Name: Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Erfahren Sie, wie ein organischer elektrochemischer Transistor (OECT) zur Überwachung der Barrierengewebe-Integrität eingesetzt wird. Diese kostengünstige Methode erkennt Ionenflussänderungen und toxische Schädigungen schnell.

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Die Autoren dieses Beitrags haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

1. PEDOT: PSS Herstellung der Lösung <ol><li> 50 ml von PEDOT: PSS, Äthylenglykol (erhöht Leitfähigkeit) in einem Volumenverhältnis von 1:4 (Ethylenglykol zu PEDOT: PSS), 0,5 &amp;mgr; l / ml Dodecylbenzolsulfonsäure (DBSA) als Tensid und 10 mg / ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) als Vernetzer, um die Haftung des leitenden Polymers auf dem Glasträger zu fördern. </li></ol> 2. OECT Fabrication (Fig. 3) <ol><li> Definieren thermisch verdampft Gold Source-und Drain-Kontakte via Lift-off-Lithografie: <ol><li> Schleuderbeschichtung Photoresist auf einem normalen sauberen Glasobjektträger bei 3000 Upm für 30 Sekunden. Glasmaße sind in 3 x 1 Zoll </li><li> Muster eingrenzen Photolithographie. Maße verändert werden, aber die hier aufgelisteten Maße wurde gezeigt, dass die optimale Empfindlichkeit führen. Dann mit einem Entwickler. </li><li> Verdampfen 5 nm und 100 nm Chrom und Gold auf. </li><li> Lift-off der Photoresist in einer WechselAzeton-Bad für 1 Stunde, so dass das Substrat mit der Source-und Drain-Kontaktbereich Au. </li></ol></li><li> Die gewünschte Länge der PEDOT: PSS-Kanal ist 1 mm. Dies wird durch Strukturieren unter Verwendung eines Parylen-C (Pa-C) Abziehfolie Technik erzielt: <ol><li> Legen 3,5 g Pa-C in der Beschichtung Setup. Gleichmäßig verdampfen 2 um Parylene-C auf der Oberseite des Substrats mit Au-Kontakten. </li><li> Muster der Kanal durch Photolithographie: <ol><li> Schleuderbeschichtung Photoresist bei 3000 Upm für 30 Sekunden. </li><li> Eine Maske zu beleuchten Kanal und Goldkontakt 20 Sek. UV, wird der belichtete Fotolack löslich werden im Entwickler. </li><li> Verwenden Entwickler die Kanalbereich auf dem Fotolack zu öffnen. </li></ol></li><li> Ätzen des Pa-C in der Kanalbereich durch eine 15 min Plasmaschritt (O 2 (50 sccm) und CHF 4 (3 sccm) Plasma bei 160 W), um den Kanal und die Goldkontakt zu öffnen. </li></ol></li><li> Zahlen Sie die PEDOT: PSS Mischlösung durch Schleuderbeschichtung auf500 rpm für 45 sec. Backen für 30 sek bei 110 ° C. </li><li> Peel-off der Pa-C zeigen die PEDOT: PSS-Kanal des Substrats darunter. Dieser Kanal sollte etwas mit den Au-Kontakte im Protokoll Nr. 1 gemacht lappen. </li><li> Bake Proben für 1 Stunde bei 140 ° C unter atmosphärischen Bedingungen. </li></ol> 3. Geräte-Montage <ol><li> Machen PDMS durch Mischen von zwei Lösungen (in der Regel in einem Kit zusammen geliefert) in einem Verhältnis 1:10 Härterlösung in der Basislösung. Backen für 1 h bei 120 ° C. </li><li> Entwerfen Sie gut durch die Verwendung eines Locher und schneiden ein Quadrat um den gewünschten Bereich. </li><li> Kleben Sie ein PDMS auch auf dem Kanal, in einem Kanal von ca. 6 mm 2 führen. Stellen Sie sicher, dass die Source-und Drain-Kontakte nicht abgedeckt sind. </li><li> Machen Sie einen Kunststoffträger mit einem Loch drin (kann die Halterung für die Zellkultureinsatz zu verwenden) und kleben Sie es auf der Oberseite der PDMS dann. Lassen Sie es über Nacht trocknen. </li><li> Testen Sie das auch für die Weitergabe von Vorbefüllen mit watäh. </li><li> Löten elektrischen Leitungen auf der Source-und Drain-Kontakt mit Zinn. </li></ol> 4. Zellkultur <ol><li> Zellkulturmedien herzustellen, wie folgt: <ol><li> In DMEM Fügen 