A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch
24. Oktober 2013
Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei zuvor beschriebene, durch Licht induzierte Protokolle zur Netzhautdegeneration zu kombinieren, um sowohl Stäbchen- als auch Zapfenphotorezeptoren in der gesamten Netzhaut zu schädigen. Dies wird erreicht, indem man zuerst dunkeladaptierte adulte Zebrafische 30 Minuten lang UV-Licht aussetzt. Im zweiten Schritt werden die mit UV-Bestrahlung behandelten Fische unverzüglich in Becken transferiert, die von vier 250-Watt-Halogenlampen umgeben sind, und anschließend bis zu vier Tage lang kontinuierlichem Licht ausgesetzt.
Der letzte Schritt besteht darin, den Fisch zu euthanasieren und die Augen zu entkernen, um weitere Analysen durchzuführen. Abschließend wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um den einheitlichen Verlust sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren im gesamten Retina nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einer UV-Behandlung oder einer Behandlung mit einer Halogenlampe liegt darin, dass die Kombination beider Methoden zur Ablation sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren im gesamten Retina führt.
Die Schädigung der Photorezeptoren löst eine umfassende Proliferationsreaktion aus, die letztendlich zur Regeneration der verlorenen Photorezeptoren führt. Diese Technik wird Jennifer Thomas, eine Doktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, eine umgedrehte Glas-Petrischale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern als Unterlage zu verwenden, und befestigen Sie sie mit Klebeband auf der Laborbank, um sie der UV-Lichtexposition auszusetzen.
Entfernen Sie das UV-Licht-Faden von dem fluoreszierenden Stereomikroskop. Befestigen Sie dann den UV-Licht-Faden oberhalb der umgedrehten Petrischale, wobei etwa zwei Millimeter des Endes des Fadens über die Petrischale hinausragen sollen. Danach bedecken Sie die untere Hälfte der Seitenwände und die Rückseite eines 250-Milliliter-Glasbechers mit Aluminiumfolie, wobei die glänzende Seite der Folie nach innen in den Becher weisen soll.
Füllen Sie anschließend den Becher mit 100 Milliliter Wasser aus dem Fischanlagensystem. Stellen Sie diesen Becher in einen vier Liter fassenden Becher. Füllen Sie dann den vier Liter Becher mit Wasser, bis der Wasserstand mit der 100-Milliliter-Markierung im 250-Milliliter-Becher abschließt.
Maximal 10 dunkelbehandelte Fische in das 250-Milliliter-Becherglas geben und dieses mit einem kleinen Stück Aluminiumfolie abdecken. Danach das gesamte Becherglas-Apparat unmittelbar neben dem UV-Faden aufstellen. Der Faden sollte die Außenseite des Vier-Liter-Becherglases berühren und auf den freiliegenden Teil des 250-Milliliter-Becherglases gerichtet sein.
Stellen Sie sicher, dass der 250-Milliliter-Becher mittig am Boden des Vier-Liter-Bechers positioniert ist. Danach platzieren Sie einen großen, undurchsichtigen Schirm hinter dem Vier-Liter-Becher, sodass die Tiere exponiert werden können, der Schirm aber verhindert, dass Laborpersonal die Spitze des UV-Fadens sieht. Schalten Sie anschließend die UV-Stromquelle ein.
Stellen Sie den Timer auf 30 Minuten und bringen Sie die erforderlichen Warnhinweise an, um sicherzustellen, dass unbefugte Laborpersonal nicht versehentlich UV-Strahlung ausgesetzt wird. Nach 30 Minuten schalten Sie die UV-Stromquelle aus. Entfernen Sie dann den 250 Milliliter-Becher mit den Fischen.
Überführen Sie in diesem Verfahren die Fische aus dem 250-Milliliter-Becher in ein 1,8-Liter-Klaraquarium aus Acryl. Füllen Sie anschließend das Aquarium bis zur Überlaufmarkierung, um den Bereich für die Lichtbehandlung mit der Halogenlampe einzurichten. Platzieren Sie zwei 250-Watt-Halogenarbeitsleuchten in gleicher Richtung und im Abstand von 29 Zentimetern zum Aquarium.
