Name: PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von PLGA-Nanopartikeln mit einstellbarer Größe durch Emulgierung mit Vitamin E-TPGS. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Partikelgröße für gezielte Wirkstofffreisetzung.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

1. Vorbereitung von Nanopartikeln
Alle Schritte, die Lösungsmittel oder gelöstes/emulgiertes Polymer beinhalten, sollten in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
<ol>
	<li>100 mg (+/- 5 mg) Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) abwiegen und in ein 13 mm x 100 mm großes Reagenzglas geben.</li>
	<li>1 ml Lösungsmittel (Ethylacetat (EtAc) oder Dichlormethan (DCM)) mit einer serologischen Glaspipette auf die Probe übertragen.</li>
	<li>Decken Sie die Oberseite der Tube mit einem kleinen Stück Aluminiumfolie ab und parafilmen Sie die Folie fest, wobei Sie darauf achten, dass der Parafilm sowohl über die Oberkante des Fläschchens als auch über die Unterkante der Folie fest gewickelt wird.</li>
	<li>Markieren Sie den Füllstand des Lösungsmittels an der Außenseite des Reagenzglases. Lassen Sie das Polymer über Nacht auflösen und fügen Sie am nächsten Tag zusätzliches Lösungsmittel hinzu, wenn es zu einer Verdunstung kommt. 
	Hinweis: Das Polymer kann bei Bedarf auch am Tag der Herstellung der Nanopartikel aufgelöst werden. Befolgen Sie die Schritte 1.1-1.3 und wirbeln Sie dann auf hoher Stufe vor, bis das gesamte Polymer vollständig aufgelöst ist (~10 min).</li>
	<li>Bereiten Sie einen Arbeitsbereich im Abzug mit folgenden Geräten/Materialien neben dem Ultraschallgerät vor: einen Vortexer, zwei kleine Pasteurpipetten aus Glas mit Gummikugeln und eine magnetische Rührplatte. Stellen Sie einen großen Becher mit Eiswasser auf einen Ständer unter dem Ultraschallgerät.</li>
	<li>Geben Sie 45 ml 0,3 % w/v Vitamin E-TPGS mit einem magnetischen Rührstab in ein 200-ml-Becherglas und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 360 U/min ein.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml 0,3 % w/v Vitamin E-TPGS in ein 13 mm x 100 mm großes Reagenzglas aus Glas.</li>
	<li>Medikament hinzufügen: 
	Für hydrophobe Mittel: Verkapselungsmittel direkt in die Polymerlösung geben (dabei darauf achten, die Wände des Reagenzglases zu vermeiden) und das Röhrchen so lange wirbeln, bis das Vergussmittel homogen dispergiert ist. 
	Für hydrophile Mittel: Emulgieren Sie das Verkapselungsmittel mit der Polymerlösung, bevor Sie fortfahren. Geben Sie bis zu 50 μl des Arzneimittels in Wasser oder Puffer auf die Oberfläche der Polymerlösung. Kurz mit Ultraschall beschallen, um das Arzneimittel mit Polymer zu emulgieren (typischerweise 10 Sekunden oder nach Bedarf, um eine homogene, undurchsichtige Lösung zu erhalten). Dieser Beschallungsschritt sollte auf Eis durchgeführt werden.</li>
	<li>Platzieren Sie das Polymer/Verkapselungsmittel des offenen Rohrs in der Nähe des Vortexers. Während Sie das Reagenzglas mit Vitamin E-TPGS senkrecht und auf hohem Wirbel halten, verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um die Polymer-/Verkapselungslösung tropfenweise hinzuzufügen. Achten Sie darauf, die Seiten des Rohrs zu vermeiden und die Polymerlösung direkt auf die Oberfläche des Vortexemulgators zu tropfen. Nachdem das gesamte 1 ml Polymerlösung zum Vitamin E-TPGS hinzugefügt wurde, fahren Sie mit dem Vortexen der Lösung (jetzt eine Emulsion) für weitere 15 Sekunden fort.</li>
	<li>Übertragen Sie das emulgierte Polymer sofort in den Ultraschallgerät. Lassen Sie das Reagenzglas in Eiswasser getaucht und beschallen Sie die Emulsion in drei 10-Sekunden-Stößen (40 % Amplitude für ein 700-W-Ultraschallgerät, 1/8 in Sondenspitzengröße). Bewegen Sie die Emulsion in der Sonde auf und ab, um eine gleichmäßige Beschallung zu gewährleisten, und achten Sie darauf, dass die Sonde nicht an den Seiten oder am Boden des Reagenzglases berührt wird. Machen Sie eine Pause zwischen jeder zehnsekündigen Beschallung, um die Lösung abkühlen zu lassen, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Geben Sie 1-2 ml 0,3% Vitamin E-TPGS aus der Rührlösung mit einer Pasteur-Pipette aus Glas in die Emulsion, wodurch das emulgierte Polymer verdünnt wird, damit es leichter fließen kann. Entleeren Sie die Emulsion in die Rührlösung. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die restliche Lösung aus dem Reagenzglas in die Rührlösung auszuwaschen.</li>
	<li>Lassen Sie die Nanopartikel unter Rühren drei Stunden lang aushärten. Wenn das Verkapselungsmittel lichtempfindlich ist, kann das Becherglas in Aluminiumfolie eingewickelt werden, wobei die Oberseite offen bleibt, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu erleichtern.</li>
</ol>
2. Sammlung von Nanopartikeln
<ol>
	<li>Die ausgehärteten Nanopartikel werden auf zwei Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (30 ml Nennvolumen) aufgeteilt und auf 0,1 g genau ausbalanciert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Nanopartikel in einem Festwinkelrotor für 15 min bei 17.000 x g. Längere Zentrifugationszeiten führen dazu, dass eine höhere Fraktion kleinerer Nanopartikel gesammelt wird.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Nanopartikel-Pellet nicht zu beschädigen (Wasser kann ausgegossen oder pipettiert werden). Geben Sie 15 ml diH2O hinzu und verwenden Sie einen Wasserbad-Ultraschallator und/oder einen Vortexer, um die Nanopartikel vollständig zu resuspendieren.</li>
	<li>Kombinieren Sie den Inhalt der beiden Zentrifugenröhrchen zu einem und wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3 2x weiter, für insgesamt drei Wäschen in jeweils 30 ml diH2O. Das Flüssigkeitsvolumen der letzten Pellet-Resuspension sollte 4-5 ml betragen. 
	An dieser Stelle kann ein Gewichtsverhältnis von 1:2 Trehalose:Polymer als Kryoprotektivum zugesetzt werden (ein kleines Aliquot von Nanopartikeln ohne Trehalose für die REM-Bildgebung einfrieren). Eiskristalle, die sich während des Gefrierprozesses bilden, können die Partikeloberfläche beschädigen und eine Aggregation induzieren, und es wurde gezeigt, dass die Einbeziehung von Trehalose die gleichmäßige und vollständige Resuspension von PLGA-Nanopartikeln verbessert13.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nanopartikel in ein vorgewogenes 5-ml-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei -80 °C ein.</li>
	<li>Bewegen Sie sich schnell, um den gefrorenen Inhalt nicht schmelzen zu lassen, öffnen Sie den Deckel des Röhrchens und decken Sie den Deckel ab, indem Sie das Laborgewebe mit einem Gummiband über der Oberseite befestigen. **Wenn ein Schmelzen auftritt, frieren Sie es erneut ein, bevor Sie es in den Gefriertrockner geben.</li>
	<li>72 Stunden lang für ein Volumen von 5 ml lyophilisieren. Lagern Sie lyophilisierte Partikel in einem mit Parafilm umwickelten Röhrchen bei -80 °C.</li>
</ol>
3. Größenbestimmung und Oberflächenmorphologie
Rasterelektronenmikroskopie
<ol>
	<li>Proben für das REM sollten am Tag der Bildgebung vorbereitet werden. Lege einen Streifen doppelseitiges Kohleband auf einen REM-Stummel. Ein Permanentmarker kann verwendet werden, um den Metallteil des Stummels für eine spätere Referenz zu beschriften.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Metallspatel, um eine kleine Menge lyophilisierter Nanopartikel aufzufangen und sie vorsichtig auf der Oberfläche des Klebebandes zu verteilen. Bürsten Sie die Oberfläche des Stummels mit einem Labortuch ab oder verwenden Sie Druckluft, um lose Nanopartikel zu entfernen.</li>
	<li>Sputtern Sie die Probe für 30-120 Sekunden mit Gold-Paladium bestreichen. Eine längere Sputterzeit führt zu einer glatteren Oberfläche für die Bildgebung, obwohl dies zum Verlust feiner Oberflächendetails führen kann.</li>
	<li>Typische Parameter für die Visualisierung von Partikeln sind ein Arbeitsabstand von 5-15 mm, eine Strahlstärke von 5-12 kV und eine Spotgröße von 1-3. Höhere Strahlstärken können zu einer regionalen Erwärmung der Probe führen, was die Oberflächenmorphologie der Partikel verändert. Mikropartikel werden bei 100-facher Vergrößerung beobachtet und Nanopartikel sind bei 3.000-facher Vergrößerung unterscheidbar.</li>
	<li>Die ideale Probe besteht aus einer gleichmäßigen Beschichtung von Partikeln auf der ebenen Oberfläche des Stubs. Gelegentlich können Sekundärstrukturen (einschließlich Flocken oder Kugeln) durch Lyophilisation entstehen. Wenn Sie sich auf den Rand einer Flocke konzentrieren, wo die Flocke auf das Klebeband trifft, oder auf die Oberseite einer Kugel, können Sie Partikel lokalisieren, die mit REM leicht sichtbar gemacht werden können. Sammeln Sie mindestens drei Bilder pro Charge, um eine repräsentative Probe der Partikelgröße und -morphologie zu erhalten.</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben nichts offenzulegen.