1% Glutamine 10% Fetal Bovine Serum 0,5% Penicillin Streptomycin und 0,1% Gentamycin. </li><li> Sterilisieren der Zellkulturmedien mit einer sterilen Filtervorrichtung. </li></ol></li><li> Aufrechterhaltung Caco-2-Zellen zwischen Passage 49 und 68 bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Zellkulturmedien. </li><li> Teilen Sie die Zellen einmal in der Woche mit Trypsin und Samen bei 1,5 x 10 4 Zellen / Insert. </li><li> Ändern Zellkulturmedien zweimal pro Woche über 3 Wochen. </li></ol> 5. Messungen mit OECT <ol><li> Verbinden einer Ag / AgCl-Draht auf eine Source zur Verwendung als Gate-Elektrode. Tauchen Sie die Spitze in Zellkulturmedien, die als Elektrolyt verwendet wird, wie in Fig. 1a dargestellt. </li><li> Die Drähte von Source und Drain zu ter Source (Zweikanal-Setup). </li><li> Tragen Sie einen Rechteckimpuls positive Spannung (V GS) zwischen dem Gate und Source (als Referenzelektrode verwendet: Erde). Eine negative Konstantspannung zwischen Drain und Source (V DS) aufgebracht wird und die entsprechenden Strom (I DS) wird gemessen. </li><li> Verwenden Sie einen PC laufenden Programm die Datenerfassung. In einer angepassten Erfassungsprogramm eingegeben OECT Parameter sollten wie folgt sein: V DS = -0,2 V, V GS = 0,3 V, V GS auf Zeit = 2 Sek., Aus-Zeit = 28 sek. </li><li> Lesen Sie Source-Drain-Strom (I DS) und Gate-Strom (I GS). Führen Sie die Messung für mehrere Minuten bis eine stabile Basislinie Signals zu gewährleisten. </li></ol> 6. Die Integration von Zellen mit OECT für Mess- Hinweis: Vor dem Experiment kann die Integrität der Zellschicht durch Messen TER mit einem Impedanzspektroskopievorrichtung verifiziert werden. TER von jeweils 3 Wochen alte Caco-2 Zell insert sollte oberhalb von 400 Ω cm 2 sein.. <ol><li> In der Nebenzeit von OECT Messung: Entfernen Sie die Gate-Elektrode aus dem Elektrolyten, beinhalten die Zellkultureinsatz, und ersetzen Sie die Gate-Elektrode im Inneren der Zellkultureinsatz. </li><li> Führen Sie eine Baseline-Messung mit den Zellen für mehrere Minuten, um ein stabiles Signal zu gewährleisten. Diese Grundlinie wird für die Berechnung der normalisierten Wert entsprechend einer intakten Monoschicht (0) verwendet werden. </li></ol> 7. Vorbereitung und Einleitung der toxischen Verbindung <ol><li> Vorbereitung einer 1 M Lösung von EGTA in DI-Wasser, zuerst den pH-Wert der Lösung auf 7,4 mit Tris-Base. </li><li> In EGTA-Lösung in das entsprechende Volumen, um die gewünschte Konzentration (zB zwischen 5 mM und 100 mM) unter Berücksichtigung der Volumen zu erhalten. Die EGTA sollte bei der Aus-Zeit in der basalen Kammer hinzugefügt werden. </li><li> Messen Sie kontinuierlich für 90 min in Protokoll 5. Wenn die Messung being durchgeführt bei Raumtemperatur wurde die Stabilität der Zellen nicht konstant nach 90 min bleiben. </li><li> Am Ende des Versuchs, kratzen die Zellschicht zu einer vollständigen Zerstörung der Sperrschicht und Messung für 15 min Ergebnis konnte dieser Punkt durch Entfernen des Filters und das Eintauchen der Gate-Elektrode in den Medien durchgeführt werden. Diese Grundlinie wird für die Berechnung der normalisierten Wert entsprechend einer Monoschicht zerstört werden. </li></ol>

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Dieses Projekt wird von FP7-People-2009-RG, Marie-Curie-Projekt Nr. 256367 (CELLTOX) und der Europäischen ERC-2010-StG Research Council Vorschlag Nr. 258966 (IONOSENSE) sowie einer gemeinsamen Zuschuss von der Conseil Regional de unterstützt Provence Alpes Cote d&#39;Azur und CDL Pharma für ST. Wir danken George Malliaras für hilfreiche Diskussionen in Bezug auf OECT Design und Funktion.

