Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, korrekt gefaltetes gereinigtes Influenza-, Hämagglutinin- und Neuraminidase-Oberflächenglykoprotein für immunologische Assays und Impfexperimente zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst das rekombinante BMid mit Influenza-Genen kloniert wird, gefolgt von der Erzeugung rekombinanter Baula-Viren. Der zweite Schritt besteht darin, diese rekombinanten Baula-Viren zu verwenden, um Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine in Insektenzellen zu exprimieren.

Anschließend werden die rekombinanten Proteine mittels Affinitätschromatographie aus dem Zellkulturüberstand aufgereinigt. Der letzte Schritt besteht darin, diese Proteine zu charakterisieren, um eine gute Qualität und biologische Funktionalität zu gewährleisten. Letztendlich werden die rekombinanten Proteine verwendet, um die Immunantwort auf die Oberflächenglykoproteine des Influenzavirus zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der bakteriellen Expression von HA one besteht beispielsweise darin, dass die gereinigten Antigene korrigierend gefaltet sind und auch biologisch aktiv bleiben, im Gegensatz zur Verwendung ganzer Viruspräparate für immunologische Assays. Diese Reagenzien ermöglichen die Messung der Immunantwort gegen die Hämagglutinin- und Nicht-Neuraminidase-Proteine. Beginnen Sie dieses Protokoll nur mit der Erzeugung eines rekombinanten Baula-Virus, wie im Textprotokoll beschrieben, das aseptisch in einer Laminar-Flow-Haubenplatte arbeitet, SF neun Insektenzellen in sechs Well-Platten bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter.

Und sitzen wir 20 Minuten in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator ohne CO2. Mischen Sie dann zwei Mikrogramm rekombinante Rückenmitte mit 100 Mikrolitern Trico Leia Knie Medium Formulierung HINK oder TNM fh. Mischen Sie dann sechs Mikroliter des Transfektionsmittels mit 100 Mikrolitern TNM FH Insektenmedium.

Kombinieren Sie die beiden Volumina, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Transfektionsmischung 20 Minuten ruhen. Bei Raumtemperatur ist eine Scheintransfektion als Kontrolle enthalten, die das Transfektionsreagenz, aber keine DNA enthält. Entfernen Sie das SNAT von den plattierten SF-Neun-Zellen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter serumfreies TNM FH-Medium, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung enthält.

Geben Sie das gesamte Volumen der Transfektionsmischung in die Zellen und schütteln Sie die Sechs-Well-Platte vorsichtig fünf Sekunden lang. Inkubieren Sie in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator ohne CO2 für sechs Stunden. Ersetzen Sie das Medium durch frisches, volles TNM FH-Medium, bevor Sie die Platte sechs Tage lang unter denselben Bedingungen inkubieren.

Kontrollieren Sie die Zellen gelegentlich unter dem Mikroskop. Infizierte Zellen erscheinen in der Regel größer. Die Rounder haben vergrößerte Kerne und beginnen sich abzulösen.

Die Zellen werden sechs Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation bei 2000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur entnommen. Der Überstand enthält das rekombinante Baula-Virus und wird sofort zur Erzeugung von Arbeitsbeständen verwendet oder kann jahrelang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Überprüfen Sie die Proteinexpression über die SDS-Seite und den Western Blot und bereiten Sie die Arbeitsbestände vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

SF nine Zellen unterstützen das Wachstum des Makulavirus sehr gut. Ihre Fähigkeit, große Mengen an rekombinantem Protein zu sezernieren, ist jedoch begrenzt. Daher verwenden wir eine weitere Insektenzelllinie.

High Five Zellen für die Expression von sezernierten rekombinanten Proteinen. Diese Zellen unterstützen das Wachstum des Balo-Virus zu hohen Titern nicht, haben aber eine sehr hohe sekretorische Kapazität. Züchten Sie fünf Zellen in SFX Insektenzellkulturmedium in T 175 Quadratzentimeter Kolben Durchgang jeden zweiten Tag.

Sie werden im Verhältnis eins zu drei aufgeteilt. Züchten Sie fünf konfluente Fläschchen für eine 200-Milliliter-Expressionskultur, um die High-Five-Zellen zu ernten und zu infizieren. Trennen Sie zuerst die High-Five-Zellen, indem Sie auf die Kolben klopfen.

Die Zellsuspension auffangen und in 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen überführen. Schleudern Sie die Röhrchen bei 1200 G sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und vereinigen Sie die Pellets durch Reanimation, indem Sie sie in 15 Millilitern P drei Brühe suspendieren.

Lassen Sie die Zellen 15 Minuten in der Strömungshaube ruhen. Übertragen Sie 200 Milliliter SFX-Kulturmedium mit hohem Klongehalt in einen sauberen, sterilen 1000-Milliliter-Schüttelkolben. Dann wird die P-Drei-Zell-Suspension in den Schüttelkolben mit steriler Aluminiumfolie versiegelt, bevor sie 72 bis 96 Stunden lang bei 70 U/min und 28 Grad Celsius geschüttelt wird.

