Name: Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Lernen Sie die rekombinante Expression funktionaler Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine aus dem H7N9-Influenzavirus im Baculovirus-Expressionssystem. Diese Methode ermöglicht die Produktion korrekt gefalteter viraler Oberflächenantigene für immunologische Studien.

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Wir möchten Patrick C. Wilson für monoklonale Antikörper CR9114 danken. Wir danken auch Debeauchamp Jennifer und Richard Webby für die ursprünglichen A/Anhui/1/13 Plasmide. Teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten vorgesehen finanzierte Programm Projektstipendium AI097092-01A1 und CEIRS (Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung, HHSN26620070010C). FK wurde von einem Erwin-Schrödinger-Stipendium (J 3232) aus dem österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt.

1. Erzeugung von rekombinantem Baculovirus <ol><li> Die Klonierung in Baculovirus-Transfer-Plasmide <ol><li> Klon H7 HA und NA N9 Ektodomäne (oder jede andere HA oder NA-Gen) in modifizierte pFastBac Transferplasmide (siehe Einleitung). Vektoren für die HA mit einer C-terminalen Domäne und Trimerisierung einen Hexahistidin-Tag, wie auch für NA, das einen N-terminalen Tetramerisierungsdomäne und Hexahistidin-Tag, wurden beschrieben, 1,10,11,22 (Fig. 1) und können angefordert werden, die Autoren. Erläuterung: HA Ektodomänen ausgedrückt ohne Trimerisierungsdomäne wird vor allem in den Stiel Domain falsch gefaltet werden, was zum Verlust von Konformationsänderungen neutralisierende Epitope. Ebenso stützt sich die NA enzymatische Funktion zur richtigen Tetramerisierungsdomäne. </li><li> Generierung von Bacmide Transformation Baculovirus-Transfer-Plasmide, die HA-und NA-Gene in Bakterien gemäß DH10Bac Verwendung eines Baculovirus-ExpressionsSystem gemäß Anweisungen des Herstellers. Isolieren und zu reinigen Bacmide mit einem Midiprep Kit nach Herstellerangaben (Abbildung 2). </li></ol></li><li> Rettung der rekombinanten Baculovirus und Überprüfung der Proteinexpression Erläuterung: Die folgenden Schritte müssen aseptisch in einer Sterildurchgeführt werden. Führen Sie dieses Verfahren unabhängig für HA und NA (oder jedes andere Gen von Interesse). Insektenzellen werden in der Regel bei 28 ° C ohne CO 2 gezüchtet. Sf9-Zellen für dieses Protokoll werden in voller TNM-FH Insektenzellmedium mit 10% FBS, 1% Pen-Strep * und 0,1% Pluronic F68-Lösung, ergänzt gewachsen, wenn nicht anders angegeben, agiert und 01.04 Uhr zweimal pro Woche. High Five-Zellen in Serum-freien Medien SFX gewachsen und agiert 01.15 Uhr zweimal pro Woche. * Zusatz von Antibiotika sollte in der gesamten Protokoll als optional angesehen werden und entsprechend den in jedem Labor eingesetzt Praktiken angepasst. <ol><li> Platte Sf9 Insektenzellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / cm 2 und stehen lassen für 20 Minuten in einem 28 ° C-Inkubator (ohne CO 2). </li><li> Mix 2 ug (konz. 0,5-2 ug / ul) von rekombinanter Bacmid mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, 1% Pen-Strep). Mix 6 ul Transfektionsagens mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, Pen-Strep). Kombinieren Sie die zwei Bände, vorsichtig mischen und lassen Sie sich für 20 Minuten bei Raumtemperatur (Transfektion Mischung). Fügen Sie ein Mock-Transfektion als Kontrolle (Abbildung 3). </li><li> Überstand entfernen aus beschichtetem Sf9-Zellen (Zellen werden nun auf die Platte kleben) und ersetzen mit 2 ml Serum-freiem TNM-FH-Medium, das Pen-Strep (1%). Fügen Sie das komplette Volumen der Transfektion Mischung (aus Schritt 1.2.2) und rocken die 6-Well-Platte vorsichtig 5 Sekunden. Inkubieren in einem 28 ° C Inkubator ohne CO 2 für 6 h (Fig. 3). </li><li> Ersetzen Medien with frisch TNM-FH-Medium (mit 10% FBS, 1% Pen-Strep und 0,1% Pluronic F68). Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage. Prüfen Sie gelegentlich Zellen unter dem Mikroskop. Infizierte Zellen in der Regel größer, runder erscheinen, haben Kerne vergrößert, und beginnen zu (Abbildung 4) zu lösen. </li><li> Ernte der Zellen und die Bestätigung der Proteinexpression <ol><li> Erntezellen 6 Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Der Überstand enthält das rekombinante Baculovirus - diese werden verwendet, um Arbeitsstamm direkt zu erzeugen, oder können bei 4 ° C über Jahre gelagert werden. </li><li> Um die Proteinexpression überprüfen sammeln Pellets und resuspendieren in 500 ul PBS. Mischungs 50 ul der Suspension mit 50 ul SDS-PAGE-Ladepuffer (enthaltend ein Reduktionsmittel). SDS-PAGE laufen und führen eine Western Blot-Analyse mit einem anti-Hexa-Histidin-Antikörpers, um die Genexpression zu bestätigen. Fügen Zellen aus dem MockTransfektion als negative Kontrollen (Fig. 3). </li></ol></li><li> Herstellung der Arbeitsvorräte <ol><li> Platte 5 x 10 5 Sf9 Zellen / cm 2 in einem T175 cm 2-Kolben und lassen Sie sich für 20 Minuten damit sie in die Schale legen. Ersetzen vollständige TNM-FH-Medium mit TNM-FH-Medium mit 3% FBS (und 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infizieren Zellen mit 100 &amp;mgr; l des Überstands Rettungs. Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage und prüfen Sie gelegentlich, wenn die Zellen infiziert (wie in Schritt 1.2.5 beschrieben.). </li><li> Spin bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min und sammeln Stand. Das ist jetzt Ihre P2 Lager. Diese Aktie kann auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C gelagert werden Wiederholen Sie den Vorgang mit der Infektion 100 ul des Aktien P2, Zellen zu infizieren. Die daraus resultierende Aktien heißt P3 oder Arbeits Lager, die bei 4 ° C gelagert oder direkt für die Proteinexpression verwendet werden kann. Die P3-Lager enthält in der Regel 10 &lt;sup&gt; 7 10 9 Plaque-bildende Einheiten / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Erläuterung: Sf9-Zellen unterstützen das Wachstum von Baculovirus sehr gut. Allerdings ist ihre Fähigkeit, große Mengen an rekombinantem Protein zu sezernieren begrenzt. Deshalb verwenden wir eine andere Insektenzelllinie, High Five-Zellen, die für die Expression der sekretierten rekombinanten Proteinen. Diese Zellen unterstützen keine Baculovirus-Replikation auf sehr hohe Titer 13, aber haben hohe sekretorischen Kapazität. <ol><li> Growing up High Five-Zellen High Five-Zellen wachsen in SFX Insektenzellkulturmedium, in T175-cm 2-Kolben. Passage jeden zweiten Tag 01.03. Für eine 200 ml Expressionskultur müssen Sie 5 Flaschen konfluent wachsen. </li><li> Ernte und High Five-Zellen infizieren <ol><li> Nehmen High Five-Zellen von 5 T175 cm 2-Kolben, indem die Flaschen mit der Hand. Sammeln Sie die Zelle UntBrnsion und Transfer in 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spin bei 1200 × g für 7 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Dekantieren und vereinen die Pellets durch Resuspendieren in 15 ml P3 Lager. </li><li> Lassen Sie sitzen für 15 Minuten in der Flow-Haube (Abbildung 5). </li><li> Bringen Sie 200 ml Hyclone SFX Kulturmedium in einen sauberen, sterilen 1.000 ml Schüttelkolben (ohne buffles, mit Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren verschlossen sind, müssen nicht für Bakterienkulturen verwendet haben). </li><li> Übertragen Sie die P3/cell Suspension in den Schüttelkolben. Siegel mit steriler Aluminiumfolie und Transferkolben in einen Shaker. Schütteln bei 70 Umdrehungen pro Minute bei 28 ° C für 72-96 Std. </li></ol></li><li> Ernten rekombinanten Protein aus High Five Zellexpressionsüberständen <ol><li> 72-96 Stunden nach der Infektion Übertragung Kulturüberständen in 500 ml Zentrifugation Eimer. Spin bei 5.500 × g für 20 min bei 4 ° C. In der Zwischenzeit spülen Sie die Schüttelkolben 3x mit doppelt destilliertem Wasser(DdH 2 O). </li><li> Übertragungs 3 ml Ni-Harz-Aufschlämmung in einen 50-ml-Röhrchen mit 45 ml PBS (man braucht pro 200 ml Kultur). Gut schütteln und drehen sich mit 3.000 × g bei Raumtemperatur für 10 min. Dekantiert die PBS und halten die Pellets. Mischen Sie die Insektenzellüberstand mit der Ni-Harz-Pellet und Überführung in den bereits gespült Schüttelkolben. Inkubation bei 4 ° C für 2-4 h unter Schütteln (Abbildung 6). </li><li> Berg 10 ml Polypropylen-Säule auf einer Klemme auf einem Standfuß. Entfernen Sie die