Danach die beiden anderen Lampen in ähnlicher Weise auf der gegenüberliegenden Seite platzieren, wobei ein Abstand von etwa 73 Zentimetern zwischen den beiden Lampensätzen verbleibt. Anschließend den Ventilator gleich weit entfernt zwischen den beiden Lampensätzen direkt außerhalb des Lichtbehandlungsbereichs positionieren. Danach zwei 1,8-Liter-Behälter, gefüllt mit Wasser, in der Mitte des Lichtbehandlungsbereichs platzieren, jeweils gleich weit von beiden Lampensätzen entfernt.
Danach einen Sauerstoffbelüfter in jeden Behälter stellen. Jeden Behälter mit klaren Acryldeckeln abdecken, wobei am Ende, das am nächsten zum Ventilator liegt, ein zwei Zentimeter großer Spalt verbleibt. Den Ventilator so positionieren, dass er Luft in diesen Spalt bläst, und ein Thermometer in einen oder beide Behälter legen.
Schalten Sie anschließend die Stromversorgung für die Lichter, den Ventilator und die Belüfter ein. Führen Sie die Lichtbehandlung bis zu vier Tage lang durch. Die Fische sollten während der Lichtbehandlung nicht gefüttert werden, da dies die Wasserqualität beeinträchtigen und die Tiere zusätzlich belasten würde.
Überwachen Sie die Temperatur und den Wasserstand täglich und halten Sie die Temperatur bei 30 bis 33 Grad Celsius. Passen Sie gegebenenfalls die Lüftergeschwindigkeit sowie den Abstand zwischen den Becken und den Lampen an. Füllen Sie außerdem jedes Becken täglich mit Systemwasser auf.
48 Stunden nach Beginn der Behandlung mit Halogenlicht entfernen Sie die Fische aus dem Behandlungsbereich. Bereiten Sie anschließend frisches Ethanol-Formalin als Fixierungsmittel vor, um die Zebrafische durch eine Überdosis des Anästhetikums Tuen Oxy Ethanol zu euthanasieren. Danach überführen Sie die euthanasierten Zebrafische auf ein Papiertuch und enukleieren Sie das Auge mit einer Pinzette mit gebogenen Spitzen.
Bewahren Sie die enucleierten Augen und das Fixierungsmittel über Nacht bei vier Grad Celsius zum Einfrieren auf. Schützen Sie die Augen. Waschen Sie sie bei Raumtemperatur 30 Minuten lang in 5 % Saccharose in 1x PBS.
Danach durch frische 5%ige Saccharoslösung in 1× PBS ersetzen und die Augen zwei Stunden lang aufbewahren. Nach zwei Stunden die Augen über Nacht bei vier Grad Celsius in 30%iger Saccharoslösung in 1× PBS waschen. Am nächsten Tag die Augen über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Gemisch aus Gewebe, Einfriermedium und 30%iger Saccharoslösung in 1× PBS im Verhältnis 1:1 waschen.
Anschließend die Augen in 100 % Gewebefrieremedium einbetten, ausgerichtet auf der dorsoventralen Achse. Danach mindestens zwei Stunden bei minus 80 Grad Celsius lagern, bevor das Gewebe kryosektioniert wird. Nun das Gewebe kryosektionieren und auf Objektträger aufbringen.
Anschließend die Objektträger zwei Stunden lang bei 55 Grad Celsius erwärmen. Danach die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius lagern oder unmittelbar eine Standard-Immunhistochemie durchführen und mit fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung analysieren. Diese Abbildung zeigt die Veränderungen der Proliferationsantwort nach verschiedenen Lichtschädigungs-Paradigmen.
Hier sind die Netzhautschnitte eines adulten albino Zebrafisches, immunmarkiert mit PCNA, um die Zellproliferation in Rot angezeigt in den dorsalen und ventralen Hälften der Netzhaut nach verschiedenen Lichtschädigungsparadigmen zur Zeit null Stunden zu zeigen. Proliferation fehlte in der interklaren Schicht bei 48 HLT. Einzelne Vorläuferzellen waren in der INL über die dorsale Netzhaut und in einem kleinen Bereich der ventralen Netzhaut vorhanden.
