PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Polymer-Nanopartikel mit einstellbarer Größe herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Polymer in einem organischen Lösungsmittel gelöst und ein Wirkstoff oder ein fluoreszenter Einschlussstoff hinzugefügt wird. Im zweiten Schritt wird das Polymer mit einer wässrigen Phase, die ein Emulgiermittel enthält, emulgiert, und anschließend werden die Partikel in einem größeren wässrigen Volumen verfestigt, während das Lösungsmittel verdampft.

Anschließend werden die Partikel gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt und zur Langzeitlagerung lyophilisiert. Der letzte Schritt besteht darin, Größe und Oberflächenmorphologie der Nanopartikel mittels Rasterelektronenmikroskopie oder REM-Bildgebung zu charakterisieren. Letztendlich dient die REM-Analyse dazu zu zeigen, dass die Größe der Nanopartikel durch Variation der Emulgator-Konzentration gesteuert werden kann.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie einer Vielzahl menschlicher Krankheiten, da Partikel maßgeschneidert werden können, um ein breites Spektrum therapeutischer Wirkstoffe zur langanhaltenden Wirkung einzuschließen und abzugeben. Im Zielgewebe. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend.

Die Emulgierschritte sind schwierig zu erlernen, da subtile Aspekte der Emulsionsbildung einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Partikel haben können. Um mit der Herstellung von Nanopartikeln zu beginnen, geben Sie etwa 100 Milligramm Polylactid-co-glycolid-Säure, auch bekannt als PLGA, in ein 13 mal 100 Millimeter großes Reagenzglas. Übertragen Sie anschließend mit einer Glas-Serologiepipette ein Milliliter Ethylacetat zur Probe, bedecken Sie die Öffnung des Gefäßes mit Aluminiumfolie und verschließen Sie die Folie dann sicher mit Parafilm.

Stellen Sie sicher, dass die Folie fest über die obere Kante des Vials und die untere Kante der Aluminiumfolie gezogen wird, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu verhindern. Kennzeichnen Sie den Füllstand des Lösungsmittels am Reagenzglas und lassen Sie das Polymer über Nacht auflösen. Am nächsten Tag geben Sie bei Bedarf zusätzliches Lösungsmittel hinzu, falls Verdunstung aufgetreten ist.

Bereiten Sie die folgenden Geräte und Materialien in einem Abzug in der Nähe des Ultraschallgeräts vor. Vortexen Sie zwei kleine Glas-Pasteurpipetten mit Gummikolben und einem Magnetrührer. Stellen Sie außerdem einen großen Becher mit Eiswasser auf ein Stativ unterhalb des Ultraschallgeräts.

Fügen Sie als Nächstes 45 Milliliter einer 0,3 % Gewicht pro Volumen enthaltenden Vitamin E-T-P-G-S-Lösung in ein 200-Milliliter-Glaskolben hinzu und stellen Sie anschließend die Rührgeschwindigkeit auf 360 U/min ein. Geben Sie dann 2 Milliliter der 0,3 % Gewicht pro Volumen enthaltenden Vitamin E-T-P-G-S-Lösung in ein 13 × 100 Millimeter großes Glasreagenzglas. Um hydrophobe Wirkstoffe einzumischen, fügen Sie das Einschlussmittel direkt der Polymerlösung hinzu, achten Sie darauf, die Wände des Reagenzglases zu vermeiden, und wirbeln Sie das Gefäß, bis das Einschlussmittel gleichmäßig dispergiert ist.

Für hydrophile Wirkstoffe emulgieren Sie das Einschlussmittel mit der Polymerslösung. Geben Sie bis zu 50 Mikroliter Wirkstoff in Puffer auf die Oberfläche der Polymerslösung. Sonifizieren Sie das Gemisch auf Eis für etwa 10 Sekunden oder bis die Lösung trüb und homogen ist.

Als Nächstes das Reagenzglas mit Vitamin E-T-P-G-S kräftig vortexen, wobei das Reagenzglas senkrecht gehalten wird. Die Glaspipette einen bis zwei Zentimeter über dem oberen Rand des vortexenden Reagenzglases halten und die Polymere Lösung tropfenweise langsam auf die Oberfläche des vortexenden Mediums geben. Achten Sie darauf, dass die Pipette die Wand des Reagenzglases nicht berührt, nachdem die gesamte Polymere Lösung zugegeben wurde.

Setzen Sie das Vortexen der Lösung fort. Erzeugen Sie nun 15 Sekunden lang eine Emulsion. Überführen Sie die emulgierte Polymerlösung unverzüglich auf das Ultraschallgerät.

Halten Sie das Reagenzglas in Eiswasser und beschallen Sie die Emulsion in drei Intervallen zu je zehn Sekunden. Bewegen Sie die Emulsion währenddessen gleichmäßig entlang der Sonde, um eine homogene Beschallung zu gewährleisten, und vermeiden Sie es, dass die Sonde die Wände oder den Boden des Reagenzglases berührt. Machen Sie zwischen jedem zehnsekündigen Beschallungsintervall eine Pause von fünf bis zehn Sekunden, damit sich die Lösung abkühlen kann, bevor Sie fortfahren.

Anschließend ein bis zwei Milliliter der 0,3 %igen Vitamin E-T-P-G-S-Lösung aus der Rührlösung zur Emulsion hinzufügen. Dadurch wird das emulgierte Polymer verdünnt und leichter zu verarbeiten; die Emulsion anschließend in die Rührlösung einfüllen. Eventuell verbliebene Lösung aus dem Reagenzglas in die Rührlösung nachspülen.