Gewinnung von rekombinantem Protein aus Überständen mit hoher Fünfzellexpression 72 bis 96 Stunden nach der Infektion. Kulturüberstände in 500-Milliliter-Zentrifugationsbecher umfüllen. Bei 5.500 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius schleudern.

Spülen Sie in der Zwischenzeit den Shaker-Kolben dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus. Nächste Pipette. Drei Milliliter Nickelharzaufschlämmung in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Millilitern PBS pro 200 Milliliter Kultur

Vor dem Schleudern 10 Minuten bei 3000 g und Raumtemperatur nach dem Zentrifugieren gut schütteln. Dekantieren Sie das PBS und bewahren Sie das Pellet auf. Mischen Sie den Insektenzellenüberstand mit dem Nickelharzpellet und geben Sie ihn in die bereits gespülten Schüttelkolben.

Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Stunden unter Schütteln. Montieren Sie als Nächstes eine 10-Milliliter-Säule aus Polypropylen an einer Klemme an einem Stützständer. Entfernen Sie beide Kappen und platzieren Sie ein Becherglas unter der Säule, um den Durchfluss aufzufangen.

Nach der Inkubation des Schüttelkolbens ist mit dem Umfüllen der überstehenden Güllemischung auf die Säule zu beginnen. Es hält das Nickelharz zurück und nur der Überstand fließt hindurch. Übergeben Sie das gesamte Volumen über die Spalte.

Waschen Sie das Harz viermal mit 15 Millilitern Waschpuffer. Lassen Sie den Waschpuffer aus der Säule abtropfen und verschließen Sie die untere Seite mit der Kappe. Fügen Sie zwei Milliliter elucianischen Puffer hinzu und lassen Sie uns fünf Minuten lang sitzen.

Öffne die Säule und sammle das Eit, wobei du es nach Möglichkeit auf nassem Eis aufbewahrst. Wiederholen Sie dies noch dreimal. Ein EIT, das hohe Proteinkonzentrationen enthält, zeigt typischerweise Schaum, wenn es geschüttelt wird, um den Puffer auszutauschen und das Protein zuerst zu konzentrieren, 15-Milliliter-Ultrafiltrationszentrifugationseinheiten mit PBS bei 3000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Verwerfen Sie den Durchfluss und laden Sie das EIT auf die Spin-Säule. Füllen Sie die Säule mit fünf Millilitern sterilem, eiskaltem PBS, bevor Sie sie unter den gleichen Bedingungen 60 Minuten lang schleudern. Den Durchfluss wieder ablassen, mit 15 Millilitern eiskaltem PBS nachfüllen und weitere 60 Minuten schleudern.

Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal und sammeln Sie dann das ausgetauschte Pufferkonzentrat, das das hochkonzentrierte rekombinante Protein darstellt. Bewahren Sie das Konzentrat immer auf Eis auf. Spülen Sie die Schleudersäule mit 400 Mikrolitern sterilem eiskaltem PBS und geben Sie dieses zum Konzentrat.

Das Protein kann dann wie im Textprotokoll beschrieben charakterisiert werden. Die HA- und NA-Proteine, die von den ENUE- und Shanghai-Stämmen exprimiert wurden, zeigten moderate Expressionsniveaus von 0,2 Milligramm pro Liter für Influenza A, die in Shanghai gesammelt wurde, bis zu 0,7 Milligramm pro Liter für Influenza. A, das in Enue, Neuraminidase- oder NA-Molekülen beider Stämme gesammelt wurde, zeigte moderate Expressionswerte, die von 0,2 Milligramm pro Liter Kultur für Influenza A in Shanghai bis 0,7 Milligramm pro Liter für Influenza A in Enue reichten.

Alle vier Proteinpräparate wiesen sehr geringe bis gar keine Verunreinigungen auf, wobei ha von höherer Reinheit als nas war, was durch den Expressionsgrad erklärt werden kann. Influenza A, das in Shanghai HA gesammelt wurde, wurde mit ELI SA mit dem breit neutralisierenden stielreaktiven humanen monoklonalen Antikörper CR 9 1 1 4 weiter analysiert. Wie hier in Blau dargestellt, bindet dieser monoklonale Antikörper an ein sensitives Bestätigungsepitop in der Stammdomäne und wird hier als Sonde für die korrekte Faltung dieser Domäne verwendet.

Der Antikörper zeigt eine gute Bindung, was sich in einer erhöhten Absorption bei 490 Nanometern zeigt, was die Sicherheit gibt, dass das HA tatsächlich korrekt gefaltet ist. Eine zweite, Eliza mit Anti-Hämagglutinin des polyklonalen Mausserums vom Subtyp 7, wurde durchgeführt, um die Identität des erhaltenen Proteins als Hämagglutinin des Subtyps 7 zu bestätigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie Sie rekombinante Influenzavirus-, Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine in Ihrem Labor exprimieren können.

Dieser Prozess könnte auch für die Expression anderer viraler oder zellulärer Membranproteine nützlich sein. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.