48 HPUV. In der dorsalen Netzhaut waren Säulen von Vorläuferzellen vorhanden, während im ventralen Netzhautbereich nur einzelne Vorläuferzellen in einem kleinen Abschnitt zu finden waren. Bei UV plus 48 waren große Säulen von Vorläuferzellen über die dorsale und ventrale Netzhaut verteilt vorhanden.
Diese Abbildung zeigt den Verlust von Stab- und Zapfenphotorezeptoren bei pigmentierten Zebrafischen nach verschiedenen Lichtschädigungs-Paradigmen. Hier sind Netzhautschnitte mit Pro drei gefärbt, um die Kerne in Blau darzustellen, und immunmarkiert mit zpr R drei, um die äußeren Stabsegmente in Magenta oder mit zpr R eins, um Doppelzapfen in Gold darzustellen, jeweils nach den einzelnen Lichtschädigungs-Paradigmen. Signifikante Abnahmen der Kerne der Stabphotorezeptoren waren in der dorsalen Netzhaut nach 48 HLT sowie in der dorsalen und ventralen Netzhaut nach UV plus 48 HLT vorhanden.
Obwohl die Kerne in der dorsalen Netzhaut bei 48 HPUV hypertrophiert waren, wurden bei 48 HLT oder 48 HPUV keine signifikanten Abnahmen der Doppelkegelpakete beobachtet. Signifikante Abnahmen der Kerne traten in der dorsalen und ventralen Netzhaut bei UB plus acht H lt auf. Die Kombination dieses Verfahrens mit anderen Methoden wie gen-spezifischen pharmakologischen Inhibitoren oder der in-vivo-Proteinknockdown-Technik kann Aufschluss über die Rolle einzelner Gene bei der Photorezeptor-Degeneration und der anschließenden Regenerationsreaktion geben.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Induktion der Netzhautdegeneration bei adulten Zebrabärblingen durch Schädigung sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenzellen. Die Technik kombiniert die Exposition gegenüber UV-Licht mit einer Dauerbeleuchtung, um einen umfassenden Verlust der Photorezeptoren über die gesamte Netzhaut hinweg zu erzielen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Retinale Regeneration
- Photorezeptorbiologie
Hintergrund
- Photorezeptoren sind entscheidend für das Sehen, und ihre Schädigung kann zu erheblichen Sehbeeinträchtigungen führen.
- Zebrafische sind ein wertvolles Modell zur Untersuchung der Regeneration der Netzhaut aufgrund ihrer regenerativen Fähigkeiten.
- Bestehende Methoden zur Induktion von Netzhautschäden weisen Einschränkungen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf.
- Das Ziel dieser Studie ist es, die Methoden zur Verbesserung der Photorezeptorablation zu optimieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Induktion der Netzhautdegeneration beim Zebrafisch.
- Gewährleistung einer Schädigung sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren.
- Erleichterung weiterer Analysen der Mechanismen der Netzhautregeneration.
Verwendete Methoden
- Dunkeladaptierte adulte Zebrafische werden 30 Minuten lang UV-Licht ausgesetzt.
- Anschließend werden die Fische in Becken mit Halogenlampen überführt, um sie bis zu vier Tage lang kontinuierlichem Licht auszusetzen.
- Nach der Exposition werden die Fische euthanasiert und die Augen enukleiert, um sie zu analysieren.
- Mithilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie wird der Verlust von Photorezeptoren bewertet.
Hauptergebnisse
- Ein konsistenter Verlust sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren wurde im gesamten Retina beobachtet.
- Die kombinierte Lichtexpositions-Methode erwies sich als effektiver als frühere Protokolle.
- Diese Technik ermöglicht eine umfassende Analyse der degenerativen und regenerativen Vorgänge in der Retina.
- Die Ergebnisse stützen die Anwendung dieser Methode für zukünftige Studien in der Retinabiologie.
Schlussfolgerungen
- Das verbesserte Protokoll schädigt erfolgreich beide Arten von Photorezeptoren.
