Name: A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Erfahren Sie ein verbessertes Protokoll zur Induktion von Netzhautdegeneration bei adulten Zebrafischen durch kombinierte UV- und Halogenlichtexposition. Diese Methode ermöglicht gezielte Schädigung von Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren für Regenerationsstudien.

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Die Autoren möchten Xixia Luo für exzellente Fisch Tierhaltung und technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschüsse R21EY019401 (RT) und P30EY04068 (RT) finanziert, und Start-up-Fonds auf RT, darunter eine nicht zweckgebundene Zuwendung von der Forschung bis zur Blindheit Wayne State University, Department of Ophthalmology verhindern. JT wurde von einem Thomas C. Rumble Fellowship von der Wayne State University Graduate School vorgesehen ist.

Alle Vorgänge in diesem Protokoll beschrieben wurden durch die Verwendung von Tieren Ausschuss an der Wayne State University School of Medicine genehmigt. 1. Dunkle Anpassung <ol><li> Übertragen ~ 10 erwachsene Albino oder pigmentierte Fisch aus dem normalen Gehäuse-System in einen dunklen Schrank. Wenn vorhanden, mit einem dunklen Gehäuse, in das Gehäuse Zebrafisch-Modul, das für die normale Wassermenge durch den Tank ermöglicht gebaut wird. (Wenn ein solches System nicht verfügbar ist, legen Sie das Aquarium in einem völlig dunklen Gehäuse, achten Sie darauf, die Fische mit Sauerstoff belüften). </li><li> Halten Sie den Fisch in der Dunkelheit für 10 Tage. Bei der Fütterung der Tiere oder das Hinzufügen neuer Fisch an den dunklen Kasten, vergewissern Sie sich so schnell wie möglich zu bewegen, um zu vermeiden, dass die Fische mit einem langen Zeitraum des Lichts. </li></ol> 2. UV-Licht Exposition <ol><li> Sicherstellen, dass die Stromversorgung der UV-Quelle ist AUS. Entfernen Sie das UV-Licht fluoreszierenden Filament aus Stereomikroskop. <ol><li> Verwenden Sie einen umgekehrten15 cm Durchmesser Glas Petrischale (oder etwas von einem ähnlichen 2 cm Höhe) als Ständer für die UV-Filament. Kleben Sie die Petrischale auf dem Labortisch. </li><li> Kleben Sie die UV-Licht Filament des umgekehrten Petrischale oben. So anzuordnen, dass ca. 2 mm von dem Ende des Filaments Überhänge die Petrischale. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich einen 250 ml Becherglas. Titelbild ½ der Boden, Seiten und Rückseite des Bechers mit Alufolie, so dass das &quot;glänzende&quot; Seite der Folie steht das Innere des Bechers. Wenn der Becher ist abgestuft, decken Sie den Wortlaut Hälfte des Bechers mit Folie, so dass die klare Hälfte des Bechers ausgesetzt. </li><li> Füllen Sie den 250-ml-Becherglas mit 100 ml Wasser aus dem Fisch Facility Systeme. </li><li> Legen Sie die 250 ml Becherglas in einem 4 L Becherglas. Füllen Sie den 4 L Becherglas mit Wasser, bis der Wasserstand sogar mit dem 100 ml Wasser-Linie in der 250 ml-Becher ist. </li><li> In maximal 10 dunkel-behandelten Tieren der 250-ml-Becherglas. Bedecken Sie den 250-ml-Becherglas mit einem kleinen Stück aus Aluminiumvereiteln. </li><li> Platzieren Sie den ganzen Becher Apparat unmittelbar neben dem UV-Filament. Der Faden soll an die Außenseite des 4 L-Becherglas gegeben und mit Blick auf den freiliegenden Teil der 250-ml-Becherglas. Stellen Sie sicher, dass die 250-ml-Becherglas in den Boden des 4 L Becherglas zentriert ist. </li><li> Positionieren Sie einen großen, undurchsichtigen Schirm hinter dem 4L Becherglas, so dass für die Tiere ausgesetzt werden, sondern die Verhinderung jeglicher Laborpersonal vom Sehen der Spitze des UV Filament. WARNUNG: Stellen Sie sicher, dass diese Barriere ist, bevor Sie das Gerät einschalten, um die UV-Quelle. </li><li> Schalten Sie die UV-Stromquelle. Set Timer für 30 min. Platzieren, was notwendig Warnschilder um sicherzustellen, dass ahnungslose Laborpersonal nicht versehentlich setzen sich gegen UV-Strahlung. </li><li> Nach 30 min, Absperren der UV Stromquelle. Nehmen Sie die 250 ml-Becher mit dem Fisch. Hinweis: Wenn mehrere Runden von UV-Belichtung, die erforderlich sind, lassen Sie die Stromquelle abkühlen (~ 20 min) vor der Wiederholung der Exposition Protokoll. Achten Sie darauf, t ersetzener 100 ml Wasser mit frischem Wasser-System für jede Aufnahme. Das Wasser im 4 L Becherglas nicht ersetzt werden müssen. </li></ol> 3. Halogen Lamp Light Exposure <ol><li> Übertragen Sie die Fische aus 250 ml Becherglas in