Name: Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Präparation von Aplysia-Ganglien für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genexpression und neuronalen Eigenschaften.

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Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica
<ol><li>Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.</li>
	<li>Isolierung von Bauchganglien.<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).</li>
		<li>Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem24,28.</li>
		<li>Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Operation und lagern Sie sofort in künstlichem Meerwasser bestehend aus 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3und 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protease-Behandlung.<ol>
<li>Inkubieren Bauchganglien für 30 min bei 34 °C±0,5 in einer Petrischale mit 0,1% Protease (Dispase) in ASW beschrieben oben beschrieben. HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protease muss mit dem Alter und Gewicht der Tiere standardisiert werden. Im Allgemeinen würden ältere und größere Tiere mehr Protease benötigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung von Ganglienscheide.<ol>
<li>Nach der Enzymbehandlung die Ganglien auf die Sylgard-Silikonbasis einer Zellkammer (= 1 cm; Vol. = 0,3 ml) festsetzen und mit ASW (Durchflussrate: 150 l/min) bei Raumtemperatur (18 °C±2 ) durchdringen. HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, legen Sie das Ganglien auf die Oberseite eines Polycarbonat-Glaszylinders (Abbildung 1) (Durchmesser = 2 mm modifizierte Zellkammer), die mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung leicht von unten beleuchtet werden kann.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den Mantel aus dem Ganglion mit Zangen und Mikroschere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung von zwei Neuronen.<ol>
<li>Identifizieren Sie Neuron von Interesse.</li>
		<li>Impale das Neuron mit einer einzigen intrazellulären scharfen Mikroelektrode mit Widerstand 10-15 M, gefüllt mit 3 M KCl-Lösung.</li>
		<li>Aufzeichnen der neuronalen Aktivität (10 kHz Bandpass) mit einem intrazellulären Aufzeichnungssystem.</li>
		<li>Verarbeiten Sie die Aufzeichnungsdaten mit einer elektrophysiologischen Software wie Axograph. HINWEIS: Man kann leicht Aufnahmen von mehreren Neuronen durchführen. Die Neuronen L7, L11 oder R15 und R2 lassen sich anhand ihrer Position leicht identifizieren. Für die gleichzeitige Aufnahme von zwei L7- und R15-Neuronen werden zwei Verstärker und zwei Mikromanipulatoren benötigt (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drogenanwendung.<ol>
<li>Tragen Sie ein Medikament der Wahl durch sanftePipettierung oder direkte Injektion in Neuronen in die Zellkammer auf.</li>
		<li>Führen Sie elektrophysiologische Messungen durch. HINWEIS: Je nach versuchsweisem Ziel könnte man verschiedene elektrophysiologische Parameter von Neuronen messen, wie z. B. die Veränderungen des Membranpotenzials (MP) oder des Aktionspotentials (AP) vor, während und nach der Anwendung des Arzneimittels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolierung einzelner Neuronen.<ol>
<li>Am Ende der elektrophysiologischen Experimente, stoppen Sie die Perfusion von ASW und waschen Sie das Ganglien mit 100% Ethanol.  Die Exposition gegenüber Ethanol versteinert die Neuronen und macht es mit feinen Zangen einfach, einzelne Neuronen zu entfernen, ohne andere Neuronen aus dem Ganglion zu beschädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie einzelne Neuronen unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in eine kleine Eppendorf-Röhre, die eiskaltes 500-l-RNA-Extraktionsreagenz enthält. Isolierte Einzelneuronen können für zukünftige Analysen in RNA-Extraktionsreagenz bei -80 °C gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA-Isolation aus Einzelnen Neuronen und Genexpressionsanalyse durch quantitative Real Time PCR (qPCR)
<ol><li>Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung des RNA-Abbaus: Ribonukleasen (RNasen) abbauen die RNA und sind sehr stabile und aktive Enzyme. Führen Sie die folgenden Schritte bei der Behandlung von RNAs aus.<ol>
<li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich und die Instrumente mit RNase-Deaktivierungsmitteln.</li>
		<li>Tragen Sie beim Umgang mit RNA jederzeit Handschuhe und wechseln Sie oft handschuhe.</li>
