Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chimäre humane FC-Proteine mittels Protein A-Membranabsorbern und einem optimierten Arbeitsablauf effizient und zuverlässig zu isolieren und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Zellkulturüberstand mit einem 0,22-Mikron-Filter geklärt wird. Im zweiten Schritt wird das Durchflusssystem aufgebaut und die Perfusion des Zellkulturüberstands durch den Protein A-Membranabsorber eingeleitet.

Anschließend wird das humanen FC exprimierende Protein vom Membranabsorber eluiert, wobei das resultierende EIT durch Ultrafiltration angereichert und anschließend durch Dialyse in einen anderen Puffer überführt wird. Die abschließenden Schritte bestehen darin, mittels Durchflusszytometrie und Western Blotting Qualität und Quantität des angereicherten Proteins zu bestimmen. Letztendlich zeigen Protein-A-Membranabsorber zusammen mit einem optimierten Arbeitsablauf eine Verringerung der Bearbeitungszeit und eine potenzielle Steigerung der Proteinausbeute im Vergleich zur herkömmlichen Affinitätschromatographie mit Protein-A-Schnellladesäulen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Säulenaffinitätschromatographie besteht daher darin, dass der Membranabsorber potenziell höhere Ausbeuten des Proteins bei kürzerer Verarbeitungszeit ermöglicht. Die Auswahl geeigneter Charakterisierungsmethoden kann die Verarbeitungszeit ebenfalls verkürzen. Bereiten Sie den Membranabsorber gemäß den Herstelleranweisungen vor, wobei sichergestellt werden muss, dass alle durchströmten Lösungen Raumtemperatur haben und zuvor durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert wurden. Füllen Sie zunächst eine 10-Milliliter-Spritze mit 0,22-Mikron-gefiltertem KO’s PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) oder DPBS und entfernen Sie alle Luftblasen.

Um sicherzustellen, dass keine Luft in den Membranabsorber gelangt, spülen Sie diesen mit DPBS durch, um die Lagerungslösung zu entfernen und den Membranabsorber unmittelbar vor der Anwendung zu equilibrieren. Filtern Sie das Zellkulturüberstand unmittelbar vor der Perfusion durch den Membranabsorber mit einer vakuumgetriebenen sterilen Filtrationseinheit mit 0,22 Mikron, um den Protein A-Membranabsorber zu beladen; aspirieren Sie den Zellkulturüberstand in eine Luer-Verschluss-Spritze und entfernen Sie alle Luftblasen, um die Materialien und Geräte zusammenzustellen. Verbinden Sie zunächst die Spritze mit dem Einlass des Membranabsorbers.

Verbinden Sie bei Bedarf einen Schlauch mit dem Auslass des Membranabsorbers. Schließen Sie einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter zwischen Spritze und Membranabsorber an. Verwenden Sie ein Gefäß oder eine Flasche, um die Durchflüssigung aus dem Absorber aufzufangen.

Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte volumetrische Durchflussrate ein, überschreiten Sie dabei jedoch nicht die vom Hersteller empfohlene Durchflussrate. Perfundieren Sie das Zellkulturüberstand durch den Membranabsorber und sammeln Sie den Durchfluss auf. Laden Sie die Spritze bei Bedarf erneut mit Überstand auf.

Falls gewünscht, testen Sie den Durchlauf auf das Vorhandensein von Protein mittels Durchflusszytometrie, Western Blotting oder ELISA, basierend auf den Präferenzen des Labors; es ist in der Regel nicht notwendig, den Durchlauf erneut durchzuführen, um das Protein vom Membranabsorber zu eluieren. Spülen Sie zunächst den Membranabsorber mit 10 Milliliter DPBS, um nicht gebundenes Protein zu entfernen. Eluieren Sie das Protein vom Membranabsorber mit der gewünschten Flussrate.

Unter Verwendung von 10 bis 15 Milliliter Elutionspuffer. Sammeln Sie das EIT in einem Reagenzglas, das Neutralisierungspuffer in einem Volumen von 10 % des Elutionsvolumens enthält. Regenerieren Sie den Membranabsorber nach dem Eluieren des Proteins gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Füllen Sie den Membranabsorber mit 20 % Ethanol in DPBS für die Langzeitlagerung bei vier Grad Celsius. Geben Sie das gesamte EIT in eine Zentrifugalfiltereinheit mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 10 Kilodalton.

Befolgen Sie die Herstelleranweisungen für die Zentrifugation und Dialyse. Das Retentat in einer kleinen Dialyseeinheit mit einer Molekularmassengrenze von 10 Kilodalton gegenüber dem gewünschten Puffer; möglicherweise muss Puffer zum dialysierten Material hinzugefügt werden.

Wenn eine Proteinfällung problematisch ist, trennen Sie das gereinigte Protein und die FC-Standardproben gemäß Wunsch im gewünschten Gel mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen auf. Verwenden Sie ein Mini-Gel, um die Laufzeit zu minimieren, und laden Sie mehrere Probemengen des gereinigten Proteins auf, einschließlich Proben, die mit DPBS verdünnt wurden, um sicherzustellen, dass die Bandensignale des gereinigten Proteins innerhalb des linearen Signalbereichs der FC-Standards liegen. Führen Sie nach der Geltrennung im Rahmen der Bildanalyse den Proteintransfer vom Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran in einem diskontinuierlichen Puffersystem mittels Semi-Trocken-Blotter gemäß Herstelleranleitung durch; die Transferzeit beträgt typischerweise fünf bis zehn Minuten.