beiden Kappen und setzen Sie ein Becherglas unter der Spalte um den Fluss durch (Abfall) zu sammeln. Nehmen Sie die Schüttelkolben aus dem Shaker und beginnen, den Überstand / Schlammgemisch auf die Säule zu übertragen, es wird die Ni-Harz erhalten und nur der Überstand wird durch fließen. Geben über das gesamte Volumen der Säule (7). </li><li> Mit 15 ml Waschpuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) Waschen des Harzes 4x. Lassen Sie alle Waschpuffer Ablaufaus der Spalte und schließen Sie es mit der Kappe (untere Seite). </li><li> 2 ml Elutionspuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol, pH 8) und lassen Sie sich für 5 min. Öffnen Spalte und sammeln das Eluat. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 mal (mit insgesamt 8 ml Elutionspuffer). Eluat, die hohe Konzentrationen von Protein enthält, zeigt typischerweise Schaum beim Schütteln (Abbildung 7). Halten Eluat auf nassem Eis, wann immer möglich. </li></ol></li><li> Pufferaustausch und Konzentration <ol><li> Prespin 15 ml Ultrafiltrationseinheiten Zentrifugation bei 3.000 × g bei 4 ° C für 20 Minuten (30 kDa cut-off für HA / NA, kann aber je nach dem gereinigten Protein der Größe variieren) mit PBS (pH 7,4-7,6). Verwerfen und durch Last Eluat fließen auf die Spin-Säule. Füllen Sie 5 ml sterilem, eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C </li><li> Fördermenge durch wieder auffüllen mit 15 ml eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C Wiederholen Sie diesen VerfahDure noch einmal. </li><li> Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Zentrifuge und sammeln den Puffer ausgetauscht Konzentrat (typischerweise 200 ul). Dies ist hoch konzentriert rekombinanten Proteins. Mit 400 ul sterilem eiskaltem PBS spülen Spin-Säule und fügen Sie diese dem Konzentrat. Halten Sie das Konzentrat auf Eis zu allen Zeiten. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung und Qualitätskontrolle <ol><li> Messung der Proteinkonzentration Einen aliquoten des Konzentrats und messen, indem Sie Ihre Proteinquantifizierung Methode der Wahl. Eingestellt Proteinkonzentration auf 1 mg / ml durch Zugabe von PBS und gefrier kleinen Aliquoten bis -80 ° C Einfrieren und Auftauen schadet der Proteinstruktur und können, um die Aggregation führen. </li><li> SDS-PAGE und Coomassie-Färbung Führen Sie 500 ng Ihres Proteins auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Färbung durchführen. Für eine schnelle und bequeme Färbung verwenden Coomassie Reagenz in Kombination mit einer Mikrowelle Protokoll. HA-Proteine ​​bei 64 erscheinen in der RegelkDa wohin NA Proteine ​​sollten bei einer Größe von ca. 56 kDa (8A und B) durchgeführt. Mit dem beschriebenen Protokoll sollten Sie sehen keine Abbauprodukte. Wenn Abbau auftritt, ist es meist ein Zeichen von Hefe / Pilz-Kontamination während der Expression. In diesem Fall wiederholen Sie den Vorgang und stellen Sie sicher, alles steril zu halten. </li><li> Western-Blot / ELISA Um die Protein Identität zu überprüfen empfehlen wir tun, um eine Western-Blot-oder ELISA-Test mit einem spezifischen Antikörper. Idealerweise werden ELISA-Tests mit einem Antikörper, der an konformationelle Epitope (z. B. Anti-HA-Antikörper Stiel 1) bindet, durchgeführt. Unter Verwendung eines solchen Antikörpers kann die korrekte Faltung des Proteins bestätigt (Fig. 8C). </li><li> Mess NA-Aktivität Die korrekte Faltung des viralen NA kann auch durch Messen NA-Aktivität bestimmt werden. Wir empfehlen, diesen Test mit den im Handel erhältlichen NA * STAR-Assay (folgen Sie einfach den Benutzerrichtlinien) durchzuführen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Obwohl die Expression von Influenzavirus HA-und NA-Proteinen in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystem ist in der Regel geradlinig, gibt es einige wichtige Punkte zu beachten. Es ist wichtig, wie in der Einleitung erwähnt, dass die Ektodomäne von HA und NA werden in Fusion mit Trimerisierung oder Tetramerisierung Domänen exprimiert sind. Diese Bereiche gewährleisten eine korrekte Faltung der Moleküle in der Regel von der Transmembran-Domäne, die nicht vorhanden ist, wenn nur die Ektodomäne exp...

