Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in Drosophila Larven
7. Februar 2014
Drosophila-Larven sind eine attraktive Modellsystem für Live-Bildgebung aufgrund ihrer schein Kutikula und leistungsfähige Genetik. Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine Single-Layer-PDMS-Gerät, genannt die "Larve Chip" für die Live-Darstellung von zellulären Prozessen in Nervenzellen des 3. Larvenstadium Drosophila-Larven nutzen.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Drosophila-Larven für die Live-Bildgebung mit Hilfe einer modifizierten mikrofluidischen Kammer nicht-invasiv zu immobilisieren. Eine dritte in Sternlarven wird mit etwas Öl in den Span gelegt, um die Larven zu versiegeln. Als nächstes wird der Chip so auf die Larven gelegt, dass sein Körper in die Kammer passt.
Der Chip wird mit einer Spritze verbunden, so dass ein Vakuum angelegt werden kann. Die Beweglichkeit der Larven wird eingeschränkt und Strukturen im ventralen Teil des Tieres werden in die Nähe des Deckglases geschoben. Mit einem konfokalen Mikroskop lassen sich Strukturen leicht abbilden, wie z. B. die Details der sensorischen Axonendigungen von Neuronen und die Regeneration segmentaler Nerven nach induzierten Nervenschäden.
Andere Methoden zur Immobilisierung von Josepha für die Live-Bildgebung, riesige Chloroformether oder ISO-Anästhetika. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Menge solcher Toxine vermeidet, die die Physiologie des Tieres beeinträchtigen. Und ein zusätzlicher Vorteil der Abwesenheit von Toxinen besteht darin, dass die Larve GB sicher ist und mit der sie arbeiten kann. Die robuste Immobilisierung ermöglicht die Bildgebung schneller Ereignisse wie schnellerer axonaler Transport und Veränderungen des intrazellulären Kalziums.
Eine einzelne Larve kann im Chip mehrfach immobilisiert und abgebildet werden. Dies ermöglicht Zeitleben. Bildgebung von Prozessen, die über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden ablaufen Beginnen Sie mit der Entnahme eines Beispiel-PDMS-Chips, um dieses Protokoll auszuprobieren.
Anweisungen zur Herstellung von A-P-D-M-S-Chips aus einer SU-Achterform können im Textprotokoll mit einer 21-Gauge-Dosiernadel gelesen werden. Stechen Sie ein Loch in den Vakuumanschluss des PDMS-Chips für ein inverses Mikroskop. Entfernen Sie eine 23-Gauge-Nadel mit ein paar Drehungen von der Basis, der Lock-Nabe.
Führen Sie dann die Nadelspitze in ein kleines Stück Polyethylenschlauch ein, so dass der Schlauch mindestens einen Millimeter der Nadel bedeckt. Verwende eine Rasierklinge, um den überschüssigen Schlauch abzuschneiden. Übrig bleibt ein Kunststoffring, der eine Abdichtung herstellen kann.
Führen Sie die 23-Gauge-Nadelspitze in das Loch des Vakuumanschlusses ein. Für ein aufrechtes Mikroskop stechen Sie mit einer 21-Gauge-Dosiernadel ein zweites Loch in die Seite des PDMS-Chips. Dieses Loch ermöglicht den Zugang zum ersten Loch von der Seite.
Führen Sie dann die 23-Gauge-Nadelspitze und den Schlauchring in das Seitenloch ein. Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband über die Oberseite des PDMS-Chips, um das obere Loch abzudichten. Befestigen Sie einen 20 Zentimeter langen Polyethylenschlauch zwischen der Nadelspitze, die am Vakuumanschluss des Chips eingeführt wird, und einem der Anschlüsse eines Dreiwegeventils.
Stecken Sie dann eine 20-Milliliter-Spritze in einen der beiden verbleibenden Anschlüsse des Ventils, wobei Sie den letzten Anschluss offen lassen. Reinigen Sie den PDMS-Chip mit transparentem Klebeband. Befestigen Sie ein Stück Klebeband an der Unterseite des Chips.