einem 1,8 L klaren Acryl-Aquarium. Füllen Sie den Tank bis zum Überlauf Marke. </li><li> Richten Sie das Licht einer Halogenlampe Behandlungsbereich. Erhalten vier 250 W Halogen-Lampen-Dienstprogramm von einem lokalen Baumarkt. Mit Blick auf zwei Lampen in der gleichen Richtung, ordnen 29 cm auseinander auf Mitte. Ordnen Sie die anderen zwei Lampen in einer ähnlichen Weise. <ol><li> Platzieren des zweiten Satzes von Lampen, so dass sie gegenüber dem ersten Satz von Lampen, wobei ~ 73 cm zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Dies erzeugt eine Rechteck-Form-Licht Behandlung Fläche von 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich einen kleinen Ventilator von einem lokalen Baumarkt. Platzieren Sie den Lüfter genau zwischen den beiden Gruppen von Lampen, etwas außerhalb des Licht-Behandlung Bereich. </li><li> Legen Sie zwei 1,8 L Behälter voll Wasser in der Mitte desLicht Behandlungsbereich, genau zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Der Abstand zwischen den Lampen und der Außenwand des Behälters sollte ~ 29 cm betragen. Hinweis: Selbst wenn nur die Behandlung von 10 Fische in einem 1,8 l-Tank, verwenden diese Anordnung. Beide Behälter sind erforderlich, um die Temperatur des Wassers von jedem Behälter in dem geeigneten Bereich zu halten. </li><li> Legen Sie ein Sauerstoff-Luftsprudler in jedem Tank. </li><li> Cover jede Tank mit klarem Acryl Deckel, so dass ein ~ 2 cm Lücke am Ende in der Nähe des Lüfters. Ordnen Sie den Lüfter so, dass es Luft in diesen Spalt blasen wird. Setzen Sie ein Thermometer in einem oder beiden der Tanks. </li><li> Schalten Sie das Gerät auf die Lichter, Lüfter-und Belüfter. Pflegen Licht-Behandlung für bis zu 4 Tage. Der Fisch sollte nicht während der Licht-Behandlung zugeführt werden, da dies die Wasserqualität und führen zu mehr Stress für die Tiere zu beeinträchtigen. </li><li> Überwachen Temperatur und Wasserstand auf einer täglichen Basis. Pflegen Sie die Temperatur bei 30-33 ° C. Wenn nötig, stellen Sie die Lüftergeschwindigkeit und / oder den Abstand zwischen den Tanks und der lights. <ol><li> Krönung jeder Tank mit Wasser-System nach Bedarf, in der Regel täglich. </li><li> Verwenden Sie immer gesunden erwachsenen Zebrafisch (in der Regel 6-9 Monate alt), um eine Überlebensrate von nahezu 100% zu halten. Allerdings, wenn ein Fisch tot im Becken gefunden, entfernen Sie es sofort, und ersetzen Sie das Wasser im gesamten Tank. </li></ol></li></ol> 4. Gewebeentnahme <ol><li> 48 Stunden nach Beginn der Behandlung zu entfernen Halogenlicht die Fische aus dem Behandlungsbereich. <ol><li> Bereiten Sie frischen ethanolischen Formaldehyd Fixativ (1 Teil 37% Formaldehyd, 9 Teilen 100% Ethanol). </li><li> Euthanize Zebrafisch mit einem Anästhetikum Überdosierung von 2-Phenoxyethanol (0,4 mg / L). </li><li> Übertragen Sie die eingeschläfert Zebrafisch zu einem Papiertuch. Enucleate das Auge mit einer gebogenen Pinzette. </li><li> Zeigen entkernte Augen in Fixiermittel und Speicher O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect die Augen. <ol><li> Waschen der Augen in 5% Saccharose 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur gerührt, dann mit ersetzenfrische 5% Saccharose 1x PBS für 2 Stunden. Anschließend waschen Sie die Augen in 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. Waschen der Augen in einem 1:1 (gleiche Teile) des Gewebes Einfriermedium und 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Integrieren Sie die Augen in 100% Gewebe Einfrieren Medium und bei -80 ° C Orient die Augen, so daß Kryoschneiden des Gewebes auf der dorsal / ventral Achse. </li><li> Kryoschnitt das Gewebe und auf Glasplatten. Warm Folien für 2 Stunden bei 55 ° C. Shop Objektträger bei -80 ° C oder sofort ausführen Standard Immunhistochemie. </li><li> Führen Standard Immunhistochemie auf geschnittene Gewebe und Bild mit Fluoreszenzmikroskopie 40,51. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zeigen wir, dass die Kombination eine kurze UV-Bestrahlung mit einer kontinuierlichen helles Licht Exposition Ergebnisse in weit verbreiteten Photorezeptor Verlust und eine robuste Regeneration Antwort. Verglichen mit den einzelnen LIRD Methoden ist dies kombiniert Verfahren auch die effektivste Protokoll sowohl Stäbchen und Zapfen in beiden Hälften der Netzhaut beschädigen. Wichtig ist, dass diese Behandlung wirksam bei pigmentierten Tieren sowie Albinos. Obwohl wir den Beweis...

