Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in
7. Februar 2014
Drosophila-Larven sind eine attraktive Modellsystem für Live-Bildgebung aufgrund ihrer schein Kutikula und leistungsfähige Genetik. Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine Single-Layer-PDMS-Gerät, genannt die "Larve Chip" für die Live-Darstellung von zellulären Prozessen in Nervenzellen des 3. Larvenstadium Drosophila-Larven nutzen.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Drosophila-Larven mithilfe einer modifizierten mikrofluidischen Kammer schonend zu immobilisieren, um eine Live-Bildgebung durchzuführen. Eine Dritte-Instar-Larve wird mit etwas Öl in den Chip eingebracht, um die Abdichtung der Larve zu unterstützen. Anschließend wird der Chip so über die Larve gelegt, dass ihr Körper innerhalb der Kammer liegt.
Der Chip ist mit einer Spritze verbunden, sodass ein Vakuum angelegt werden kann. Die Beweglichkeit der Larven wird eingeschränkt, und Strukturen im ventralen Teil des Tieres werden nahe an die Deckglasoberfläche gedrückt. Mithilfe eines konfokalen Mikroskops lassen sich Strukturen leicht abbilden, wie beispielsweise die Details der Axonendigungen sensorischer Neuronen sowie die Regeneration segmentaler Nerven nach induziertem Nervenschaden.
Andere Methoden zur Immobilisierung von Josepha für die Live-Bildgebung, große Mengen Chloroformether oder ISO-Anästhetika. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung solcher Toxine vermeidet, die die Physiologie des Tieres beeinträchtigen. Ein zusätzlicher Vorteil der Abwesenheit von Toxinen ist, dass die Larven sicher und einfach zu handhaben sind. Die stabile Immobilisierung ermöglicht die Bildgebung schneller Vorgänge wie des schnellen axonalen Transports und von Veränderungen im intrazellulären Kalziumspiegel.
Eine einzelne Larve kann mehrfach in dem Chip fixiert und abgebildet werden. Dies ermöglicht Zeitrafferaufnahmen. Die Abbildung von Prozessen, die über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden stattfinden, beginnt damit, dass man einen Probenchip aus PDMS erhält, um dieses Protokoll auszuprobieren.
Anleitungen zum Herstellen eines A-P-D-M-S-Chips aus einer SU-acht-Form sind im Textprotokoll unter Verwendung einer 21-Gauge-Dosierspitze nachzulesen. Stellen Sie ein Loch im Vakuumanschluss des PDMS-Chips für ein invertiertes Mikroskop bereit. Entfernen Sie eine 23-Gauge-Nadel von ihrer Basis, indem Sie die Sicherungshülse mit einigen Drehbewegungen lösen.
Stechen Sie dann die Nadelspitze in ein kleines Stück Polyethylen-Schlauch, sodass der Schlauch mindestens einen Millimeter der Nadel bedeckt. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge das überschüssige Schlauchende ab. Dadurch entsteht ein Kunststoffring, der eine Dichtung bilden kann.
Führen Sie die Spitze einer 23-Gauge-Nadel in das Loch des Vakuumhafens ein. Bei einem aufrechten Mikroskop stechen Sie mit einer 21-Gauge-Dosier-Nadel ein zweites Loch in die Seite des PDMS-Chips. Dieses Loch ermöglicht den seitlichen Zugang zu dem ersten Loch.
Danach die Kanüle mit 23 Gauge und den Schlauchring in das Seitenloch einführen. Ein Stück doppelseitiges Klebeband über die Oberseite des PDMS-Chips legen, um das obere Loch abzudichten. Ein 20 cm langes Stück Polyethylen-Schlauch zwischen der am Vakuumanschluss des Chips eingeführten Kanüle und einem der Anschlüsse eines Dreiweghahns anschließen.
Danach eine 20-Milliliter-Spritze an einen der beiden verbleibenden Anschlüsse des Ventils anschließen, wobei der letzte Anschluss offen bleibt. Den PDMS-Chip mit transparentem Klebeband reinigen. Ein Stück Klebeband an die Unterseite des Chips anbringen.
Stellen Sie sicher, dass das Klebeband die gesamte PDMS-Oberfläche berührt, und ziehen Sie das Band dann ab. Wiederholen Sie diese Reinigungsmethode dreimal. Da der PDMS-Chip wiederverwendbar ist, ist es sehr wichtig, Ölrückstände zu entfernen, da diese die Haftung von PDM auf Glas beeinträchtigen können. Übertragen Sie frühzeitiges Nahrungssuchen.