Stellen Sie sicher, dass das Klebeband die gesamte PDMS-Oberfläche berührt, und ziehen Sie dann das Klebeband ab. Wiederholen Sie diese Reinigungsmethode dreimal. Da der PDMS-Chip wiederverwendbar ist, ist es sehr wichtig, Ölrückstände zu entfernen, da dies die Haftung von PDM auf Glas beeinträchtigen kann.
Dritte Larven aus dem Futter in eine Petrischale mit Wasser. Er muss zwischen 3,5 und vier Millimeter lang sein, damit der Chip richtig passt. Baden Sie die Larven, um das Nährmedium zu entfernen.
Als nächstes spielt ein kleiner Tropfen Halo Carbon 700 Öl in der Mitte eines Glasabdecks und nimmt mit einer Pinzette vorsichtig eine gewaschene Larve auf. Legen Sie es kurz auf ein leichtes Tuch, um es abzutrocknen, und legen Sie es dann 10 Sekunden lang in das Öl. Der Tropfen sollte klein genug sein, so dass die Luftröhre der Larven nicht bedeckt ist.
Legen Sie dann die Larven kurz auf ein sauberes Glasdeckglas und legen Sie es auf ein anderes Deckglas. Dadurch wird etwas mehr Öl entfernt. Achten Sie auf die Ausrichtung der Larven, um den Nervenmark und die segmentalen Nerven abzubilden.
Die Bauchseite sollte nach unten zeigen. Die leicht erkennbaren Trachealtuben sollten nach oben zeigen. Legen Sie nun den PDMS-Chip vorsichtig auf die Larven.
Richten Sie die Larven in der Mitte der Mikrokammer aus. Da die Larve mit dem Hinterteil zum Vakuumanschluss hin ausgerichtet ist, sollte sie die Ränder der Kammer nicht berühren. Schieben Sie nach dem Ausrichten den PDMS-Chip gegen den Glasdeckel, um eine gute Abdichtung zu erzielen.
Vergewissern Sie sich dann, dass die Larven vollständig in der Mikrokammer eingeschlossen sind. Schalten Sie nun das Dreiwegeventil auf die Spritze. Halten Sie die PDMS-Baugruppe fest und ziehen Sie den Spritzenkolben, um zwei bis 2,5 Millimeter Luft abzusaugen, bis ein Widerstand zu spüren ist.
So entsteht ein Vakuum. Schalten Sie dann das Ventil aus. Um das Vakuum sorgfältig aufrechtzuerhalten, überprüfen Sie die Larven.
Sein Körper sollte in der Mikrokammer immobilisiert sein und die Luftröhre sollte sichtbar sein. Der Rest des PDMS-Chips sollte in Kontakt mit dem Deckglas sein. Ausrichtungen wie diese sind nicht korrekt. Stellen Sie sich nun die Larven vor.
Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, befestigen Sie die Oberseite des Chips mit doppelseitigem Klebeband auf dem Tisch. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, lassen Sie das Vakuum los. Lösen Sie dann den PDMS-Chip vom Deckglas.
Die Larve sollte mit einer Pinzette sofort beweglich sein. Legen Sie die Larven zur Wiederherstellung auf eine Traubensaft-Agarplatte. Lege eine einzelne betäubte Larve auf eine Traubensaft-Agarplatte.
Drehen Sie unter dem Stereomikroskop das Tier mit der Bauchseite nach oben. Um den ventralen Nervenstrang und die Segmentnerven sichtbar zu machen, stellen Sie sicher, dass die Larve völlig unbeweglich ist. Lokalisieren Sie den Nervenstrang und die Speicheldrüsen.
Es ist wichtig, diese Strukturen nicht zu beschädigen. Lokalisieren Sie das Ende des dritten Bauchsegments. Verletzungen schädigen hier die meisten Nerven und sind am einfachsten zu reproduzieren, ohne das Tier zu töten.
Die Verletzung kann auch in den hinteren Segmenten mit einer Duo-Pinzette Nummer fünf durchgeführt werden. Kneifen Sie die Segmentnerven fünf bis 10 Sekunden lang fest durch die Nagelhaut. Bei richtiger Ausführung bleibt die Nagelhaut intakt und die Körperwand wird nicht durchstochen.