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

<table><tbody><tr><td>UV-Lichtquelle</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>Glas Petrischale (150 x 20 mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Glasbecher</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 L Glasbecher</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W Halogen Lampen</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1,8 L klare Acryltanks</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1,8 L klare Acryl Tankdeckel</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>Fan Honeywell</td><td></td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>Belüfter</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen Pinzette (5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel leichte schäden paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafisch

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

Die bisher beschriebenen Licht-Behandlung Protokoll wurde zu jedem einzelnen Verfahren LIRD verglichen. In dunkel-behandelten erwachsenen Albinos (Abbildungen 3-5), führte die einzelnen Licht-Behandlungen in signifikanten Verlust der Stange (Abbildung 3) und Kegel (Abbildung 4) Photorezeptoren. Doch sowohl die einzelnen Behandlungen in erster Linie Photorezeptoren in der dorsalen Hälfte der Netzhaut beschädigt, so dass der ventralen Retina relativ von den Licht...

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei zuvor beschriebene, durch Licht induzierte Protokolle zur Netzhautdegeneration zu kombinieren, um sowohl Stäbchen- als auch Zapfenphotorezeptoren in der gesamten Netzhaut zu schädigen. Dies wird erreicht, indem man zuerst dunkeladaptierte adulte Zebrafische 30 Minuten lang UV-Licht aussetzt. Im zweiten Schritt werden die mit UV-Bestrahlung behandelten Fische unverzüglich in Becken transferiert, die von vier 250-Watt-Halogenlampen umgeben sind, und anschließend bis zu vier Tage lang kontinuierlichem Licht ausgesetzt. Der letzte Schritt besteht darin, den Fisch zu euthanasieren und die Augen zu entkernen, um weitere Analysen durchzuführen. Abschließend wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um den einheitlichen Verlust sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren im gesamten Retina nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einer UV-Behandlung oder einer Behandlung mit einer Halogenlampe liegt darin, dass die Kombination beider Methoden zur Ablation sowohl der Stäbchen- als auch der Zapfenphotorezeptoren im gesamten Retina führt.Die Schädigung der Photorezeptoren lös

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Induktion von Netzhautdegeneration bei erwachsenen Zebrafischen mittels Laserverletzung. Der Laser zielt auf Photorezeptorzellen in der Netzhaut ab und löst den Zelltod und einen degenerativen Prozess aus. Diese Schädigung aktiviert Müller-Gliazellen (MG), was zu ihrer Dedifferenzierung in Stammzellvorläuferzellen führt, die die Regeneration der Netzhaut unterstützen.

Modellierung der Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch mit Hilfe einer fokalen Laserverletzung

Wir stellen eine effiziente Methode zur retrograden Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in adulten Zebrafischen vor.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Erfahren Sie ein verbessertes Protokoll zur Induktion von Netzhautdegeneration bei adulten Zebrafischen durch kombinierte UV- und Halogenlichtexposition. Diese Methode ermöglicht gezielte Schädigung von Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren für Regenerationsstudien.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

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