Diese Technik stellt ein neues Verfahren, um eine organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen zu integrieren, um Sperrgewebeintegrität zu messen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Schnelligkeit und Empfindlichkeit, sondern auch die geringen Kosten der Vorrichtung zur dynamischen Überwachung eines Wandgewebes. Da diese Methode lebende Zellen verwendet, ist ein kritischer Punkt, um sicher sein, eine Monoschicht, die eine intakte Barriereschicht darstellt verwenden. D...

Der Magen-Darm-Epithel ist ein Beispiel für Gewebebarriere, die den Durchgang von Molekülen zwischen verschiedenen Kompartimenten des Körpers steuert. Das Epithel besteht aus länglichen säulenförmigen Zellen Komplexe von Proteinen, die eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger 1 und Toxinen miteinander verbunden, während die den Durchgang von Wasser und Nährstoffen erforderlich, um den Körper zu stützen. Diese Selektivität ist auf die Polarisation der Epithelzellen, die zwei verschiedene Membrandomänen erzeugt: die apikale Seite der Zellen in das Lumen und der basalen Seite der Zellen auf das darunter liegende Gewebe verankert 2,3 ausgesetzt. Tight Junctions (TJ) sind Komplexe von Proteinen an der apikalen Teil der epithelialen Zellen vorhanden und sind Teil eines größeren Komplex der apikalen Ausfahrt 4 bekannt. Ionenfluss über die Barriere Gewebe kann entweder gehen über den transzellulären (durch die Zelle) oder über einen parazellulären (zwischen zwei benachbarten Zellen)-Weg. Die Summe derder Transport durch beide Wege als transepithelialen Widerstand bekannt. Der apikale Übergang ist für die Regulierung von Ionen und Molekülen durch die Barriere hindurch 5,6 über eine bestimmte Öffnungs-und Schließfunktion verantwortlich. Eine Dysfunktion oder Störung dieser Proteinkomplexe wird oft Krankheit 7-11 stehen. Darüber hinaus sind viele enterischen Pathogenen / Toxine bekannt, speziell auf diese komplexe, wodurch der Körper und die Eingabe, die zu Durchfall, wahrscheinlich als Folge einer massiven Fehlregulation der Ion / Wasserstrom über die Barriere 12-14. Wandgewebes kann auch durch Veränderung der extrazellulären Mikroumgebung modifiziert werden. Cadherin ist ein kritischer Protein für Zell-Zell-Adhäsion und bei der Bildung des apikalen Übergang beteiligt. Calcium ist für die korrekte strukturelle Konformation Cadherin erforderlich, und eine Abnahme der extrazellulären Calcium wurde gezeigt, dass die Zerstörung der Zell-Zell-Übergang und einem anschließenden Öffnen des Ergebnissesparazellulären Weg zwischen den Zellen 15. In dieser Studie, EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-Tetra Essigsäure), ein spezifischer Calcium-Chelator, wurde verwendet, um eine Verletzung der Barrieregewebe zu induzieren, wie es wurde gezeigt, dass eine schnelle und drastische Auswirkungen auf die parazellulären Ionen fließen 16,17 zu haben. Diese Calcium-Chelator auf einer konfluenten Monoschicht von differenzierten Caco-2-Zelllinie verwendet. Kultiviert in Zellkultureinsätzen, ist diese Zelllinie bekannt, die Eigenschaften des Magen-Darm-Trakt zu entwickeln und wird von der pharmazeutischen Industrie verwendet, um die Absorption von Arzneimitteln 18,19 testen. Methoden zur Barriere Gewebeintegrität überwachen sind reichlich vorhanden. Diese Verfahren sind oft optische, sich auf Immunfluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen bekannt, am apikalen Übergang 20 sein oder sich auf der Quantifizierung