PLGA-Partikel werden üblicherweise durch Einzel- oder Doppelemulsion hergestellt, eine Methode, die die Möglichkeit bietet, Partikeleigenschaften wie Größe, Verkapselung und Oberflächeneigenschaften anzupassen7. Diese und andere Eigenschaften hängen von vielen Variablen ab, darunter der Lösungsmitteltyp, die Zufuhrverhältnisse, die Emulgiermethode und der Emulgatortyp. Unserer Erfahrung nach ist es jedoch möglich, dass ein einzelner Experimentator Partikel mit gleichbleibenden Eigenschaften herstellt. Unter Verwendung desselben Protokolls stellte ein gut ausgebildeter Experimentator sieben separate Chargen von Nanopartikeln mit den folgenden mittleren Durchmessern her: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 und 364 nm±110. Die Mittelung der Chargen des gut ausgebildeten Experimentators ergibt einen mittleren Durchmesser von 340 nm±25 und eine mittlere Standardabweichung innerhalb der Charge von 110 nm±8. Ein zweiter Experimentator, der vom ersten trainiert wurde, verwendete das gleiche Protokoll, um Nanopartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 328 nm±138 herzustellen. Ein dritter Experimentator, der mehrere Monate lang selbstständig Nanopartikel hergestellt hatte, folgte jedoch dem gleichen Protokoll, um Nanopartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 220 nm±70 herzustellen. Auf diese Weise ist es möglich, Partikel mit einem erwarteten Durchmesserbereich herzustellen, aber dies hängt von der exakten Replikation der subtilen experimentellen Technik ab. Das Pooling von Chargen kann die Herstellung großer Mengen von Nanopartikeln mit identischen Aggregateigenschaften ermöglichen. Wenn wir beispielsweise Nanopartikel für In-vitro - oder In-vivo-Studien oberflächenmodifizieren, werden mehrere (bis zu 6) 200-mg-Chargen vorbereitet, gewaschen, gesammelt, in ein einziges Röhrchen gemischt und dann für die Oberflächenmodifikation aufgeteilt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Größe der Nanopartikel, die Wirkstoffbeladung, die Ladung und der Anteil der für die Modifikation verfügbaren Oberflächenstellen zwischen zwei Behandlungsgruppen vergleichbar sind. In einem anderen Beispiel, wenn die interessierende Variable die Arzneimittelwirksamkeit ist, wenn verschiedene Wirkstoffe in verschiedene Chargen von Nanopartikeln geladen werden, ist es wichtig, die Variabilität der Arzneimittelbeladung zu messen und zu kontrollieren. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die Partikeleigenschaften für jede Charge der produzierten Partikel gemessen werden und dass Experimente entworfen und repliziert werden, um die Variabilität von Charge zu Charge zu kontrollieren.
Eine vollständige Emulsion der organischen und wässrigen Phase ist entscheidend für die Bildung kleiner Partikel. Polyvinylalkohol (PVA) ist vielleicht der am häufigsten verwendete Emulgator. Wir und andere haben eine Vielzahl von Emulgier- und Stabilisierungsmitteln verwendet, darunter Vitamin E-TPGS9, PVA14, spans15 und Poloxamere16 (für eine gründliche Diskussion der breiten Palette von Wirkstoffen, die zur Herstellung von PLGA-Partikeln verwendet werden, siehe Rezension von Wischke et al.17). Richtig emulgiertes Polymer erscheint als homogene, milchig-weiße/undurchsichtige Lösung. Eine schlechte (oder "zerbrochene") Emulsion weist makroskopische Heterogenität oder Körnung auf und kann sich sogar in zwei visuell unterschiedliche Schichten in der Tube aufteilen. Dies deutet in der Regel auf ein Versagen bei der Bildung von Nanopartikeln hin. Die Emulsion kann nach Schritt 1.9 zerfallen, wenn sie nicht sofort in das Ultraschallgerät überführt wird. In diesem Fall erneut vortexen, bis eine homogene Masse entsteht, und sofort zum Ultraschallgerät gelangen. Eine Trennung sollte nicht nach dem Beschallungsschritt (1.10) erfolgen. Nachdem die Partikel in ein größeres wässriges Volumen dispergiert worden sind (Schritt 1.11), sollte die Lösung gleichmäßig undurchsichtig bis leicht durchscheinend sein. Die durchscheinende Qualität nimmt mit abnehmender Partikelgröße zu, und bei sehr kleinen Nanopartikeln kann ein blauer Farbton beobachtet werden. Dieser Farbton wird möglicherweise nicht beobachtet, wenn Partikel ein Medikament einkapseln. Wenn sich die Emulsion nicht gleichmäßig in das große wässrige Volumen dispergiert oder körnig erscheint, sollte der Versuch nicht fortgesetzt werden. Es ist normal, eine gewisse Variation im Aussehen des Partikelpellets sowie in seiner Kohäsion zu beobachten. Einige Pellets können bei leichtem Wirbeln resuspendieren, während andere mehrere Minuten Beschallung im Wasserbad benötigen. Die Resuspension sollte nicht länger als 5 Minuten dauern. Lyophilisierte Partikel können eine Vielzahl von Texturen annehmen, von baumwollartig bis frei fließend.
Einer der vielen Vorteile von PLGA als Nanopartikelmaterial ist die Möglichkeit, den Herstellungsprozess zu optimieren, um die gewünschte Partikelgröße für die beabsichtigte Anwendung zu erzeugen. Größere Nanopartikel verkapseln einen höheren Anteil des hydrophoben Arzneimittels (bezogen auf das Gewicht des Polymers) als kleine Nanopartikel, jedoch kann auch die Kinetik der Wirkstofffreisetzung beeinflusst werden18-20. Die Größe von Nanopartikeln hat einen direkten Einfluss auf die Mechanismen der Partikelinternalisierung durch Zellen sowie auf ihre Verteilung im Gewebe, was zu dramatischen Unterschieden in der Verabreichungseffektivität führen kann . Zum Beispiel markiert und entfernt das mononukleäre Phagozytensystem Wirkstoffe im systemischen Kreislauf, die größer als 1 μm sind. Kleine Nanopartikel könnten für die direkte Infusion in das Gehirn von Interesse sein, wo größere Nanopartikel in der engen extrazellulären Matrix gefangen wären; Die Verabreichung kleiner Nanopartikel könnte auch das passive Targeting von Tumoren über den verbesserten Permeations- und Retentionseffekt erleichtern. Die Effizienz der Wirkstoffverkapselung variiert stark, abhängig von den Eigenschaften des spezifischen Arzneimittels, der Größe des Partikels und dem Emulgator (d. h. seiner Löslichkeit in Wasser im Vergleich zu Lösungsmitteln). Die Einfach- oder Doppelemulsion wirkt sich auch auf die Wirkstoffbeladung und die Größe der Nanopartikel aus. Die Verkapselung von hydrophoben Mitteln über eine Einzelemulsion kann im Vergleich zur Doppelemulsionsmethode bei der Herstellung ultrakleiner Nanopartikel helfen. Wir verweisen den Leser auf andere Quellen für eine ausführliche Diskussion dieses Themas23-28. Schließlich stehen alternative Emulgiermethoden zur Verfügung, einschließlich Hochgeschwindigkeits-Homogenisierung, und diese anderen Ansätze können Vorteile für bestimmte Arten von Arzneimitteln oder Anwendungen zur Verabreichung von Arzneimitteln bieten29.
Die Einzelemulsionsmethode bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von Formulierungsvariablen zu variieren, von denen jede in der Lage ist, die Eigenschaften von Nanopartikeln zu verändern. Wenn Sie beispielsweise Dichlormethan (DCM) als Lösungsmittel verwenden, werden in der Regel größere Nanopartikel mit einer breiteren Größenverteilung hergestellt. Da Ethylacetat (EtAc) in Wasser mischbar ist, wird die Oberflächenspannung des Polymertröpfchens in der Primäremulsion verringert, wodurch kleinere Nanopartikel entstehen. DCM kann durch das gleiche Volumen an EtAc ersetzt werden. Alternative Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen können verwendet werden, um die Arzneimittelverkapselung und die Partikeleigenschaften zu optimieren. Andere Formulierungsparameter sind ebenfalls in der Lage, die Partikelgröße zu verändern: Zum Beispiel führt die Erhöhung des Lösungsmittelvolumens, des Lösungsmittel:Polymer-Verhältnisses, der Beschallungsintensität oder der Geschwindigkeit/Dauer der Zentrifugation zu einer Verringerung der Größe der gesammelten Partikel. Es ist möglich, die Partikel durch sequentielle Zentrifugation (z. B. eine schnelle Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, um zuerst größere Partikel zu entfernen, gefolgt von einer längeren Drehung zum Sammeln ultrakleiner Partikel) oder durch Filterung durchzuführen.
Hier beschreiben wir Formulierungsparameter, die die Herstellung von PLGA-Partikeln mit durchschnittlichen Durchmessern von 220 nm bis 1,98 μm ermöglichen. Diese Methoden zur Herstellung von Partikeln, die aus PLGA bestehen, können verwendet werden, um das Partikeldesign (Größe, Verkapselung und Oberflächeneigenschaften) für zukünftige Anwendungen zur Wirkstoffverabreichung in vitro oder in vivo zu optimieren.