Dritte-Instar-Larven von der Nahrung auf eine Petrischale mit Wasser übertragen. Sie müssen zwischen 3,5 und vier Millimeter lang sein, um korrekt in den Chip zu passen. Die Larven spülen, um das Kulturmedium zu entfernen.
Als Nächstes wird ein kleiner Tropfen Halo-Carbon-700-Öl in die Mitte eines Glas-Deckgläschens gegeben. Mit einer Pinzette wird eine gewaschene Larve vorsichtig aufgenommen, kurz auf ein leichtes Abwischpapier gelegt, um sie abzutrocknen, und anschließend für 10 Sekunden in das Öl überführt. Der Tropfen sollte klein genug sein, sodass die Tracheen der Larven nicht mit Öl bedeckt werden.
Legen Sie dann die Larven kurz auf eine saubere Glasdeckfolie und übertragen Sie sie auf eine andere Deckfolie, um etwas mehr Öl zu entfernen. Achten Sie dabei auf die Orientierung der Larven, um das Nervenkorsett und die segmentalen Nerven abzubilden.
Die ventrale Seite sollte nach unten weisen. Die leicht erkennbaren Tracheenröhrchen sollten nach oben zeigen. Legen Sie nun vorsichtig den PDMS-Chip auf die Larven.
Richten Sie die Larven in der Mitte der Mikrokammer aus. Die Larve sollte mit ihrem Hinterende zum Vakuumanschluss zeigen und die Kanten der Kammer nicht berühren. Sobald sie ausgerichtet ist, drücken Sie den PDMS-Chip fest gegen die Glasdeckfolie, um eine gute Abdichtung zu erzielen.
Überprüfen Sie dann erneut, ob sich die Larve vollständig in der Mikrokammer befindet. Schalten Sie nun das Dreiwegventil auf die Spritze. Halten Sie die PDMS-Anordnung fest und ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um zwei bis 2,5 Millimeter Luft zu entziehen, bis ein Widerstand spürbar ist.
So entsteht ein Vakuum. Danach schließen Sie das Ventil. Um das Vakuum sorgfältig aufrechtzuerhalten, überprüfen Sie die Larven nochmals.
Der Körper sollte innerhalb der Mikrokammer fixiert sein, und die Tracheen sollten sichtbar sein. Der Rest des PDMS-Chips sollte mit dem Deckglas in Kontakt stehen. Solche Ausrichtungen sind nicht korrekt. Nun bilden Sie die Larven ab.
Wenn ein aufrechter Mikroskop verwendet wird, befestigen Sie die obere Seite des Chips mit doppelseitigem Klebeband an der Objektbühne. Nach Abschluss der Bildaufnahme lösen Sie das Vakuum. Anschließend entfernen Sie den PDMS-Chip vom Deckglas.
Die Larve sollte sich sofort mit einer Pinzette bewegen lassen. Stellen Sie die Larven zur Erholung auf eine Agarplatte mit Traubensaft zurück. Legen Sie eine einzelne anästhesierte Larve auf eine Agarplatte mit Traubensaft.
Unter dem Stereomikroskop das Tier mit der Bauchseite nach oben drehen. Um das Bauchmark und die segmentalen Nerven sichtbar zu machen, sicherstellen, dass die Larve vollständig bewegungslos ist. Das Bauchmark und die Speicheldrüsen lokalisieren.
Es ist wichtig, diese Strukturen nicht zu beschädigen. Lokalisieren Sie das Ende des dritten Bauchsegments. Verletzungen an dieser Stelle schädigen die meisten Nerven und sind am einfachsten reproduzierbar, ohne das Tier zu töten.
Die Verletzung kann auch in weiter posterior gelegenen Segmenten mit einer Duostar-Nummer-fünf-Zange durchgeführt werden. Die segmentalen Nerven durch das Cuticula für fünf bis zehn Sekunden kräftig einklemmen. Bei korrekter Durchführung bleibt die Cuticula intakt und die Körperwand wird nicht durchstoßen.
Die Beherrschung erfordert Übung, nachdem das Tier mit der Bauchseite nach unten auf die große Platte gelegt wurde. Es sollte in der Lage sein, den Kopf zu bewegen und zu fressen. Wenn die Verletzung erfolgreich war, wird die hintere Körperhälfte der Larven gelähmt sein.
Der Larven-Chip wurde verwendet, um den Kinesin-vermittelten Transport von synaptischen Vesikeln in einzelnen peripheren Axonen abzubilden. Die anterograd gerichtete Bewegung dieser Vesikel betrug etwa 1,0 Mikrometer pro Sekunde. Die retrograde Bewegung wurde mit 0,8 Mikrometer pro Sekunde gemessen.