eines fluoreszierenden Tracermoleküls, die normalerweise undurchlässig für das Sperrgewebe21,22. Allerdings sind markierungsfreien Methoden (dh ohne Fluorophor / Chromophor) vorzuziehen, da die Verwendung eines Etiketts können Artefakte entstehen, und oft erhöht die Kosten-und Testzeit. Elektrische, markierungsfreie Überwachung der Barriere Gewebe wurde vor kurzem als eine dynamische Überwachungsmethode 23 entstanden. Beispielsweise die jüngsten technologischen Fortschritte in der elektrischen Impedanz-Spektroskopie haben die Entwicklung eines kommerziell verfügbaren Scanvorrichtung, die 24,25 transepithelialen Widerstandes (TER), eine Messung der Ionenleitfähigkeit in der Zellschicht messen erlaubt. Organische Elektronik ist eine einzigartige Gelegenheit, die Welt der Elektronik und Biologie 26,27 28,29 durch Verwendung leitfähiger Polymere, die sowohl elektronische und ionische Träger leiten kann Schnittstelle erstellt. Eine neue Technik, um Verstöße bei der Verwendung der OECT 30-32 Barriere Nachweis von Gewebe wurde erst kürzlich eingeführt. Dieses Gerät wurde gegen uns bestehenden Techniken validierted barriereGewebeIntegrität, einschließlich Immunfluoreszenz, Durchlässigkeit Tests unter Verwendung von Lucifer Gelb und Impedanzspektroskopie mit Hilfe der Cellzscope beurteilen. Im Fall aller toxischen Verbindungen getestet, die OECT wurde festgestellt, dass gleiche oder bessere Empfindlichkeit zu arbeiten, und mit erhöhter zeitlicher Auflösung, verglichen mit den oben genannten Techniken. In dieser Vorrichtung, PEDOT: PSS, ein leitendes Polymer, das gezeigt worden ist, stabil und biokompatibel 33,34 wird, wird als das aktive Material in dem Transistorkanal verwendet. Die OECT aus Drain-und Source-Elektroden auf beiden Seiten einer leitenden Polymer-Kanal besteht. Diese wird dann in Kontakt mit einem Elektrolyten, der Bestandteil der Vorrichtung bildet platziert. Eine Gate-Elektrode in den Elektrolyten (1) eingetaucht ist, und wenn eine positive Gate-Spannung an das Gate angelegt wird, werden Kationen aus dem Elektrolyten in den Kanal gedrückt wird, so Entdotieren des leitenden Polymers und was zu einer Änderung in den Source-Drain Strom. Der device ist somit extrem empfindlich auf kleinste Veränderungen in der Ionenfluss durch Verstärkung durch den Transistor. Eine Zellschicht auf einem Zellkultureinsatz gewachsen wurde zwischen der Gateelektrode und dem leitenden Polymerkanal angeordnet. Das Vorhandensein eines intakten Zellschicht als Barriere für die Kationen der Eingabe in den leitenden Polymer daher in der Gegenwart eines intakten Monoschicht wirkt der Drain-Strom abnimmt (Fig. 2: Übergang vom Bereich a bis b). In Gegenwart einer toxischen Verbindung, wird das Sperrgewebe allmählich verlieren ihre Integrität und ließ die Kationen in die Polymerfolie ein und Erhöhung des Drain-Stroms (Fig. 2: C-Region). Mit dieser Technik wird die Verletzung der Barrieregewebe durch die Modulation des Drainstroms gesehen, entsprechend der Modulation der Fluß durch die Monoschicht. Dieses Gerät ist in der Lage, kleinste Schwankungen der Ionenfluss mit bisher unerreichten Zeitauflösung und Empfindlichkeit in Echtzeit zu messen. Diese Technologie will von Interesse im Bereich der Toxikologie für Drogentests, Krankheitsdiagnose oder Grundlagenforschung als die Barriere Modell kann leicht angepasst werden kann. Dieses Verfahren wird auch helfen, Tierversuche zu verringern, da es die Validierung der in vitro-Modelle in vivo-Tests zu ersetzen.