- Diese Methode kann in verschiedenen Studien zur Netzhautregeneration eingesetzt werden.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um therapeutische Ansätze zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll begegnet einer zentralen Herausforderung in der Forschung zur Netzhautregeneration, indem es eine konsistente Ablation sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren bei adulten Zebrafischen ermöglicht, einem Modell mit hoher translationaler Relevanz für menschliche Netzhauterkrankungen. Der kombinierte Ansatz aus UV- und Halogenlicht erhöht die Vorhersagesicherheit bei mechanistischen Studien, da die Variabilität des Degenerationsumfangs verringert wird, und unterstützt so eine zuverlässigere Validierung von Zielstrukturen sowie die Untersuchung von Signalwegen. Dadurch stellt die Methode ein skalierbares Werkzeug dar, um frühe Entdeckungsansätze bei Strategien zur Reparatur von Photorezeptoren risikoärmer zu gestalten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Induktion eines weitverbreiteten, reproduzierbaren Verlusts von Photorezeptoren, um Regenerationsmechanismen zu untersuchen.
- Operationaler Wert: Bietet ein standardisiertes Degenerationsmodell, das eine konsistente Quantifizierung der Progenitorzellantwort über verschiedene Experimente hinweg ermöglicht.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in Target-Engagement-Studien, indem sichergestellt wird, dass sowohl Stäbchen- als auch Zapfenwege einheitlich betroffen sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt einen quantifizierbaren Degenerations-Regenerations-Endpunkt, der mit immunfluoreszenzbasierten Proliferations- und Photorezeptormarker-Assays kompatibel ist.
- Operativer Wert: Unterstützt die Assay-Standardisierung durch definierte Lichtexpositionsparameter (30 min UV + bis zu 4 Tage Halogen), die sowohl bei pigmentierten als auch bei albinotischen Stämmen anwendbar sind.
- Skalierbarkeit: Macht transgene albinotische Linien überflüssig und ermöglicht den Einsatz in genetisch vielfältigen Hintergründen oder Krankheitsmodellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Induktion der Degeneration mit messbaren Regenerationsergebnissen und unterstützt die präklinische Bewertung pro-regenerativer Substanzen.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die Kombination mit gen-spezifischen Inhibitoren oder Genabschaltungen, um die individuellen Genfunktionen bei Degeneration und Reparatur zu untersuchen.
- Vorhersagegenauigkeit: Ermöglicht die dosis- und zeitabhängige Analyse der Proliferation von Vorläuferzellen und der Reformation von Photorezeptoren zur Optimierung von Leitsubstanzen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und dient als standardisiertes Schädigungsmodell, um Regenerationsstudien einzuleiten, bevor Wirkstoff-Screenings oder Zielvalidierungsansätze durchgeführt werden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich Photorezeptor-Degenerationswegen und gliazellvermittelter Progenitoraktivierung.
- Screening: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse (z. B. PCNA+ Progenitoren, Verlust von Photorezeptormarkern) zur Beurteilung von Substanzeffekten.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich des Ausmaßes der Degeneration und der Regenerationskinetik unter verschiedenen Bedingungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem menschenrelevante Prozesse des Photorezeptorverlusts und der Reparatur modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Degenerationsplattform, die in mehreren Projekten zur Netzhautreparatur eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen durch eine konsistente, pan-photorezeptorale Ablation.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Lichtexposition und Umweltkontrollen (Temperatur, Wasserqualität, Fütterung).
- Strategischer Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit von Go/No-Go-Entscheidungen, indem biologisches Rauschen bei Regenerationsmessungen minimiert wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Regenerationswirksamkeit in einem validierten, krankheitsrelevanten System.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zebrafischaufzucht, Sicherheitsprotokollen beim Umgang mit Licht sowie der Gewebeaufbereitung für die Kryoschnitte.
- Benötigt eine UV-Lichtquelle, Halogenlampen, temperaturgesteuerte Becken und Infrastruktur für die Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Setzt eine Standardisierung der Dunkeladaptierung, der Dauer der Lichtexposition und der Umweltüberwachung über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Muss artenspezifische Lichtempfindlichkeit berücksichtigen, wenn das Verfahren auf andere Modelle übertragen wird.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit der Dunkeladaptierung und einer spezialisierten Geräteausstattung, wird jedoch durch detaillierte experimentelle Anleitungen unterstützt.