Polymere sind in den letzten Jahrzehnten zu immer beliebteren Vehikeln für die Verabreichung von Medikamenten geworden, die von der gezielten Tumortherapie1 bis zur Modulation des Immunsystems2 reichen. Polymerverkapselte oder konjugierte Arzneimittel sind häufig wirksamer als ihre frei lieferbaren Gegenstücke, da polymerassoziierte Arzneimittel vor Abbau geschützt sind. Dieser Schutz führt zu einer längeren biologischen Halbwertszeit und einer potenziell verbesserten Wirksamkeit bei reduzierten systemischen Nebenwirkungen3-5.
Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) weist viele der idealen Eigenschaften eines nanoskaligen Verabreichungssystems auf, das eine langfristige Freisetzung des verkapselten Mittels ermöglicht und in die biokompatiblen Produkte von Milch- und Glykolsäure abgebaut wird. Kleine Moleküle, Proteine und Nukleinsäuren, die in PLGA eingekapselt sind, haben eine erhöhte Aktivität in einer Vielzahl von Krankheitsanwendungen gezeigt8. Wichtig ist, dass die Materialplattform eine einfache Anpassung von Merkmalen wie Größe, Ladung und Oberflächenanzeige von Liganden ermöglicht, um Partikel auf bestimmte Gewebe zu lenken oder für Bildgebungszwecke. Da PLGA bereits beim Menschen in Form von biologisch abbaubaren Nähten (z. B. Purasorb, Purac Biomaterials und Vicryl, Ethicon Inc.) eingesetzt wird, ist das Potenzial für eine klinische Translation hoch.
Öl-Wasser-Emulsion (einfach) oder Wasser-Öl-Wasser (doppelt) ist eine Methode, mit der PLGA zur Verkapselung von hydrophoben und hydrophilen Arzneimitteln in mikro- oder nanoskaliger Form verwendet werden kann. Kurz gesagt, PLGA wird in eine organische Phase (Öl) aufgelöst, die mit einem Tensid oder Stabilisator (Wasser) emulgiert wird. Hydrophobe Arzneimittel werden direkt in die Ölphase gegeben, während hydrophile Arzneimittel (Wasser) vor der Bildung von Partikeln zuerst mit der Polymerlösung emulgiert werden können. Hochintensive Ultraschallstöße erleichtern die Bildung kleiner Polymertröpfchen. Die resultierende Emulsion wird in eine größere wässrige Phase gegeben und mehrere Stunden lang gerührt, wodurch das Lösungsmittel verdampfen kann. Gehärtete Nanopartikel werden gesammelt und durch Zentrifugation gewaschen (Abbildung 1).
Hier beschreiben wir eine Technik zur Herstellung von PLGA-Nanopartikeln unter Verwendung einer einfachen und doppelten Emulsion, mit Ethylacetat (EtAc) als Lösungsmittel und Vitamin E-D-α-Tocopherol-Polyethylenglykolsuccinat (TPGS) als Emulgator. Die Verwendung von Vitamin E-TPGS bietet mehrere mögliche Vorteile gegenüber anderen Arten von Stabilisatoren (z. B. Polyvinylalkohol), PVA), einschließlich einer verbesserten Emulgierungs- und Verkapselungseffizienz. Andere Gruppen haben über Vorteile von Vitamin E-TPGS berichtet, einschließlich der Hemmung von P-gp, einem Transmembran-Efflux-Protein, das häufig auf Krebszellen überexprimiert wird und bekanntermaßen zur Arzneimittelresistenz beiträgt, indem es Medikamente aus den Zielzellen heraustransportiert. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Partikel mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert und dimensioniert werden können, und geben weitere Hinweise zur Größenmodifikation durch Änderung des Protokolls.