		<li>Verwenden Sie nur RNase-freie Kunststoffe, um RNAs zu handhaben.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung der Total-RNA aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Standard-Trizol-Protokoll für RNA-Isolierung kann verwendet werden, um RNAs aus einzelnen Neuronen zu isolieren. Kurz 20% v/v Chloroform zu Trizol hinzufügen, durch kurzes Wirbeln gut vermischen.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre 10 min bei 4 °C auf den Rotator. Die Trizol-Chloroform-Mischung bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen.</li>
		<li>Sammeln Sie die wässrige Phase und übertragen Sie in ein frisches Rohr.</li>
		<li>Natriumacetatlösung (pH 5.5) zu einer Endkonzentration von 0,3 M, 100 ng/ml des Coprecipitantglycos GlycoBlue und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzufügen, um DIE RNA auszufällen.</li>
		<li>Mischen Sie die Proben gut und brüten Sie bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und ein kleines blaues Pellet wird an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.</li>
		<li>Den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 l 75% eiskaltem Ethanol bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das RNA-Pellet für maximal 7-10 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RNA nicht lange zum Trocknen als über- dasTrocknen des RNA-Pellets macht die Löslichkeit sehr schwierig.
</li>
		<li>Nach dem Trocknen setzen Sie das RNA-Pellet in 10 l RNAs freies Wasser wieder auf und bestimmen die RNA-Konzentration. HINWEIS: Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wenn Sie die RNA nicht sofort verwenden, lagern Sie die RNA bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>aRNA-Synthese aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Amplizieren Sie die RNA (eine oder zwei Runden je nach experimentellem Ziel) mit dem handelsüblichen linearen RNA-Verstärkungssystem. HINWEIS: Die gesamte RNA aus einzelnen Neuronen reichte von 10-60 ng. Die erwartete Ausbeute der ersten Amplifikationsrunde beträgt 100-300 ng und die zweite Verstärkerrunde beträgt 0,8-1,5 g RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse Transkription der RNA:<ol>
<li>Um cDNA aus aRNA zu erzeugen, verwenden Sie 1,0 g aRNA in 20 l einer umgekehrten Transkriptionsreaktion. Mehrere Kits sind für diesen Zweck im Handel erhältlich. HINWEIS: cDNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll unter Verwendung der folgenden Einstellungen auf Thermocycler synthetisiert. 5 min bei 25 °C 30 min bei 42 °C 5 Min. bei 85 °C Halten bei 4 °C</li>
		<li>Nach dem umgekehrten Transkriptionsschritt die cDNA bei -20 °C für eine Langzeitlagerung aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer-Design und Standardisierung: Für die Entwicklung von Primern für Echtzeitverstärkungen stehen ihnen kostenlos mehrere hervorragende Softwareprogramme zur Verfügung.<ol>
<li>Wählen Sie 18-24 mer Oligonukleotide, die 70-110 bp Amplicons produzieren und die Primer mit kommerziellen Quellen synthetisieren. HINWEIS: Für jedes Gen von Interesse sollten zwei bis drei Primerpaare entworfen werden. Jeder Primer-Satz muss durch qPCR standardisiert werden. Die Vorwärts- und Reverse-Primer-Paare, die für das Gen CREB1 (Abbildung 4) verwendet wurden, sind unten: Primer-Set 1 Vorwärts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAAGA-3' Rückseite: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Primer Set 2 Vorwärts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Umgekehrt: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Um den besten Primer auszuwählen, der für die nachgeschalteten Analysen verwendet werden soll, überwachen Sie den Ct-Wert und die Form der Amplifikationskurve in qPCR. HINWEIS: Primer, die Ct-Werte (Zyklusschwelle) zwischen 10-35 in der 40-Runden-Verstärkung und glatte Kurven während der exponentiellen Phase der PCR geben, gefolgt von einem glatten Plateau, sind optimal für Genexpressionsanalysen.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Real Time PCR (qPCR): Hinweis: Verwenden Sie geeignete Rohre oder Platten, die mit der qPCR-Maschine kompatibel sind.<ol>
<li>CDNA mit nukleasefreiem Wasser auf 5x verdünnen.</li>
		<li>Fügen Sie auf 2 l verdünnte cDNA 8 l eines qPCR-Master-Mix hinzu, der 2 lH 2O, 5 l 2x SYBR Green Master-Mix und 1,0 l von 10 m (jeweils) vorwärts und rückwärts grundiert.</li>
		<li>Schließen Sie die Rohre und versiegeln Sie die Platte nach dem Pipetieren cDNA und Master-Mix. Mischen Sie den Inhalt durch sanftes Antippen und Abdrehen bei 1.500 U/min für 30 Sek.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Einrichtung des qPCR-Computers fort.</li>
	</ol></li>
</ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität konnte ko...