Als eine erste Reaktion auf die jüngste Aufkommen der neuen H7N9 Influenzavirusstamm in China, haben wir Plasmide die genomischen Sequenzen für Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)-Gene der ersten zwei Isolate. Unter Verwendung dieser Plasmide waren wir in der Lage, schnell zu konstruieren Baculovirus-Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten HA-und NA in Insektenzellen. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und ist entscheidend für viele unserer laufenden Forschungsprojekte 8.1 bewiesen. Insektenzellen sind in der Lage, korrekt zu falten und post-translational komplexe Proteine ​​ändern. Diese Modifikationen umfassen N-verknüpften Glykosylierung, die für viele virale Glykoproteine ​​ist. Als solches ist es nicht verwunderlich, dass das Baculovirus-System exprimiert wird ganz für Influenzavirus-Oberflächenantigen hergestellt. In der Tat sind viele der HA-und NA-Kristallstrukturen unter Verwendung von Insektenzellen exprimierte Proteine ​​9-11 gelöst. Ein weiterer Vorteil derSystems liegt in seiner zuverlässigen hohen Protein-Ausbeuten von bis zu 30 mg HA / L Zellkultur (basierend auf unserer Erfahrung mit mehr als 50 verschiedene HA-Proteine) - eine Folge von Virus-Infektion Ausdruck angetrieben von der starken Polyhedrinpromotor. Entfernung der Transmembran-und Endodomäne der HA-und NA-Proteine ​​können für die Expression von sezernierbaren lösliche Versionen der Proteine ​​und somit das Reinigungsverfahren erheblich vereinfacht. Darüber hinaus sind diese Ektodomäne Hexahistidin markiert und kann daher unter Verwendung von Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni 2 +-Harz gereinigt werden. Die Transmembrandomänen von HA und NA-Proteine ​​tragen zu Homotrimer Homotetramer und Bildung auf. Um diese Oligomerisierungen bewahren, eine C-terminale Trimerisierungsdomäne fügen wir die HA-und ein N-terminales Tetramerisierungsdomäne zum NA konstruiert (Abb. 1). Wir haben eindeutig gezeigt, dass eine solche Trimerisierungsdomäne stabilisiert funktional, Folgenrved Konformationsepitope auf dem Halm-Domäne von HA 1. Die richtige Tetramerisierungsdomäne des NA könnte auch Falt-und NA-Funktion 10 zu korrigieren beitragen. Sequenzen und Baculo-Transfer-Vektoren, Trimerisierung oder Tetramerisierung Domains können von den Autoren oder von anderen Laboratorien auf dem Gebiet, 9,10,12 angefordert werden. Eine weitere wichtige Frage für die Expression von sezernierten Proteinen in Insektenzellen ist die Auswahl der richtigen Zelllinie. Während Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen abgeleitet unterstützen Baculovirus-Replikation sehr gut und werden im Allgemeinen für die Virusausbreitung und Rettungs verwendet, sie haben Kapazität, große Mengen an Protein zu sezernieren beschränkt. Trichoplusia ni gewonnen BTI-TN-5B1-4-Zellen (allgemein bekannt als High Five) eine höhere Kapazität und Sekretion sind die