<table><tbody><tr><td>Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA)&amp;nbsp;</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Eigene Viskosität: 0,55–0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Essigsäureethylester (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td></td><td></td><td>87–89 % hydrolysiert, 30.000–70.000 Da</td></tr><tr><td>Geräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Modell 705</td><td>700 W (Ultraschallzerreißer)</td></tr><tr><td>Ultraschallsonde</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 Zoll</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Mehrpositionen-Rührer</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

plga-nanopartikel durch einzel-oder doppel-emulsion mit vitamin e-tpgs gegründet

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) ist ein biokompatibles Mitglied der aliphatischen Polyesterfamilie biologisch abbaubarer Polymere. PLGA ist seit langem eine beliebte Wahl für die Verabreichung von Arzneimitteln, zumal es bereits von der FDA für die Anwendung beim Menschen in Form von resorbierbarem Nahtmaterial zugelassen ist. Hydrophobe und hydrophile Arzneimittel werden in PLGA-Partikeln über eine Einzel- oder Doppelemulsion verkapselt. Kurz gesagt, wird das Arzneimittel mit Polymer gelöst oder mit Polymer in einer organischen Phase emulgiert, die dann mit der wässrigen Phase emulgiert wird. Nachdem das Lösungsmittel verdampft ist, werden die Partikel gewaschen und durch Zentrifugation zur Gefriertrocknung und Langzeitlagerung gesammelt. PLGA wird in wässrigen Umgebungen langsam durch Hydrolyse abgebaut, und verkapselte Wirkstoffe werden über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten freigesetzt. Obwohl PLGA ein Material ist, das viele Vorteile für die Verabreichung von Medikamenten bietet, kann die reproduzierbare Bildung von Nanopartikeln eine Herausforderung darstellen. Eine beträchtliche Variabilität wird durch die Verwendung unterschiedlicher Geräte, Reagenzienchargen und präziser Emulgierungsmethoden eingeführt. Hier beschreiben wir sehr detailliert die Entstehung und Charakterisierung von Mikropartikeln und Nanopartikeln, die durch Einzel- oder Doppelemulsion unter Verwendung des Emulgators Vitamin E-TPGS gebildet werden. Die Bestimmung der Partikelmorphologie und -größe erfolgt mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM). Wir liefern repräsentative REM-Bilder für Nanopartikel, die mit unterschiedlichen Emulgatorkonzentrationen hergestellt wurden, sowie Beispiele für bildgebende Artefakte und fehlgeschlagene Emulgatoren. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um alternative Emulgatoren (z. B. Poly(vinylalkohol), PVA) oder Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan, DCM) zu verwenden.