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.
Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.
Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

<table><tbody><tr><td>Aplysia</td><td>National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO4</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5,5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II aRNA-Amplifikationskit</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Minutien Pins&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 oder</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>5430R Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R Zentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Schnelle Real-Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT Schneller Real-Time PCR</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Elektronik</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Konverter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

aplysia ganglien-vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare analysen einzelner neuronen

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.
Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -daue...

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpression und elektrophysiologischen Veränderungen in einzelnen identifizierten Neuronen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst sorgfältig die Neuronen von Interesse aus dem Ganglion der Plegia identifiziert werden, nach der Proteasebehandlung und Entfernung der Umhüllung des Ganglions, um die Neuronen freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, die elektrophysiologischen Eigenschaften der identifizierten Neuronen aufzuzeichnen.Anschließend werden einzelne Neuronen nach elektrophysiologischen Messungen isoliert und anschließend die RNA aus diesen Neuronen für eine lineare Amplifikation gewonnen. Im letzten Schritt erfolgt die Charakterisierung der Genexpression mittels quantitativer PCR. Schließlich werden die elektrophysiologischen Daten und die Genexpressionsdaten aus den Behandlungs- und Kontrollgruppen analysiert, um spezifische Veränderungen zu identifizieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Analyse von Organen, Geweben oder Ganglien besteht darin, dass sie die Analyse auf Ebene einzelner Neuronen ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kognitiven Neurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise wie die Expression von Genen in einzelnen Neuronen während des Alterns oder als Reaktion auf verschiedene pharmakologische Reagenzien verändert wird. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir untersuchen wollten, wie das Altern die Funktion einzelner Neuronen und Schaltkreise beeinflusst, um die abdominellen Ganglien zu isolieren.Zunächst betäuben Sie das Tier durch Injektion einer 380 Millimolar starken Magnesiumchloridlösung und warten fünf bis zehn Minuten. Danach identifizieren Sie die Bauchganglien anhand ihrer Position im zentralen Nervensystem. Anschließend entfernen Sie die Ganglien mittels chirurgischem Eingriff und lagern sie unverzüglich in künstlichem Meerwasser zur Proteasebehandlung ein.Die Bauchganglien in einer Petrischale mit 0,1 % Protease, verdünnt in einem SW, bei 34 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Beachten Sie, dass die Menge an verwendeter Protease an Alter und Gewicht der Tiere angepasst werden muss, um die Ganglienscheide zu entfernen. Nach der enzymatischen Behandlung das Ganglion auf einer Silikonbasis in Zigarrenform fixieren, die auf einem Polycarbonatglaszylinder platziert ist, und es mit einem SW bei 150 Mikrolitern pro Minute bei 18 Grad Celsius perfundieren.Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, kann der Polycarbonatglaszylinder einfach von unten mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20×- und 40×-Vergrößerung beleuchtet werden. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Hülle des Ganglions mit Pinzette und Mikroschere in diesem Verfahren. Identifizieren Sie zuerst das Neuron von Interesse.Als Nächstes durchstechen Sie das Neuron mit einer einzelnen intrazellulären scharfen Mikroelektrode, die mit einer dreimolaren Kaliumchloridlösung gefüllt ist. Geben Sie die gewünschte Substanz in die Zellkammer, indem Sie sie vorsichtig pipettieren oder direkt in die Neuronen injizieren. Nehmen Sie anschließend die neuronale Aktivität mit einem intrazellulären Ableitsystem auf.Die Aufnahmedaten werden mit Elektrophysiologie-Software wie Axograph verarbeitet, um einzelne Neuronen zu isolieren. Nach den elektrophysiologischen Experimenten wird die A-SW-Perfusion gestoppt. Anschließend wird das Ganglion mit 100 % Ethanol gewaschen, um die Neuronen zu versteinern.Entfernen Sie dann die einzelnen Neuronen mit einer feinen Pinzette und überführen Sie sie in ein kleines Eppendorf-Röhrchen, das 500 µL eiskaltes RNA-Extraktionsreagenz enthält. Die isolierten Einzelneuronen können im RNA-Extraktionsreagenz bei minus 80 °C für zukünftige Analysen aufbewahrt werden, um mithilfe des standardmäßigen TRIOL-Protokolls für die RNA-Isolierung RNA aus einzelnen Neuronen zu gewinnen.Geben Sie kurz 20 % (Volumen pro Volumen) Chloroform zu dem Triol hinzu und mischen Sie kurz gut durch. Vortexen Sie anschließend. Stellen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Zentrifugieren Sie die Triol-Chloroform-Mischung bei 12.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Dann sammeln Sie die wässrige Phase und überführen Sie sie in ein frisches Gefäß, um die RNA zu fällen. Geben Sie Natriumacetatlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 Molar, 100 Nanogramm pro Milliliter des Mitfällmittels GlycoBlue sowie 2,5 Volumina von 100 %igem Ethanol zur wässrigen Phase zu erreichen. Anschließend wird die Probe gründlich gemischt und über Nacht bei minus 80 Grad Celsius inkubiert.Am nächsten Tag die Probe bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang mit 12.000 × g zentrifugieren. Dabei bildet sich ein kleines blaues Pellet am Boden des Röhrchens. Anschließend den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 µL eiskaltem 75%igem Ethanol bei 12.000 × g zehn Minuten bei vier Grad Celsius waschen.Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet luftdurchlässig sieben bis zehn Minuten lang. Achten Sie darauf, dass die RNA nicht zu lange getrocknet wird, da eine Übertrocknung die Löslichkeit des RNA-Pellets stark erschwert.Bevor Sie die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse vorbereiten, synthetisieren Sie A-RNA aus einzelnen Neuronen und amplifizieren Sie diese mithilfe eines kommerziellen linearen RNA-Amplifikationssystems. Erzeugen Sie anschließend CDNA aus einem Mikrogramm A-RNA in 20 Mikrolitern einer reversen Transkriptionsreaktion. Verdünnen Sie danach die CDNA in nukleasefreiem Wasser.Danach acht Mikroliter der QPCR-Master-Mix zugeben, die zwei Mikroliter H2O, fünf Mikroliter 2x SYBR Green-Master-Mix und je ein Mikroliter 10-Mikromolar-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer enthalten, zu zwei Mikrolitern verdünnter cDNA. Anschließend die cDNA und den Master-Mix pipettieren. Danach die Röhrchen verschließen und die Platte versiegeln.Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Antippen und Zentrifugieren bei 1.500 U/min für 30 Sekunden, bevor Sie das QPCR-Gerät einrichten. Diese Zeichnung zeigt die simultane Ableitung von dem L7- und dem R15-Neuron des Bauchganglions. Und hier sind repräsentative intrazelluläre Ableitungen von L7 und R15.Mit dem Pfeil, der den Zeitpunkt einer CH-Anwendung angibt, könnten diese Messungen über acht bis zehn Stunden fortgesetzt werden. Diese Abbildung zeigt, dass eine CH-induzierte Veränderung im Aktionspotential der R 15-Aktionspotential-Wellenformen vor, während und nach einer CH-Exposition analysiert wurde. Hier ist die QPCR-Analyse der Expression von CREB eins in Bauchganglien und einzelnen identifizierten Neuronen.Dieses Diagramm zeigt die absolute Quantifizierung des CREB-eins-Transkripts in den Bauchganglien von jungen und adulten Plegien. Und dieses Diagramm zeigt die absolute Quantifizierung des CEB-eins-Transkripts in einzelnen identifizierten Neuronen der adulten Plegia. Sobald man die Methode beherrscht, kann sie in vier bis sechs Stunden durchgeführt werden, und die RNA-Isolierung, Amplifikation und QPCR können in drei Tagen abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Proteasebehandlung und die Entfernung der Ganglienscheide zu standardisieren, um die neuronale Aktivität zu erhalten. Gehen Sie außerdem vorsichtig beim Arbeiten mit RNA vor, beispielsweise indem Sie stets Handschuhe tragen. Verwenden Sie RNA-freie Tropfrohre und Wasser, und behandeln Sie den Arbeitsbereich mit RNA-entfernenden Reagenzien.Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ebenfalls helfen, die physiologischen und molekularen Grundlagen des Verhaltens bei anderen wirbellosen Modellorganismen wie Triton, heli und limba zu erforschen.

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