Die Meisterschaft wird geübt werden, nachdem die Verletzung das Tier mit der Bauchseite nach unten auf die große Platte gelegt hat. Er sollte in der Lage sein, seinen Kopf zu bewegen und zu fressen. War die Verletzung erfolgreich, dann wird die hintere Hälfte der Larven gelähmt.
Der Larvenchip wurde verwendet, um den Kinesin-vermittelten Transport von synaptischen Vesikeln innerhalb einzelner peripherer Axone abzubilden. Die enterologische Bewegung dieser Vesikel wurde mit etwa 1,0 Mikrometern pro Sekunde gemessen. Die retrograde Bewegung wurde mit 0,8 Mikrometern pro Sekunde getaktet.
Die Immobilisierungstechnik wurde für die Lasermikrochirurgie mit einem gepulsten UV-Farbstofflaser verwendet. Der Kalziumspiegel wurde dank eines genetisch kodierten Indikators in bestimmten Neuronen beobachtet. G-Lager 3.0 wird ein Kalzium-Spike nach einem sensorischen Neuron nachgewiesen.
Dendrit wird durchtrennt. Wenn sich das Tier zwischen den Bildgebungssitzungen ausruhen kann, können zelluläre Ereignisse im Laufe der Zeit beobachtet werden. Nach der Zerquetschung der Axone der emerischen Motoneuronen erfuhr der proximale Axonstumpf eine neue Keimung.
Währenddessen bildeten die distalen Axone Krampfadern und wurden durch den Prozess der Wallerschen Degeneration fragmentiert. Mit dem Larva-Chip ist es auch möglich, photokonvertierte fluoreszierende Proteine in vivo zu verfolgen. Ein DRA-2-Alpha-Tubulin-Fusionsprotein, das in sensorischen Neuronen der Klasse vier exprimiert wurde, wurde in den Zellkörpern photokonvertiert.
Innerhalb von zwei Tagen wurde eine signifikante Menge an photokonvertiertem Protein in die Axonendigungen der sensorischen Neuronen verlagert, die etwa einen Millimeter von der ursprünglichen Position im Zellkörper entfernt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Larvenchip für die Live-Bildgebung von Drosophila-Larven verwenden und wie Sie eine Nervenquetschverletzung durchführen. Sind diese Techniken beherrscht, können die Larven in nur wenigen Minuten am Mikroskop positioniert werden.
Genauso schnell ist der Nervenquetsch. Daher können diese Verfahren für groß angelegte Experimente, wie z. B. genetische Gradmessungen, verwendet werden. Der Chip kann verwendet werden, um Strukturen auf der ventralen Seite der Drosophila-Larven abzubilden.
Dazu gehören unter anderem Muskeln, Synapsen der neuromuskulären Verbindung, sensorische Neuronen, periphere Nerven und der ventrale Nervenstrang. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Live-Bildgebung des Larvenherzens, der Speicheldrüsen und der Luftröhre durchzuführen. Der Larvenchip, der in diesem Video verwendet wird, ist für Tiere mit einer Länge zwischen 3,5 und vier Millimetern ausgelegt.
Für die Bildgebung ist es kleiner oder größer, Tierchips mit einer kleineren oder größeren Kammer können problemlos hergestellt werden. Weitere Informationen finden Sie in der ergänzenden Designdatei und in der Anleitung zur Herstellung von PDMS-Chips. Eine Anleitung zur Herstellung der PDMS-Chips ist im schriftlichen Protokoll enthalten.
Wir können Ihnen einen Musterchip zusenden, wenn Sie sich mit uns in Verbindung setzen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur nicht-invasiven Immobilisierung von Drosophila-Larven für Live-Bildgebung unter Verwendung einer modifizierten mikrofluidischen Kammer. Die Technik ermöglicht die Beobachtung von zellulären Prozessen in Neuronen, insbesondere im Kontext des axonalen Transports und der Nervenregeneration.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Live-Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Drosophila-Larven sind aufgrund ihrer Transparenz und genetischen Zugänglichkeit ein wertvolles Modell für die Untersuchung neuronaler Prozesse.
- Live-Bildgebung kann Einblicke in dynamische zelluläre Ereignisse in Echtzeit geben.
