. Der Erfolg des Algorithmus, die Ränder der Zelle zu finden, hängt von einer Kombination aus der verwendeten Maske und dem Wert des Schwellenwerts in den Zeilen 2, 2, 9 des Programms ab: Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5 und passen Sie den Wert des Schwellenwerts an und führen Sie diesen Abschnitt des Programms erneut aus, bis die richtige Gliederung in einer der Spalten erreicht ist.

Wenn die Gliederung in Spalte eins am besten war, verwenden Sie in der DIC-Segmentierung Abschnitt sechs, um das Volumen zu bestimmen. Wenn Spalte zwei optimale Ergebnisse lieferte, führen Sie Abschnitt sieben aus, um das Zellvolumen aus Hilbert zu bestimmen, transformieren Sie DIC-Bilder Wenn Spalte drei die optimalen Ergebnisse lieferte, verwenden Sie forer gefilterte Hilbert-Transformations-DIC-Bilder, während Sie Abschnitt acht ausführten, um das Volumen für Massenmessungen im NIQ PM MATLAB-Programm zu bestimmen und JO VCO NI qpm V1 M Unter Abschnitt Null zu betiteln. Aktualisieren Sie den Speicherort der drei Verzeichnisabhängigkeiten, des Verzeichnisses BRIGHTFIELD und DIC, nachdem Sie den ersten Abschnitt ausgeführt haben, führen Sie den zweiten Abschnitt im Dialogfeld mit dem Titel N-I-Q-P-M-Parameter definieren aus. Geben Sie die Nummer der Brennebene ein, in der das Hellfeldbild der Probe scharf ist, die laterale Auflösung, die axiale Auflösung und die Größe des interessierenden Bereichs.

Klicken Sie dann auf OK. Ein Bild der Hellfeld-Fokusebene, die durch die Nummer der Fokusebene angegeben wird, wird mit einem blauen Feld angezeigt. Nachdem Sie den Fokus bei Bedarf durch erneutes Ausführen des zweiten Abschnitts angepasst haben, ziehen Sie das Feld um das Bild herum, wählen Sie die Knoten des Feldes aus und ziehen Sie es, um die Größe zu ändern, bevor Sie in das Feld doppelklicken, um es zu übernehmen.

Sobald ein Stapel von Hellfeldbildern durch Ausführen von Abschnitt drei erstellt wurde, führen Sie Abschnitt vier aus, um die Phasenkarte, Pseudo-DIC-Bilder und Vergleiche mit Hellfeldbildern und dem echten DIC-Bild zu generieren, wenn die Pseudo-DIC- und echten DIC-Bilder so ähnlich wie möglich sind, führen Sie Abschnitt fünf A oder fünf B aus, der es dem Benutzer ermöglicht, die Zelle zu umreißen und die Massendichtekarte zu erstellen. Die Gesamtmasse und das Histogramm der Zelldichte sind korrekt. Die Probenbeleuchtung während der Durchfokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Implementierung des N-I-Q-P-M- und H-T-D-I-C-Algorithmus. Diese Abbildung zeigt eine niedrige und hohe NA-Beleuchtung sowohl unter DIC als auch unter Hellfeldkontrast für eine Polystyrolkugel und die humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie SW six 20.

Diese Panels zeigen eine optimale Bildgebung für N-I-Q-P-M und diese zeigen eine optimale Bildgebung für HT DIC. Diese Bilder zeigen die Parameterabhängigkeit des NIQ PM-Algorithmus und zeigen sowohl erfolgreiche als auch erfolglose Implementierungen auf. Hier untersuchen wir das Phasenprofil einer Polystyrolkugel mit einem Durchmesser von 4,8 Mikrometern.

Das zu erwartende Profil ist theoretisch bekannt und kann somit direkt mit der NIQ PM-Rekonstruktion verglichen werden. Diese Platten stellen die beste Rekonstruktion dar, die für die Kugelbeugungseffekte sowohl an den Rändern der Kugel als auch im Inneren erzielt werden kann, und verhindern eine stabile Rekonstruktion an allen Punkten der Kugel. Der zentrale Bereich der Kugel kann mit N-I-Q-P-M mit einem prozentualen Fehler von eins bis 5 % erfasst werden, wie bei zellulären Proben von Panel L zu sehen ist, deren Phaseneigenschaften nicht bekannt sind.

A priori kann mit NIQ PMM in Verbindung mit einem Verfahren zum Vergleich eines Pseudo-DIC-Bildes mit einem tatsächlichen DIC-Bild rekonstruiert werden. N-I-Q-P-M hat einen freien Parameter. Die Ebene im rechten Bildstapel, auf der die Berechnung zentriert ist.

Diese zentrale Fokusebene sollte so lange angepasst werden, bis die Pseudo-DIC- und Echt-DIC-Bilder so ähnlich wie möglich aussehen. Vorgestellt werden ein unscharfes Pseudo-DIC-Bild, ein optimales Pseudo-DIC-Bild und das entsprechende DIC-Bild der Zelle, das mit einer Beleuchtung NA von 0,9 aufgenommen wurde. Interessanterweise entsprechen die beste Phasenkarte und das entsprechende Pseudo-DIC-Bild nicht unbedingt einem scharfen Hellfeldbild, wie es in diesen Panels gezeigt wird.

Zuletzt werden hier die Schritte gezeigt, die im Bildverarbeitungsalgorithmus H-T-D-I-C vom DIC durch Fokusbilder unter NA gleich 0,9 Beleuchtung erforderlich sind, die Hilbert-Transformation wird durchgeführt, um das Basisrelief der DIC-Bilder zu entfernen. Dies geht mit einigen Unschärfen entlang der optischen Achse einher, die von der Hochpassfilterung entfernt werden können. Diese endgültigen Bilder lassen sich leicht segmentieren, um die Fläche in jeder Querschnittsebene der Probe zu bestimmen und auf das gesamte Zellvolumen zu schließen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die richtige Beleuchtung für die Hellfeld-Differenzkontrast-Bildgebung nach diesem Verfahren zu erinnern. Andere Methoden, wie z.B. die Fluoreszenzmikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, indem die Bodenkraft mit Dichtekarten der Probe kolokalisiert wird.