Zelllinie der Wahl, die für die Expression in diesem Protokoll 13,14. Darüber hinaus ist es hilfreich, zu reduzieren oder sogar beseitigen fötalem Rinderserum (FBS) von Expressionskulturen. Wir verwenden daher mit Medien reduziert (3%) FBS Inhalt für das Wachstum der Viren-Arbeits Aktien, und wir haben die Proteinexpression in Serum-freien Medien durchzuführen. Rekombinanten HA-und NA-Proteine ​​für viele immunologische Techniken verwendet. Vielleicht die häufigste ist in ELISA-Tests zur Messung der Serumkonversion bei der Impfung von Menschen oder Tieren 4,6,7,15. Aufweist und NA sind auch in ELISPOT Assays sowohl stimulierende Moleküle und Nachweisreagenzien für Antikörper sekretierende Zellen 16 verwendet. Ihre Verwendung als molekulare Köder ermöglicht, die speziell für Plasmablasten oder andere Arten von B-Zellen, die dann verwendet werden kann, um (therapeutische) monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu isolieren, zu sortieren. Rekombinanten HA-und NA-Moleküle werden in der Charakterisierung dieser mAbs 8 verwendet. Weitere Beispiele sind die pH-Stabilität zu studieren oder Rezeptorspezifität wurde von anderen Virus-Isolate ausgedrückt, oder quantitativ Beurteilung spezifischer NA enzymatischeAktivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren. Außerdem rekombinante, gereinigte HA HA verwendet werden, um Inhalte von inaktivierten Influenza-Virus-Impfstoffen zu standardisieren. Wichtig ist, rHA (und zu einem gewissen Grad NA)-Impfstoff-Kandidaten werden derzeit in Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen mit einem Impfstoff von der FDA im Jahr 2013 zugelassen 2,17-19 getestet. Der Vorteil dieser neuartigen Impfstoffen ist, dass aufgrund der Natur der rekombinanten Proteine, die arbeitsintensive Prozess der Erzeugung von hohen Wachstums reassortanten Viren vermieden werden. Vielleicht noch relevant ist die Tatsache, dass ihre Ausbeute an HA hohe und reproduzierbare von Stamm zu Stamm. Da diese Impfstoffe in einer Eierfreien System hergestellt, sie enthalten keine Proteinverunreinigungen, die problematisch für Menschen mit Allergien Ei sind. Hier haben wir uns für die HA-und NA-Proteine ​​aus zwei Isolate des neuen chinesischen H7N9 Influenza-Virus A / Anh ausdrückenui/1/13 und A/Shanghai/1/13 20,21. Das sind zeitnahe Beispiele, aber die beschriebene Protokoll kann zur Expression Influenza A-und B-HA-oder NA-Proteine ​​verwendet werden, und kann angepasst werden, um irgendwelche anderen sekretierten virale oder zelluläre Proteine ​​zu exprimieren. Trimeres oder tetrameres Transmembranproteine ​​können in die Expressionskassetten für HA und NA verwendet kloniert sind. Allerdings sind die meisten löslichen sekretierten zelluläre Proteine, wie Interferone, zum Beispiel nicht einen zusätzlichen Domänen zur Stabilisierung brauchen, und kann nur mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag ausgedrückt werden.