Die Immobilisierungstechnik wurde für die Laser-Mikrochirurgie unter Verwendung eines gepulsten UV-Farbstofflasers eingesetzt. Calciumspiegel wurden in spezifischen Neuronen mithilfe eines genetisch kodierten Indikators beobachtet. G camp 3.0 zeigt einen Calciumspitzenwert nach einem sensorischen Neuron an.
Das Dendrit wird durchtrennt. Die Zeiträume der Ruhe des Tieres zwischen den Bildgebungssitzungen ermöglichen die Beobachtung zellulärer Vorgänge über die Zeit. Nach dem Zerquetschen der Axone der motorischen Neurone des Emetic-Nervensystems zeigte der proximale Axonstumpf eine neue Aussprossung.
Unterdessen bildeten die distalen Axone Varikositäten und zerfielen im Verlauf der wallerischen Degeneration. Mithilfe des Larven-Chips ist ebenfalls die in-vivo-Verfolgung photochemisch umgewandelter fluoreszierender Proteine möglich. Ein DRA-zwei-Alpha-Tubulin-Fusionsprotein, das in sensorischen Neuronen der Klasse vier exprimiert wird, wurde in den Zellkörpern photochemisch umgewandelt.
Binnen zwei Tagen wurde eine signifikante Menge an photoaktiviertem Protein in die Axonendigungen der Sinnesneuronen umgelagert, etwa einen Millimeter entfernt vom ursprünglichen Ort im Zellkörper. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Larven-Chip für die Live-Bildgebung von Drosophila-Larven verwendet und wie man eine Nervenquetschverletzung durchführt. Sobald diese Techniken beherrscht sind, können die Larven innerhalb weniger Minuten unter dem Mikroskop positioniert werden.
Die Nervenquetschung ist genauso schnell. Daher können diese Verfahren für groß angelegte Experimente, wie genetische Untersuchungen, verwendet werden. Der Chip kann verwendet werden, um Strukturen auf der ventralen Seite der Drosophila-Larven abzubilden.
Dazu gehören unter anderem Muskeln, synaptische Verbindungen der neuromuskulären Junction, Sinnesneuronen, periphere Nerven und die ventrale Nervenstrang. Dieses Verfahren kann auch zur Live-Bildgebung des larvalen Herzens, der Speicheldrüsen und der Tracheen verwendet werden. Der in diesem Video verwendete Larven-Chip ist für Tiere mit einer Länge zwischen 3,5 und vier Millimeter dimensioniert.
Für die Bildgebung können bei kleineren oder größeren Tieren Chips mit einer kleineren oder größeren Kammer einfach hergestellt werden. Siehe die ergänzende Designdatei und Anleitung zur Herstellung von PDMS-Chips. Die Anweisungen zur Herstellung der PDMS-Chips sind im schriftlichen Protokoll enthalten.
Wir können Ihnen einen Beispiel-Chip zusenden, wenn Sie uns kontaktieren.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur nichtinvasiven Immobilisierung von Drosophila-Larven für die Live-Bildgebung unter Verwendung einer modifizierten mikrofluidischen Kammer. Die Technik ermöglicht die Beobachtung zellulärer Prozesse in Neuronen, insbesondere im Zusammenhang mit axonalem Transport und Nervenregeneration.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Techniken der Live-Bildgebung
Hintergrund
- Drosophila-Larven sind aufgrund ihrer Transparenz und genetischen Zugänglichkeit ein wertvolles Modell zur Untersuchung neuronaler Prozesse.
- Mittels Live-Bildgebung können Einblicke in dynamische zelluläre Vorgänge in Echtzeit gewonnen werden.
- Herkömmliche Immobilisierungsmethoden beinhalten oft schädliche Anästhetika, die die Physiologie beeinträchtigen können.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine sicherere Alternative für die Bildgebung ohne toxische Substanzen bereitzustellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer nicht-invasiven Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven für die Bildgebung.
- Erleichterung der Beobachtung neuronaler Strukturen und Prozesse.
- Möglichmachung der wiederholten Bildgebung derselben Larve über längere Zeiträume.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines PDMS-Mikrofluidikgeräts zur Immobilisierung von Larven.
- Anlegen eines Vakuums zur Einschränkung der Larvenmotilität.
- Bildgebung mittels konfokalem Mikroskop zur Visualisierung neuronaler Strukturen.
- Detaillierte Herstellung des PDMS-Chips und Positionierung der Larven für eine optimale Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Immobilisierung von Larven ohne Verwendung toxischer Anästhetika.
- Klare Abbildung der Axonendigungen sensorischer Neuronen und segmentaler Nervenregeneration.