- Traditionelle Methoden der Immobilisierung beinhalten oft schädliche Anästhetika, die die Physiologie beeinflussen können.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine sicherere Alternative für die Bildgebung ohne toxische Substanzen zu bieten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer nicht-invasiven Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven für die Bildgebung.
- Erleichterung der Beobachtung neuronaler Strukturen und Prozesse.
- Möglichkeit zur wiederholten Bildgebung derselben Larve über längere Zeiträume.
Verwendete Methoden
- Nutzung einer PDMS-Mikrofluidik-Vorrichtung zur Immobilisierung von Larven.
- Anwendung eines Vakuums zur Einschränkung der Larvenbeweglichkeit.
- Bildgebung mit einem Konfokalmikroskop zur Visualisierung neuronaler Strukturen.
- Detaillierte Vorbereitung des PDMS-Chips und Larvenpositionierung für optimale Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Immobilisierung von Larven ohne den Einsatz toxischer Anästhetika.
- Klare Bildgebung von sensorischen Neuronen-Axonterminals und segmentaler Nervenregeneration.
- Möglichkeit zur Durchführung von Time-Lapse-Bildgebung über 72 Stunden.
- Demonstration des kinesin-vermittelten Transports synaptischer Vesikel.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte mikrofluidische Kammer bietet eine sichere und effektive Methode für die Live-Bildgebung von Drosophila-Larven.
- Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung schneller neuronaler Ereignisse und Erholungsprozesse.
- Das Protokoll kann für verschiedene Bildgebungsanwendungen in der Neurowissenschaftsforschung angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Non-invasive immobilization of model organisms enables longitudinal imaging of dynamic cellular processes without pharmacological confounders, supporting mechanistic de-risking in target validation. The larva chip facilitates repeated imaging sessions over 72 hours, allowing assessment of axonal transport, injury responses, and regeneration in a physiologically relevant system. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native biology during observation of neuronal dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of axonal transport and calcium signaling in neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing repeated imaging of the same larva to assess target engagement and pathway modulation over time.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts of organelle trafficking and injury-induced responses, improving target confidence in neuroscience discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by immobilizing larvae for consistent, high-resolution imaging of ventral structures.
- Reproducibility: Enables standardized preparation and sealing of larvae in PDMS microchambers, reducing variability in live imaging assays.
- Scalability: Facilitates rapid immobilization and imaging cycles, supporting medium-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models axonal injury and regeneration processes relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery imaging with preclinical validation by enabling time-lapse studies of Wallerian degeneration and axonal sprouting.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying regenerative versus degenerative responses to nerve crush injury.
Pipeline & Workflow Integration
The larva chip integrates into early discovery workflows by enabling live imaging of neuronal processes prior to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in Drosophila-based models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through direct imaging of kinesin-mediated vesicle transport and calcium fluxes in sensory neurons.
- Screening: Delivers assay readiness via reproducible immobilization and ventral-side proximity to coverslip for consistent imaging.
- Analytics: Enables quantitative measurement of axonal transport rates (1.0 µm/s anterograde, 0.8 µm/s retrograde) and calcium spike detection using genetically encoded indicators.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal injury responses, including sprouting and fragmentation, over extended time courses.
- Enterprise Reuse: Positions the PDMS microfluidic chip as a reusable platform for longitudinal studies across multiple experimental sessions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling observation of rapid neuronal events without anesthetic-induced physiological disruption.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chip preparation, vacuum-based immobilization, and cleaning protocols to prevent oil residue interference.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by allowing repeated use of single larvae, reducing animal numbers needed for longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable imaging of degeneration and regeneration metrics post-injury.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, vacuum system operation, and confocal microscopy for optimal imaging.
- Depends on access to PDMS molding tools, syringe-based vacuum ports, and polyethylene tubing for sealing and fluidic connections.
- Necessitates cross-team standardization of larval preparation, oil application, and chamber alignment to ensure consistent immobilization.
- Involves adaptation considerations for different larval sizes, requiring chip dimension adjustments based on body length (3.5–4 mm for standard chip).
- Includes practical limitations such as the need to avoid tracheal oil coating and ensure proper ventral-side orientation for nerve cord visualization.