<table><tbody><tr><td>Clevios pH 1000</td><td>Heraus Clevios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ9260 Harz</td><td>Cipec Specialties</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecylbenzolsulfonsäure (DBSA)</td><td>Acros Organisches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Suspendierte Zellkultureinsatz Millicell&nbsp; PET 0,4 &mu; m Millipore</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte BD Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51705</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GPT PES 0,22 &mu; M</td><td>Dominique Dutscher</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM Marke GIBCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3434T</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inact.</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3470C</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3524T</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,05% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3513N</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol, wasserfrei, 99,8 %,</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2-Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184 SILIKONELASTOMER</td><td></td></tr><tr><td>Au (99,99 %)</td><td>NEYCO</td><td>AU3X6</td><td></td></tr><tr><td>Chrom (99,95 %)</td><td>NEYCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parylene C</td><td>Spezialbeschichtungssysteme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl-Draht</td><td>Harvard Apparat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotolack</td><td>Cipec Spezialitäten</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erkundung der barrier gewebestörung mit einem organischen transistor elektro

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Der Gastrointestinaltrakt ist ein Beispiel eines Sperrgewebe, das eine physikalische Barriere gegen den Eintritt von Pathogenen und Toxinen liefert, während es den Durchgang von Ionen und Molekülen erforderlich. Eine Verletzung dieser Barriere kann durch eine Verringerung der extrazellulären Calcium-Konzentration verursacht werden. Diese Verringerung der Calcium-Konzentration bewirkt eine Konformationsänderung in Proteinen im Verschweißen der Sperr beteiligt, was zu einer Erhöhung der parazellulären Fluss. Um diesen Effekt zu imitieren, die Calcium-Chelatbildner Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-Tetra-Essigsäure (EGTA) wurde auf einer Monoschicht von Zellen bekannt, repräsentativ für den Magen-Darm-Trakt verwendet werden. Verschiedene Methoden, um die Störung der Barriere Nachweis von Gewebe vorhanden ist, wie Immunfluoreszenz-Assays und Permeabilität. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und teuer und nicht für dynamische oder Hochdurchsatz-Messungen geeignet. Elektronische Methoden zur Messung der Gewebe-SchrankeIntegrität auch zur Messung des transepithelialen Widerstandes (TER) vorhanden sind, aber diese sind oft teuer und komplex. Die Entwicklung von schnellen, billigen und empfindliche Verfahren ist dringend erforderlich, da die Integrität der Barriere Gewebe ist ein Schlüsselparameter in der Wirkstoffforschung und Krankheitserreger / Toxin Diagnostik. Die organische elektro Transistor (OECT) mit Barriere-Gewebe bildenden Zellen integriert wurde, als ein neues Gerät in der Lage, dynamisch Überwachung Barriere Gewebeintegrität gezeigt worden. Das Gerät ist in der Lage, kleine Veränderungen in der Ionenflusses mit beispiellosen zeitlichen Auflösung und Empfindlichkeit zu messen, in Echtzeit als Indikator der Sperrgewebeintegrität. Dieses neue Verfahren basiert auf einer einfachen Vorrichtung, die mit Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen kompatibel sind und zu niedrigen Kosten hergestellt werden kann, basiert.

Während des ersten Schritts der Messung kann der Drainstrom etwas variieren, aber in den meisten Fällen sollte stabil bleiben (Fig. 2, Abschnitt a). Wenn das Signal nicht stabil ist, ist der Transistor entsorgt und ersetzt werden. Diese Stabilitätsprüfung gewährleistet auch, dass alle Anfangsverluste in der Leitfähigkeit des Gerätes beeinträchtigen nicht die Folgebewertung. Nach mehreren Minuten der Messung ist der Einsatz mit Zellen bilden Gewebe Barriere auf der Oberseite des Kanals angeordnet. Der Dr...

Die Organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen integriert und zur Ionenfluss über den Magen-Darm-Epithel-Barriere zu überwachen. In dieser Studie wurde eine Erhöhung des Ionenflusses, um eine Unterbrechung der tight junctions, die durch die Anwesenheit der Calcium-Chelatbildner EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-Tetra-Essigsäure induzierten verwandten Säure), wird gemessen.