Repräsentative REM-Bilder von PLGA-Mikropartikeln und -nanopartikeln, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, sind in Abbildung 2a und 2b dargestellt. Die Partikel erscheinen als einzelne, nicht verschmolzene Kugeln mit glatter Oberflächenmorphologie und weisem Größenspektrum, das sich über die gesamte Probe erstreckt.
Um den durchschnittlichen Durchmesser jeder Charge zu bestimmen, werden Messungen direkt an den REM-Bildern mithilfe der „Messen“-Funktion in ImageJ durchgeführt. Es sollten mindestens 150 Messungen des Durchmessers zufällig aus dem Sichtfeld ausgewählter Partikel durchgeführt werden, um eine repräsentative Größenverteilung zu erhalten. Die durchschnittliche Größe einer Partikelcharge hängt von den Formulierungsparametern ab. Beispielsweise wurden in Abbildung 2a Mikropartikel (durchschnittlicher Durchmesser von 730 nm±370) mit 1 ml Lösungsmittel pro 100 mg PLGA hergestellt, wobei 0,05 % Vitamin E-TPGS in der Emulgierphase verwendet wurde, während in Abbildung 2b Nanopartikel (durchschnittlicher Durchmesser von 340 nm±70) mit 4 ml Lösungsmittel pro 200 mg PLGA hergestellt wurden, wobei der hydrophobe Wirkstoff Camptothecin eingeschlossen und 0,3 % Vitamin E-TPGS in der Emulgierphase eingesetzt wurde (die vollständigen Formulierungsparameter sind in der Bildunterschrift beschrieben). Allgemein führt eine höhere Emulgierstoffkonzentration zu kleineren Partikeln, wobei durch Variation der Emulgierstoffkonzentration von 0,3–0,01 % durchschnittliche Durchmesser im Bereich von 220–2.000 nm erzielbar sind (Abbildung 3).
Unsere Ausbeuten liegen im Bereich von 74–98 % (22 Partikelchargen mit variierenden Lösungsmitteln, Emulgatoren und Emulgierungsbedingungen, hergestellt von einem einzigen Experimentator). Höhere Ausbeuten können bei größeren Partikeln (&gt;150 nm) beobachtet werden, da kleine Nanopartikel während der Zentrifugation und der Waschschritte leicht verlorengehen, insbesondere wenn das Waschüberstandvolumen vom Pellet abgegossen wird. Sorgfältiges Pipettieren der Flüssigkeit kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Höhere Drehzahlen und/oder längere Zentrifugationszeiten können die Ausbeute ebenfalls verbessern, indem sie einerseits die Sammlung des ultrakleinen Nanopartikelfraktion verbessern und andererseits das Pellet verdichten, sodass weniger Partikel im Waschschritt verlorengehen. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von Partikeln mit TPGS als Emulgator und EtAc als Lösungsmittel; jedoch sind alternative Lösungsmittel und/oder Emulgatoren möglich. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass EtAc kleinere und gleichmäßigere Nanopartikel erzeugt als DCM (z. B. Durchmesser von 540 nm±190 gegenüber 2.160 nm±1.530 für EtAc beziehungsweise DCM, 100 mg/ml PLGA im Lösungsmittel, emulgiert in 2 ml 0,1 % TPGS), vermutlich weil EtAc wasserlöslich ist, während DCM es nicht ist. PVA ist ein weit verbreiteter Emulgator, der sowohl von uns als auch von anderen Arbeitsgruppen umfassend eingesetzt wurde. Wir haben beobachtet, dass Nanopartikel, die aus verschiedenen Chargen kommerziell erhältlichen PVA hergestellt wurden, variieren können. Daher empfiehlt es sich, wenn möglich, dieselbe PVA-Charge zu verwenden, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Nach unseren Erfahrungen ist PVA bei weitaus höheren Konzentrationen ein wirksameres Emulgiermittel als TPGS (z. B. Durchmesser von 140 nm±48, 100 mg/ml PLGA in DCM, emulgiert in 2 ml 5 % PVA).
Die Charakterisierung von Nanopartikeln mittels REM kann aufgrund von Unterschieden in der Ausrüstung und im Abbildungsverfahren herausfordernd sein. Daher ist es wichtig, morphologische Merkmale, die auf Probleme bei der Partikelbildung hinweisen, von Artefakten zu unterscheiden, die unbeabsichtigt während der Abbildung entstehen. Das Verschmelzen (Abbildung 4a und 4b), das Einbuchen (Abbildung 4c) oder das Aufreißen (Abbildung 4f) von Partikeln wird manchmal in REM-Aufnahmen beobachtet. Solche Artefakte deuten manchmal auf schlecht gebildete Partikel hin (z. B. in Abbildung 4a war die Emulgator-Konzentration zu hoch, um diskrete Partikel zu bilden), können aber auch durch Artefakte entstehen, die durch die Charakterisierungsmethode verursacht werden (z. B. in Abbildung 4b wurde die Probe während der Sputter-Beschichtung erhitzt, und in Abbildung 4c veränderte eine lokale Erwärmung durch den REM-Strahl die Oberflächenmorphologie der Partikel während der Aufnahme). Um Abbildungsartefakte zu vermeiden, sollte die Sputter-Beschichtungszeit minimiert und die Strahlleistung