- Möglichkeit, Zeitrafferaufnahmen über einen Zeitraum von 72 Stunden durchzuführen.
- Nachweis des Kinesin-vermittelten Transports synaptischer Vesikel.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte mikrofluidische Kammer bietet eine sichere und effektive Methode zur Live-Bildgebung von Drosophila-Larven.
- Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung schneller neuronaler Ereignisse und Erholungsprozesse.
- Das Protokoll kann für verschiedene Bildgebungsanwendungen in der Neurowissenschaftsforschung angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die nichtinvasive Immobilisierung von Modellorganismen ermöglicht die longitudinale Bildgebung dynamischer zellulärer Prozesse ohne pharmakologische Störfaktoren und unterstützt so die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung. Der Larven-Chip ermöglicht wiederholte Bildgebungssitzungen über einen Zeitraum von 72 Stunden und erlaubt die Untersuchung des axonalen Transports, von Verletzungsreaktionen und der Regeneration in einem physiologisch relevanten System. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem die native Biologie während der Beobachtung neuronaler Dynamik erhalten bleibt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch direkte Visualisierung des axonalen Transports und der Kalziumsignalisierung in Neuronen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung, indem wiederholte Bildgebung derselben Larve ermöglicht wird, um die Zielstrukturenbindung und die Modulation von Signalwegen über die Zeit zu bewerten.
- Prädiktiver Wert: Liefert quantitative Messgrößen für den Organellentransport und die auf Verletzungen folgenden Reaktionen und erhöht damit die Zuversicht in neurowissenschaftliche Entdeckungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem Larven fixiert werden, um eine konsistente, hochauflösende Abbildung ventraler Strukturen zu ermöglichen.
- Reproduzierbarkeit: Ermöglicht eine standardisierte Vorbereitung und Versiegelung von Larven in PDMS-Mikrokammern und verringert so die Variabilität in Live-Imaging-Assays.
- Skalierbarkeit: Erleichtert schnelle Fixierungs- und Aufnahmeprozesse und unterstützt die mittelhochdurchsatzfähige Bewertung genetischer oder pharmakologischer Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert axonale Schädigung und Regenerationsprozesse, die für die Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen relevant sind.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckungsbildgebung mit der präklinischen Validierung, indem zeitlich aufgelöste Studien zur wallerischen Degeneration und axonalen Aussprossung ermöglicht werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem regenerative versus degenenerative Reaktionen auf eine Nervenquetschung quantifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Larven-Chip lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem er die Live-Bildgebung neuronaler Prozesse vor der Identifizierung von Leitverbindungen ermöglicht und somit die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in auf Drosophila basierenden Modellen unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch direkte Abbildung des Kinesin-vermittelten Vesikeltransports und von Kalziumflüssen in sensorischen Neuronen.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Immobilisierung und ventrale Annäherung an die Deckglasunterlage für konsistente Bildgebung.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messung von axonalen Transportgeschwindigkeiten (1,0 µm/s anterograd, 0,8 µm/s retrograd) und die Detektion von Kalziumspitzen mithilfe genetisch kodierter Indikatoren.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischer Arbeit, indem axonale Verletzungsreaktionen – einschließlich Aussprossung und Fragmentierung – über längere Zeiträume modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert den PDMS-Mikrofluidik-Chip als wiederverwendbares System für Längsschnittstudien über mehrere experimentelle Durchgänge hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Beobachtung schneller neuronaler Ereignisse ohne anästhetikabedingte physiologische Störungen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Chip-Präparation, vakuumgestützte Immobilisierung und Reinigungsprotokolle zur Vermeidung von Ölrückständen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem einzelne Larven mehrfach verwendet werden können und somit die Anzahl der Tiere für Längsschnittstudien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch quantifizierbare Bildgebung von Degenerations- und Regenerationsparametern nach Verletzung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit mikrofluidischen Vorrichtungen, in der Bedienung von Vakuumsystemen und in der konfokalen Mikroskopie für eine optimale Bildgebung.
- Hängt vom Zugang zu PDMS-Formwerkzeugen, vakuumseitigen Anschlüssen mit Spritzen und Polyethylen-Schläuchen für die Abdichtung und fluidischen Verbindungen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg bei der Vorbereitung der Larven, der Ölaufbringung und der Ausrichtung der Kammer, um eine konsistente Immobilisierung sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Larvengrößen, die eine Anpassung der Chipabmessungen entsprechend der Körperlänge erfordern (3,5–4 mm für Standardchip).
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie das Vermeiden einer Ölabdeckung der Tracheen und die Gewährleistung einer korrekten ventralen Ausrichtung zur Visualisierung des Nervenstrangs.