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine kostengünstige, empfindliche und schnelle Diagnosemethode zur Überwachung der Gesundheit von Barriergewebe zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem ein organischer elektrochemischer Transistor hergestellt wird, der rasch und empfindlich Änderungen im Ionenfluss eines Elektrolyten durch die Messung von Veränderungen im Source-Drain-Strom des Transistors überwachen kann. Als zweiter Schritt wird eine gesunde Barriergewebeschicht, die auf einem Filter gezüchtet wurde, in das OECT-Gerät integriert, um die Überwachung des Ionenflusses durch die Barriergewebeschicht zu ermöglichen, der teilweise blockiert sein wird, wenn die Zellschicht gesund ist.Wenn eine toxische Verbindung hinzugefügt wird, die die Barriergewebsschicht schädigt oder zerstört, wird der Ionenfluss über die Zellschicht nicht mehr blockiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der OECT die toxischen Wirkungen einer Modellverbindung erfolgreich nachweisen kann, was belegt, dass wir die Messungen des Transistors als diagnostisches Mittel zur Überwachung der Gesundheit von Barriergewebe nutzen können. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Impedanzspektroskopie liegt darin, dass organische elektronische Bauelemente kostengünstig hergestellt werden können und sich somit für ein Hochdurchsatz-Screening eignen.Den Versuchsdurchgang werden SHA FIA, eine Doktorandin, und Mark Hamir, ein Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren. Diese Methode kann Einblicke in die Zellen des gastrointestinalen Epithels liefern, kann aber auch auf andere Systeme wie die Haut, das Nierene­pithel und die Breitbandbarriere angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da sie einen Schritt darstellt, der zur Integration einer Zellschicht mit einem Gerät erforderlich ist.Benötigen eine sorgfältige Handhabung, um thermisch aufgedampfte Gold-Source- und Drain-Kontakte mittels Lift-off-Lithografie zu definieren. Zunächst Photoresist auf eine normal gereinigte Glasscheibe mit den Maßen drei Zoll mal ein Zoll aufspinnen. 30 Sekunden bei 3000 U/min beschichten und die Proben 30 Sekunden bei 110 Grad Celsius aushärten.Als Nächstes definieren Sie die Strukturen mittels Photolithographie unter Verwendung einer Maske für die Goldelektroden innerhalb einer Aufdampfkammer. Lagern Sie fünf Nanometer Chrom und 100 Nanometer Gold nacheinander ab. Danach lösen Sie den Fotolack ab.Belassen Sie den Substrat mit den Goldkontakten für die Source- und Drain-Kontakte in einem Acetonbad für eine Stunde, sodass nur die gewünschte Länge des Pdot-PSS-Kanals von einem Millimeter verbleibt, was durch Mustern mittels einer Lene-C-Ablöstechnik erreicht wird. Geben Sie nun 3,5 Gramm Lene C in die Beschichtungseinrichtung. Verdampfen Sie gleichmäßig zwei Mikrometer Paraline C auf dem Substrat mit den Goldkontakten, um den Kanal durch Photolithographie zu strukturieren, indem Sie Photoresist mit 3000 U/min für 30 Sekunden aufspinnen und das Substrat anschließend zwei Minuten bei 110 Grad Celsius aushärten.Als Nächstes definieren Sie die Strukturen mithilfe einer Maske, die für den Kanalbereich vorgesehen ist. Der Teil des Fotolacks, der UV-Licht ausgesetzt ist, wird anschließend im Entwickler löslich. Ätzen Sie Lene C im Kanalbereich, indem Sie es 15 Minuten lang in der Kammer Sauerstoff-Plasma aussetzen, um den Kanal und den Golddraht freizulegen.Tragen Sie anschließend die Pdot-PSS-Mischungslösung durch Spin-Beschichtung bei 500 U/min für 45 Sekunden auf und trocknen Sie sie 30 Sekunden lang bei 110 Grad Celsius. Entfernen Sie danach das Paraline C, um den darunterliegenden Pdot-PSS-Kanal des Substrats freizulegen. Dieser Kanal sollte sich geringfügig mit dem Goldelektrodenkontakt überlappen.Backen Sie die Proben eine Stunde lang bei 140 Grad Celsius unter atmosphärischen Bedingungen. Mischen Sie in diesem Verfahren PDMS aus der Härterlösung und der Basissolution im Verhältnis 1 zu 10 und backen Sie eine Stunde lang bei 120 Grad Celsius. Gestalten Sie anschließend eine Vertiefung mithilfe eines Lochstanzers und schneiden Sie einen quadratischen Bereich um den gewünschten Bereich herum aus.Danach A-P-D-M-S gut auf dem Kanal befestigen, um eine Kanalfläche von sechs Quadratmillimetern zu erhalten. Einen Kunststoffträger mit einem Loch anfertigen, diesen dann auf das PDMS kleben und über Nacht trocknen lassen. Anschließend die Kammer auf Undichtigkeiten testen, indem sie vorab mit Wasser befüllt wird.