Lassen Sie die Nanopartikel unter Rühren drei Stunden lang aushärten. Falls das Umhüllungsmaterial lichtempfindlich ist, wickeln Sie das Becherglas in Aluminiumfolie ein und lassen Sie die Öffnung frei, um die Lösungsmittelverdunstung zu erleichtern. Um die Nanopartikel zu sammeln, geben Sie das Herzmaterial zunächst in zwei Oak-Ridge-Zentrifugenröhrchen mit einem Nennvolumen von jeweils 30 Milliliter auf und bringen Sie diese auf ein Gewichtsgefälle von maximal 0,1 Gramm zueinander ins Gleichgewicht. Zentrifugieren Sie anschließend die Nanopartikel 15 Minuten lang in einem Festwinkelrotor bei 17.000.

RC f. Längere Zentrifugationszeiten führen zur Sammlung eines höheren Anteils kleinerer Nanopartikel. Entsorgen Sie den Überstand, wobei darauf zu achten ist, den Nanopartikelpellet nicht aufzuwirbeln.

Gebe fünf Milliliter destilliertes Wasser hinzu und verwende ein Wasserbad, einen Homogenisator und einen Vortex, um die Nanopartikel vollständig zu suspendieren. Vereinige die Inhalte der beiden Zentrifugenröhrchen in einem und gib 20 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 30 Milliliter ergibt. Wiederhole anschließend die Zentrifugation und die Waschschritte zwei weitere Male, sodass insgesamt drei Waschungen durchgeführt werden.

Das Flüssigkeitsvolumen der letzten Pellet-ReSuspension sollte vier bis fünf Milliliter betragen. Eine kleine Aliquotmenge der telosfreien Nanopartikel für die REM-Bildgebung einfrieren, den Rest aufbewahren. Als Kryoschutzmittel für eine gleichmäßige und vollständige ReSuspension von PLGA-Nanopartikeln ein Gewichtsverhältnis von eins zu zwei TLO zu Polymer hinzufügen.

Dadurch werden Eisbildung verhindert, die die Partikeloberfläche beschädigen und Aggregation verursachen könnte. Überführen Sie die Nanopartikel in eine vorher gewogene 5-mL-Zentrifugenprobe, und gefrieren Sie diese anschließend mindestens 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Danach öffnen Sie die Probe und verschließen Sie die Öffnung, indem Sie ein Laborpapier mit einem Gummiring fest über die Öffnung spannen.

Bei schneller Arbeitsweise, damit der Inhalt nicht schmilzt, falls eine Schmelzung auftritt. Vor dem Einbringen in den Gefriertrockner erneut einfrieren, dann die fünf Milliliter Probe 72 Stunden lang gefriertrocknen. Danach die Kappe wieder aufsetzen, das Gefäß verschließen und die lyophilisierten Partikel bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Am Tag der Bildgebung befestigen Sie einen Streifen doppelseitiges Kohlenstoff-Klebeband auf einem SEM-Präparat. Kennzeichnen Sie den metallischen Teil des Präparats mit einem Permanentstift zur späteren Identifizierung. Sammeln Sie mit einem Metallspatel eine kleine Menge lyophilisierter Nanopartikel und verteilen Sie diese vorsichtig auf der Oberfläche des Klebebands.

Bürsten Sie die Oberfläche des Probenträgers mit Laborgewebe ab oder verwenden Sie Druckluft, um lose Nanopartikel zu entfernen. Visualisieren Sie die Partikel mit einem Arbeitsabstand von fünf bis 15 Millimetern, einer Strahlstärke von fünf bis 12 Kilovolt und einer Spotgröße von eins bis drei; höhere Strahlstärken können zu einer lokalen Erwärmung der Probe führen, wodurch die Oberflächenmorphologie der Partikel verändert wird. Mikropartikel werden bei 100-facher Vergrößerung beobachtet, Nanopartikel sind bei 3000-facher Vergrößerung erkennbar.

Vergrößerung auf die Oberseite einer Kugel fokussieren, um Partikel zu lokalisieren, die leicht mit REM visualisiert werden können; mindestens drei Bilder pro Charge aufnehmen, um eine repräsentative Stichprobe hinsichtlich Partikelgröße und -morphologie zu erhalten. Mit dieser Methode können Partikel durch eine einzelne Emulsion erzeugt werden, die als einzelne, nicht miteinander verschmolzene Kugeln mit glatter Oberflächenmorphologie und einer breiten Größenverteilung über die Probe hinweg erscheinen. Die hier gezeigten Mikropartikel weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von 730 Nanometern auf.

Hier gezeigte Nanopartikel wurden durch ein einziges Emulgator-Molekül hergestellt und umschließen den hydrophoben Wirkstoff Campin. Diese Partikel waren noch kleiner und wiesen einen durchschnittlichen Durchmesser von 340 Nanometern auf. Höhere Emulgator-Konzentrationen führten zu kleineren Partikeln, wobei die durchschnittlichen Durchmesser von 2000 auf 200 Nanometer abnahmen.

Wenn die Emulgator-Konzentration von 0,01 auf 0,3 % anstieg, wie durch die hier gezeigten REM-Bilder dargestellt. Allerdings bildeten sich bei zu hoher Konzentration von Vitamin E-T-P-G-S keine diskreten Partikel mehr; bei Verwendung von 1 % Vitamin E-T-P-G-S wurden starke Verschmelzungen und flächige Strukturen im gesamten Material beobachtet. Richtig. Sobald man die Herstellung von PLG-Nanopartikeln mittels Emulgierung beherrscht, können weitere Methoden wie die Oberflächenmodifizierung angewendet werden, um Nanopartikel gezielt für die Interaktion mit bestimmten Zelltypen oder Körperregionen zu konstruieren.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Partikel mit reproduzierbarer und einstellbarer Größe durch Emulgierung herstellt.