niedrig gehalten werden. Glattere Morphologien werden bei längeren Sputter-Zeiten beobachtet; dies kann jedoch zu einer Verschmelzung der Partikel führen. Zu kurze Sputter-Zeiten können die Aufnahme erschweren, da die Partikel sich aufladen und während der Bildaufnahme bewegen können. Eine schnelle Aufnahme hilft, eine längere Bestrahlung und Bildverzerrungen zu vermeiden (Abbildung 4d und 4e). Hohe Strahlbelastungen können ebenfalls zu einer Ausdehnung und Rissbildung der Nanopartikeloberfläche führen (Abbildung 4f). Falls morphologische Artefakte nicht durch Anpassung der Charakterisierungsparameter minimiert werden können, ist es möglich, dass sie echte Probleme mit den Nanopartikeln selbst widerspiegeln. Während des Herstellungsprozesses kann das Verschmelzen durch Überhitzung infolge hoher Ultraschallleistung, unvollständige Verdampfung des Lösungsmittels, unvollständige Resuspension während der Waschphase oder fehlgeschlagene Lyophilisierung verursacht werden.
<img alt="Schema des Verfahrens zur Trennung von Öl und Wasser; Beschallung, Verdampfung, Sammeln; Lyophilisierungsdiagramm" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von Nanopartikeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Nanopartikelstruktur (REM) und Größenverteilung (μm, nm), vergleichende Analysetabelle." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. REM-Aufnahmen und zugehörige Größenverteilungen von PLGA-Mikropartikeln und -nanopartikeln, hergestellt mittels der Einzel-Emulsionsmethode. In (A) wurden Partikel durch Emulgieren von 100 mg PLGA, gelöst in 1 ml Ethylacetat, in 2 ml 0,05 % Vitamin E-TPGS gebildet und in 45 ml 0,01 % Vitamin E-TPGS gehärtet. Die entsprechende Größenverteilung ist in (C) dargestellt. In (B) wurden Partikel durch Emulgieren von 200 mg PLGA und 40 mg Camptothecin, gelöst in 4 ml Ethylacetat, in 4 ml 0,3 % Vitamin E-TPGS gebildet und in 90 ml 0,3 % Vitamin E-TPGS gehärtet. Die entsprechende Größenverteilung ist in (D) dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Analyse der Partikelgröße; Balkendiagramm und REM-Bilder zeigen den Einfluss des TPGS-Anteils auf die Mikrosphärengröße." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Die Partikelgröße hängt von der Emulgator-Konzentration ab. Eine Erhöhung der Vitamin-E-TPGS-Konzentration führte zu kleineren Nanopartikeln. Gezeigt sind die mittleren Durchmesser und entsprechende REM-Bilder von Partikeln, die durch Emulgieren von 100 mg PLGA, gelöst in 1 ml Ethylacetat, in (A) 0,01 %, (B) 0,05 %, (C) 0,1 % oder (D) 0,3 % Vitamin E-TPGS hergestellt wurden und in 45 ml 0,3 %iger Vitamin-E-TPGS-Lösung gehärtet wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 200 Durchmesser-Messungen aus 2 Bildern einer einzelnen Charge dar. Die Maßstabsbalken entsprechen 5 μm (A–C) bzw. 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="REM-Aufnahme der Partikelmorphologie und Aggregation. Analyse der Pulver-Mikrostruktur." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Mit REM beobachtete Oberflächenmorphologie-Artefakte. In (A) waren starke Verschmelzungen und blattartige Strukturen im gesamten Probenbereich vorhanden. Die Konzentration von Vitamin E-TPGS war zu hoch (1 %), um diskrete Partikel zu bilden. In (B) waren einige Probenbereiche verschmolzen, es existierten jedoch große Bereiche mit diskreten Nanopartikeln, insbesondere dort, wo Lücken in der Sputterbeschichtung vorlagen. Wir vermuten, dass diese Verschmelzungsartefakte durch Erwärmung während des Sputterbeschichtungsprozesses verursacht wurden. In (C) erschienen die Partikel anfangs glatt, doch eine längere Bestrahlung der Probe mit dem REM-Strahl führte zu Dellenbildung und Wellenbildung. (D) zeigt eine Aufnahme mit geringer Auflösung, die mit minimaler Bestrahlung der Probe durch den REM-Strahl aufgenommen wurde; die Partikel erscheinen glatt mit runder Morphologie. In (E) wurde dieselbe Probe länger bestrahlt, wodurch eine deutliche Verzerrung der ursprünglichen Morphologie sichtbar wird. In (F) führte eine lange Bestrahlung bei hoher Spannung (12 kV) zu Erwärmung und Rissbildung der Partikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um die Abbildung in größerer Ansicht zu sehen</a>.

Wir beschreiben die Herstellung und Charakterisierung von Nanopartikeln und Mikropartikeln aus Poly(milchsäure-co-glykolsäure) unter Verwendung von Vitamin E-TPGS als Emulgator. Durch Variation von Formulierungsparametern, wie z. B. der Emulgatorkonzentration, ist es möglich, Nanopartikel mit mittleren Durchmessern von 220 nm bis 1,98 μm herzustellen.

PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Polymer-Nanopartikel mit einstellbarer Größe herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Polymer in einem organischen Lösungsmittel gelöst und ein Wirkstoff oder ein fluoreszenter Einschlussstoff hinzugefügt wird. Im zweiten Schritt wird das Polymer mit einer wässrigen Phase, die ein Emulgiermittel enthält, emulgiert, und anschließend werden die Partikel in einem größeren wässrigen Volumen verfestigt, während das Lösungsmittel verdampft.Anschließend werden die Partikel gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt und zur Langzeitlagerung lyophilisiert. Der letzte Schritt besteht darin, Größe und Oberflächenmorphologie der Nanopartikel mittels Rasterelektronenmikroskopie oder REM-Bildgebung zu charakterisieren. Letztendlich dient die REM-Analyse dazu zu zeigen, dass die Größe der Nanopartikel durch Variation der Emulgator-Konzentration gesteuert werden kann.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie einer Vielzahl menschlicher Krankheiten, da Partikel maßgeschneidert werden können, um ein breites Spektrum therapeutischer Wirkstoffe zur langanhaltenden Wirkung einzuschließen und abzugeben. Im Zielgewebe. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend.Die Emulgierschritte sind schwierig zu erlernen, da subtile Aspekte der Emulsionsbildung einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Partikel haben können. Um mit der Herstellung von Nanopartikeln zu beginnen, geben Sie etwa 100 Milligramm Polylactid-co-glycolid-Säure, auch bekannt als PLGA, in ein 13 mal 100 Millimeter großes Reagenzglas. Übertragen Sie anschließend mit einer Glas-Serologiepipette ein Milliliter Ethylacetat zur Probe, bedecken Sie die Öffnung des Gefäßes mit Aluminiumfolie und verschließen Sie die Folie dann sicher mit Parafilm.Stellen Sie sicher, dass die Folie fest über die obere Kante des Vials und die untere Kante der Aluminiumfolie gezogen wird, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu verhindern. Kennzeichnen Sie den Füllstand des Lösungsmittels am Reagenzglas und lassen Sie das Polymer über Nacht auflösen. Am nächsten Tag geben Sie bei Bedarf zusätzliches Lösungsmittel hinzu, falls Verdunstung aufgetreten ist.Bereiten Sie die folgenden Geräte und Materialien in einem Abzug in der Nähe des Ultraschallgeräts vor. Vortexen Sie zwei kleine Glas-Pasteurpipetten mit Gummikolben und einem Magnetrührer. Stellen Sie außerdem einen großen Becher mit Eiswasser auf ein Stativ unterhalb des Ultraschallgeräts.Fügen Sie als Nächstes 45 Milliliter einer 0,3 % Gewicht pro Volumen enthaltenden Vitamin E-T-P-G-S-Lösung in ein 200-Milliliter-Glaskolben hinzu und stellen Sie anschließend die Rührgeschwindigkeit auf 360 U/min ein. Geben Sie dann 2 Milliliter der 0,3 % Gewicht pro Volumen enthaltenden Vitamin E-T-P-G-S-Lösung in ein 13 × 100 Millimeter großes Glasreagenzglas. Um hydrophobe Wirkstoffe einzumischen, fügen Sie das Einschlussmittel direkt der Polymerlösung hinzu, achten Sie darauf, die Wände des Reagenzglases zu vermeiden, und wirbeln Sie das Gefäß, bis das Einschlussmittel gleichmäßig dispergiert ist.Für hydrophile Wirkstoffe emulgieren Sie das Einschlussmittel mit der Polymerslösung. Geben Sie bis zu 50 Mikroliter Wirkstoff in Puffer auf die Oberfläche der Polymerslösung. Sonifizieren Sie das Gemisch auf Eis für etwa 10 Sekunden oder bis die Lösung trüb und homogen ist.Als Nächstes das Reagenzglas mit Vitamin E-T-P-G-S kräftig vortexen, wobei das Reagenzglas senkrecht gehalten wird. Die Glaspipette einen bis zwei Zentimeter über dem oberen Rand des vortexenden Reagenzglases halten und die Polymere Lösung tropfenweise langsam auf die Oberfläche des vortexenden Mediums geben. Achten Sie darauf, dass die Pipette die Wand des Reagenzglases nicht berührt, nachdem die gesamte Polymere Lösung zugegeben wurde.Setzen Sie das Vortexen der Lösung fort. Erzeugen Sie nun 15 Sekunden lang eine Emulsion. Überführen Sie die emulgierte Polymerlösung unverzüglich auf das Ultraschallgerät.Halten Sie das Reagenzglas in Eiswasser und beschallen Sie die Emulsion in drei Intervallen zu je zehn Sekunden. Bewegen Sie die Emulsion währenddessen gleichmäßig entlang der Sonde, um eine homogene Beschallung zu gewährleisten, und vermeiden Sie es, dass die Sonde die Wände oder den Boden des Reagenzglases berührt. Machen Sie zwischen jedem zehnsekündigen Beschallungsintervall eine Pause von fünf bis zehn Sekunden, damit sich die Lösung abkühlen kann, bevor Sie fortfahren.Anschließend ein bis zwei Milliliter der 0,3 %igen Vitamin E-T-P-G-S-Lösung aus der Rührlösung zur Emulsion hinzufügen. Dadurch wird das emulgierte Polymer verdünnt und leichter zu verarbeiten; die Emulsion anschließend in die Rührlösung einfüllen. Eventuell verbliebene Lösung aus dem Reagenzglas in die Rührlösung nachspülen.Lassen Sie die Nanopartikel unter Rühren drei Stunden lang aushärten. Falls das Umhüllungsmaterial lichtempfindlich ist, wickeln Sie das Becherglas in Aluminiumfolie ein und lassen Sie die Öffnung frei, um die Lösungsmittelverdunstung zu erleichtern. Um die Nanopartikel zu sammeln, geben Sie das Herzmaterial zunächst in zwei Oak-Ridge-Zentrifugenröhrchen mit einem Nennvolumen von jeweils 30 Milliliter auf und bringen Sie diese auf ein Gewichtsgefälle von maximal 0,1 Gramm zueinander ins Gleichgewicht. Zentrifugieren Sie anschließend die Nanopartikel 15 Minuten lang in einem Festwinkelrotor bei 17.000.RC f. Längere Zentrifugationszeiten