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie zunächst das Zellkulturmedium vorbereiten. Danach sterilisieren Sie das Zellkulturmedium mithilfe eines sterilen Filtersystems. Anschließend werden Caco-2-Zellen im Zellkulturmedium zwischen dem 49. und 68. Durchgang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert.Teilen Sie die Zellen einmal pro Woche mit Trypsin und säen Sie 1,5 × 10⁴ Zellen pro Insert aus. Wechseln Sie gleichzeitig während drei Wochen zweimal pro Woche das Zellkulturmedium. Schließen Sie nun einen Silber-Silberchlorid-Draht als Gate-Elektrode an ein Source-Meter an.Als Nächstes verbinden Sie die Source- und Drain-Anschlüsse mit dem Source-Messgerät. Tauchen Sie dann die Spitze in Zellkulturmedien, die als Elektrolyt verwendet werden. Leiten Sie eine positive Rechteckimpulsspannung zwischen Gate und Source an.Danach eine negative konstante Spannung zwischen Drain und Source anlegen und den entsprechenden Strom messen. Die OECT-Parameter in ein angepasstes Erfassungsprogramm eingeben. Den Source-Drain-Strom und den Gatterstrom auslesen und die Messung mehrere Minuten lang durchführen, um ein stabiles Basisliniensignal für die Zellintegration während der Auszeit der OECT-Messung sicherzustellen.Entfernen Sie die Gait-Elektrode aus dem Elektrolyten, fügen Sie dann den Zellkultur-Einsatz ein und setzen Sie die Gait-Elektrode in den Zellkultur-Einsatz zurück. Führen Sie anschließend über mehrere Minuten eine Basislinienmessung mit den Zellen durch, um ein stabiles Signal sicherzustellen. Diese Basislinie wird zur Berechnung des normalisierten Werts verwendet, der einer intakten Monoschicht entspricht.Fügen Sie in diesem Verfahren die EGTA-Lösung in dem geeigneten Volumen hinzu, um die gewünschte Konzentration während der Off-Phase in der Basalkammer zu erreichen, und führen Sie die Messung kontinuierlich wie zuvor beschrieben über 90 Minuten durch. Falls die Messung bei Raumtemperatur durchgeführt wird, bleibt die Stabilität der Zellen nach 90 Minuten am Ende des Durchlaufs nicht konstant; verkratzen Sie die Zellschicht, um eine vollständige Zerstörung der Barrierekage herbeizuführen, und messen Sie anschließend 15 Minuten lang. Dieser Basiswert wird zur Berechnung des normalisierten Werts verwendet, der einer zerstörten Monolage entspricht.Hier ist die Übersicht über die INCI-Zwei-Messung der Drainstromantwort auf quadratische Gate-Impulse über die Zeit. Dieser Abschnitt entspricht dem OECT-Betrieb vor der Integration, wobei die Stabilität des Geräts sichergestellt wird. Dieser Abschnitt entspricht der Integration der barrierebildenden Gewebezellen, wobei erneut ein stabiles Signal sichergestellt wird, bevor mit der Prüfung der toxischen Verbindung begonnen wird.Dieser Abschnitt entspricht der Zugabe von EGTA zu den Barrieretissue-Zellen, also der zeitlichen Entwicklung des Signals. Dargestellt ist die Drain-Stromantwort eines OECT auf einen einzelnen quadratischen Gating-Impuls. Diese Abbildung zeigt die transiente OECT-Antwort vor und nach der Zugabe von auf einem Filter wachsenden, barrieretypischen Zellen sowie die transiente OECT-Antwort nach der Zugabe einer toxischen Substanz mit und ohne Barrieretissue.Dieses Diagramm zeigt die typischen normalisierten Ergebnisse des OECT. Die normalisierten Antworten des OECT wurden über einen Zeitraum von 50 Minuten gemessen nach der Zugabe der Vorrichtung, angegeben durch eine leere Kreisform, der Zellschicht, angegeben durch ein schwarzes Kreuz, fünf Millimolar EGTA, angegeben durch einen dunkelblauen Kreis, und 10 Millimolar EGTA, angegeben durch einen cyanfarbenen Kreis. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, keine Zellschicht mit einer Gate-Elektrode oder durch zu starkes Pipettieren der Lösung innerhalb des Zellkultur-Inserts abzubilden.Denken Sie daran, dass die Arbeit mit lebenden Zellen geeignete Schutzausrüstung erfordert und dass Gegenstände, die mit lebendem Zellmaterial in Kontakt gekommen sind, als biologischer Abfall entsorgt werden müssen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man eine Barriergewebeschicht mit dem OECT zur Überwachung der Toxikologie integriert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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