Färben Sie das Gel nach dem Transfer mit Kumasi, um die Transfereffizienz zu überprüfen. Führen Sie das Immunoblotting mit anti-FC- oder anti-IgG-Antikörpern durch, die an alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase gekoppelt sind, unter Verwendung eines vakuumunterstützten Proteinnachweises. Die Dauer des Immunoblottings beträgt typischerweise weniger als eine Stunde.

Entwickeln Sie den Immuno-Blot unter Verwendung des gewünschten Substrats und der gewünschten Methode. Quantifizieren Sie das gereinigte Protein mittels Bildanalyse. Führen Sie eine lineare Regression der Bandensignale aus den FC-Standards durch.

Wenn das Bestimmtheitsmaß R² größer als 0,90 ist, verwenden Sie die Gleichung der Geraden, um die Proteinmenge anhand des Bandsignals zu berechnen, wobei gegebenenfalls die Probenverdünnung berücksichtigt wird. Da die Quantifizierung des Proteins auf der Basis von fc erfolgt, muss der Wert aufgrund von Unterschieden in den Molekulargewichten zwischen dem Protein und fc angepasst werden. Wenn das Bestimmtheitsmaß R² kleiner als 0,90 ist, wiederholen Sie das beschleunigte Western-Blot-Verfahren.

Schließlich validieren Sie das Protein mithilfe funktioneller Assays oder Methoden zum Nachweis von FC per Durchflusszytometrie. Zum Testen des Vorhandenseins funktioneller GAL one HFC im Überstand der Startzellkultur wurde entweder Western-Blotting oder EISA-Durchflusszytometrie verwendet, wie durch das blaue Histogramm angegeben; frisches Zellkulturmedium, das hier in Rot dargestellt ist, diente als negativer Kontrollwert. Diesem überlagert ist in Grün der Durchlauf, was darauf hinweist, dass der Membranabsorber GAL one HFC effizient erfasst und zurückgehalten hat. GAL one HFC wurde in Inkrementen von je einem Milliliter bei einer Rate von einem Milliliter pro Minute mit einem aminbasierten sauren Puffer eluiert, und die neutralisierten Elutionsfraktionen wurden anschließend auf das Vorhandensein funktioneller GG one HFC mittels Durchflusszytometrie getestet. Das GL one HFC-Signal stieg sequenziell von Elution eins – etwa gleich dem negativen Kontrollwert – bis zu einem Maximum bei EEU drei an und nahm danach auf ein nahezu konstantes Niveau bei den Elutionen neun und zehn ab.

Die endgültige EEU 10 erreichte aufgrund einer geringen Retention des Adsorptionsmittels keine Äquivalenz zum negativen Kontrollsignal bei der GL-eins-HFC-Quantifizierung. Die Charakterisierung des gereinigten GL-eins-HFC erfolgte mittels einer Western-Blot-Analyse, die durch einen Halb-Trocken-Transfer und eine vakuumunterstützte Immundetektion beschleunigt wurde. Durch den Vergleich des GA-eins-HFC-Signals mit HFC-Quantifizierungsstandards wurden sowohl Menge als auch Qualität des gereinigten Materials bestimmt.

Die Signale von GAL one HFC und abgebautem GAL one HFC lagen innerhalb des Standardbereichs. Die Signalintensitäten der HFC-Standardbänder standen linear in Beziehung zur Menge des vorhandenen HFC. Die Konzentration von gereinigtem GAL one HFC bezogen auf HFC wurde mittels Bildverarbeitung zu 450 Mikrogramm pro Milliliter bestimmt.

Umrechnung unter Berücksichtigung des Molekulargewichts von G einem HFC. Die Konzentration des gereinigten Materials betrug 720 Mikrogramm pro Milliliter. Im Gegensatz dazu wurde in den Kanälen sechs und sieben der hier gezeigten Western Blot zu viel gereinigtes GAL ein HFC aufgetragen, was Signale erzeugte, die die HFC-Standardreihe überlasteten oder überschritten, wodurch eine Quantifizierung verhindert wurde.

Eine Alternative zur Western Blotting ist die Kumasi-Gel-Färbung, die als schnelle Qualitätskontrolle und/oder Quantifizierungsmethode dienen kann. Beachten Sie, dass ein Band bei etwa 10 Kilodalton sowie Bänder bei etwa 25 Kilodalton und 40 Kilodalton in der abgebauten GAL-eins-HFC-Probe vorhanden waren. Dieses Band stellt abgebauten GAL-eins-HFC dar, der nicht mit dem bei Western Blots verwendeten Detektionsantikörper reagiert hat.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man chimäre, humane FC exprimierende Proteine mithilfe von Membranabsorbern isoliert und diese Proteine innerhalb von nur vier Stunden charakterisiert.