führen zur Sammlung eines höheren Anteils kleinerer Nanopartikel. Entsorgen Sie den Überstand, wobei darauf zu achten ist, den Nanopartikelpellet nicht aufzuwirbeln.Gebe fünf Milliliter destilliertes Wasser hinzu und verwende ein Wasserbad, einen Homogenisator und einen Vortex, um die Nanopartikel vollständig zu suspendieren. Vereinige die Inhalte der beiden Zentrifugenröhrchen in einem und gib 20 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 30 Milliliter ergibt. Wiederhole anschließend die Zentrifugation und die Waschschritte zwei weitere Male, sodass insgesamt drei Waschungen durchgeführt werden.Das Flüssigkeitsvolumen der letzten Pellet-ReSuspension sollte vier bis fünf Milliliter betragen. Eine kleine Aliquotmenge der telosfreien Nanopartikel für die REM-Bildgebung einfrieren, den Rest aufbewahren. Als Kryoschutzmittel für eine gleichmäßige und vollständige ReSuspension von PLGA-Nanopartikeln ein Gewichtsverhältnis von eins zu zwei TLO zu Polymer hinzufügen.Dadurch werden Eisbildung verhindert, die die Partikeloberfläche beschädigen und Aggregation verursachen könnte. Überführen Sie die Nanopartikel in eine vorher gewogene 5-mL-Zentrifugenprobe, und gefrieren Sie diese anschließend mindestens 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Danach öffnen Sie die Probe und verschließen Sie die Öffnung, indem Sie ein Laborpapier mit einem Gummiring fest über die Öffnung spannen.Bei schneller Arbeitsweise, damit der Inhalt nicht schmilzt, falls eine Schmelzung auftritt. Vor dem Einbringen in den Gefriertrockner erneut einfrieren, dann die fünf Milliliter Probe 72 Stunden lang gefriertrocknen. Danach die Kappe wieder aufsetzen, das Gefäß verschließen und die lyophilisierten Partikel bei minus 80 Grad Celsius lagern.Am Tag der Bildgebung befestigen Sie einen Streifen doppelseitiges Kohlenstoff-Klebeband auf einem SEM-Präparat. Kennzeichnen Sie den metallischen Teil des Präparats mit einem Permanentstift zur späteren Identifizierung. Sammeln Sie mit einem Metallspatel eine kleine Menge lyophilisierter Nanopartikel und verteilen Sie diese vorsichtig auf der Oberfläche des Klebebands.Bürsten Sie die Oberfläche des Probenträgers mit Laborgewebe ab oder verwenden Sie Druckluft, um lose Nanopartikel zu entfernen. Visualisieren Sie die Partikel mit einem Arbeitsabstand von fünf bis 15 Millimetern, einer Strahlstärke von fünf bis 12 Kilovolt und einer Spotgröße von eins bis drei; höhere Strahlstärken können zu einer lokalen Erwärmung der Probe führen, wodurch die Oberflächenmorphologie der Partikel verändert wird. Mikropartikel werden bei 100-facher Vergrößerung beobachtet, Nanopartikel sind bei 3000-facher Vergrößerung erkennbar.Vergrößerung auf die Oberseite einer Kugel fokussieren, um Partikel zu lokalisieren, die leicht mit REM visualisiert werden können; mindestens drei Bilder pro Charge aufnehmen, um eine repräsentative Stichprobe hinsichtlich Partikelgröße und -morphologie zu erhalten. Mit dieser Methode können Partikel durch eine einzelne Emulsion erzeugt werden, die als einzelne, nicht miteinander verschmolzene Kugeln mit glatter Oberflächenmorphologie und einer breiten Größenverteilung über die Probe hinweg erscheinen. Die hier gezeigten Mikropartikel weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von 730 Nanometern auf.Hier gezeigte Nanopartikel wurden durch ein einziges Emulgator-Molekül hergestellt und umschließen den hydrophoben Wirkstoff Campin. Diese Partikel waren noch kleiner und wiesen einen durchschnittlichen Durchmesser von 340 Nanometern auf. Höhere Emulgator-Konzentrationen führten zu kleineren Partikeln, wobei die durchschnittlichen Durchmesser von 2000 auf 200 Nanometer abnahmen.Wenn die Emulgator-Konzentration von 0,01 auf 0,3 % anstieg, wie durch die hier gezeigten REM-Bilder dargestellt. Allerdings bildeten sich bei zu hoher Konzentration von Vitamin E-T-P-G-S keine diskreten Partikel mehr; bei Verwendung von 1 % Vitamin E-T-P-G-S wurden starke Verschmelzungen und flächige Strukturen im gesamten Material beobachtet. Richtig. Sobald man die Herstellung von PLG-Nanopartikeln mittels Emulgierung beherrscht, können weitere Methoden wie die Oberflächenmodifizierung angewendet werden, um Nanopartikel gezielt für die Interaktion mit bestimmten Zelltypen oder Körperregionen zu konstruieren.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Partikel mit reproduzierbarer und einstellbarer Größe durch Emulgierung herstellt.

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Biotechnik

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Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

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Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

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Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

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Injizierbare supramolekulare Polymer-Nanopartikel-Hydrogele für Zell- und Arzneimittelverabreichungsanwendungen

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Zelluläre Affinität der partikelstabilisierten Emulsion zur Förderung der Antigeninternalisierung

Lernen Sie die Herstellung von PLGA-Nanopartikeln mit einstellbarer Größe durch Emulgierung mit Vitamin E-TPGS. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Partikelgröße für gezielte Wirkstofffreisetzung.

PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

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