<table><tbody><tr><td>Name des Materials/ der Ausrüstung</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers</td></tr><tr><td>TNM-FH Insektenmedium</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrigual Filter Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Säulen (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Maximale Effizienz DH10Bac-Bakterien</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmidfilter Midiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>für Elutions- und Waschpuffer</td></tr><tr><td>Sf9-Zellen</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five</td><td>cells Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinante expression von funktions hämagglutinin und neuraminidase-proteine ​​aus dem roman h7n9 influenza-virus mit dem baculovirus-expressionssystem

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Expression von rekombinanten Proteinen. Hier verwenden wir es richtig gefaltet und glykosylierten Varianten des Influenza-A-Virus-Oberflächen Glykoproteinen produzieren - das Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Als Beispiel haben wir die HA-und NA-Proteinen durch das neuartige H7N9-Virus, das vor kurzem in China entstanden ausgedrückt. Jedoch kann das Protokoll leicht für HA-und NA-Proteine ​​von einem anderen Influenza A-und B-Virus-Stämmen exprimiert angepasst werden. Rekombinante HA (rHA) und NA (RNA)-Proteine ​​sind wichtige Reagenzien für immunologische Tests wie ELISA und ELISPOT und sind auch im breiten Einsatz für die Impfstoff-Standardisierung, Antikörper-Entdeckung, Isolierung und Charakterisierung. Darüber hinaus können rekombinante NA-Moleküle Bild für kleine Moleküle als Inhibitoren verwendet werden und sind nützlich für die Charakterisierung der enzymatischen Funktion der NA, sowie seiner Empfindlichkeit gegenüber antiviralen Mitteln. Rekombinanten HA-Proteine ​​sind auch being getestet experimentelle Vakzine in Tiermodellen, und ein Impfstoff auf Basis von rekombinanten HA wurde kürzlich von der FDA zur Verwendung bei Menschen zugelassen. Die Methode, die wir hier beschreiben, diese Moleküle zu erzeugen ist einfach und kann die Forschung in Labors Influenza zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen von Proteinen schnell und zu geringen Kosten. Obwohl hier konzentrieren wir uns auf Influenza-Virus Oberflächen-Glycoproteine, kann diese Methode auch verwendet werden, um andere virale und zelluläre Oberflächenproteine ​​zu produzieren.

HA-Moleküle aus A/Shanghai/1/13 und A/Anhui/1/13 gut mit Ausbeuten von etwa 20 mg / l Kultur ausgedrückt. NA-Moleküle beider Stämme zeigte moderate Expressionsniveaus im Bereich von 0,2 mg / l Kultur A/Shanghai/1/13 bis 0,7 mg / l für A/Anhui/1/13. Alle vier Proteinpräparate hatten sehr wenig bis gar keine Verunreinigungen (8A und B) mit HAS wobei der höhere Reinheit als NA, die durch die Expressionsniveau erklärt werden kann. A/Shanghai/1/13 HA wurde weiter mittels ELISA mit dem breit ...

Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine ​​exprimieren.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, korrekt gefaltetes gereinigtes Influenza-, Hämagglutinin- und Neuraminidase-Oberflächenglykoprotein für immunologische Assays und Impfexperimente zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst das rekombinante BMid mit Influenza-Genen kloniert wird, gefolgt von der Erzeugung rekombinanter Baula-Viren. Der zweite Schritt besteht darin, diese rekombinanten Baula-Viren zu verwenden, um Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine in Insektenzellen zu exprimieren.Anschließend werden die rekombinanten Proteine mittels Affinitätschromatographie aus dem Zellkulturüberstand aufgereinigt. Der letzte Schritt besteht darin, diese Proteine zu charakterisieren, um eine gute Qualität und biologische Funktionalität zu gewährleisten. Letztendlich werden die rekombinanten Proteine verwendet, um die Immunantwort auf die Oberflächenglykoproteine des Influenzavirus zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der bakteriellen Expression von HA one besteht beispielsweise darin, dass die gereinigten Antigene korrigierend gefaltet sind und auch biologisch aktiv bleiben, im Gegensatz zur Verwendung ganzer Viruspräparate für immunologische Assays. Diese Reagenzien ermöglichen die Messung der Immunantwort gegen die Hämagglutinin- und Nicht-Neuraminidase-Proteine. Beginnen Sie dieses Protokoll nur mit der Erzeugung eines rekombinanten Baula-Virus, wie im Textprotokoll beschrieben, das aseptisch in einer Laminar-Flow-Haubenplatte arbeitet, SF neun Insektenzellen in sechs Well-Platten bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter.Und sitzen wir 20 Minuten in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator ohne CO2. Mischen Sie dann zwei Mikrogramm rekombinante Rückenmitte mit 100 Mikrolitern Trico Leia Knie Medium Formulierung HINK oder TNM fh. Mischen Sie dann sechs Mikroliter des Transfektionsmittels mit 100 Mikrolitern TNM FH Insektenmedium.Kombinieren Sie die beiden Volumina, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Transfektionsmischung 20 Minuten ruhen. Bei Raumtemperatur ist eine Scheintransfektion als Kontrolle enthalten, die das Transfektionsreagenz, aber keine DNA enthält. Entfernen Sie das SNAT von den plattierten SF-Neun-Zellen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter serumfreies TNM FH-Medium, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung enthält.Geben Sie das gesamte Volumen der Transfektionsmischung in die Zellen und schütteln Sie die Sechs-Well-Platte vorsichtig fünf Sekunden lang. Inkubieren Sie in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator ohne CO2 für sechs Stunden. Ersetzen Sie das Medium durch frisches, volles TNM FH-Medium, bevor Sie die Platte sechs Tage lang unter denselben Bedingungen inkubieren.Kontrollieren Sie die Zellen gelegentlich unter dem Mikroskop. Infizierte Zellen erscheinen in der Regel größer. Die Rounder haben vergrößerte Kerne und beginnen sich abzulösen.Die Zellen werden sechs Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation bei 2000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur entnommen. Der Überstand enthält das rekombinante Baula-Virus und wird sofort zur Erzeugung von Arbeitsbeständen verwendet oder kann jahrelang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Überprüfen Sie die Proteinexpression über die SDS-Seite und den Western Blot und bereiten Sie die Arbeitsbestände vor, wie im Textprotokoll beschrieben.SF nine Zellen unterstützen das Wachstum des Makulavirus sehr gut. Ihre Fähigkeit, große Mengen an rekombinantem Protein zu sezernieren, ist jedoch begrenzt. Daher verwenden wir eine weitere Insektenzelllinie.High Five Zellen für die Expression von sezernierten rekombinanten Proteinen. Diese Zellen unterstützen das Wachstum des Balo-Virus zu hohen Titern nicht, haben aber eine sehr hohe sekretorische Kapazität. Züchten Sie fünf Zellen in SFX Insektenzellkulturmedium in T 175 Quadratzentimeter Kolben Durchgang jeden zweiten Tag.Sie werden im Verhältnis eins zu drei aufgeteilt. Züchten Sie fünf konfluente Fläschchen für eine 200-Milliliter-Expressionskultur, um die High-Five-Zellen zu ernten und zu infizieren. Trennen Sie zuerst die High-Five-Zellen, indem Sie auf die Kolben klopfen.Die Zellsuspension auffangen und in 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen überführen. Schleudern Sie die Röhrchen bei 1200 G sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und vereinigen Sie die Pellets durch Reanimation, indem Sie sie in 15 Millilitern P drei Brühe suspendieren.Lassen Sie die Zellen 15 Minuten in der Strömungshaube ruhen. Übertragen Sie 200 Milliliter SFX-Kulturmedium mit hohem Klongehalt in einen sauberen, sterilen 1000-Milliliter-Schüttelkolben. Dann wird die P-Drei-Zell-Suspension in den Schüttelkolben mit steriler Aluminiumfolie versiegelt, bevor sie 72 bis 96 Stunden lang bei 70 U/min und 28 Grad Celsius geschüttelt wird.Gewinnung von rekombinantem Protein aus Überständen mit hoher Fünfzellexpression 72 bis 96 Stunden nach der Infektion. Kulturüberstände in 500-Milliliter-Zentrifugationsbecher umfüllen. Bei 5.500 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius schleudern.Spülen Sie in der Zwischenzeit den Shaker-Kolben dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus. Nächste Pipette. Drei Milliliter Nickelharzaufschlämmung in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Millilitern PBS pro 200 Milliliter Kultur.Vor dem Schleudern 10 Minuten bei 3000 g und Raumtemperatur nach dem Zentrifugieren gut schütteln. Dekantieren Sie das PBS und bewahren Sie das Pellet auf. Mischen Sie den Insektenzellenüberstand mit dem Nickelharzpellet und geben Sie ihn in die bereits gespülten Schüttelkolben.Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Stunden unter Schütteln. Montieren Sie als Nächstes eine 10-Milliliter-Säule aus Polypropylen an einer Klemme an einem Stützständer. Entfernen Sie beide Kappen und platzieren Sie ein Becherglas unter der Säule, um den Durchfluss aufzufangen.Nach der Inkubation des Schüttelkolbens ist mit dem Umfüllen der überstehenden Güllemischung auf die Säule zu beginnen. Es hält das Nickelharz zurück und nur der Überstand fließt hindurch. Übergeben Sie das gesamte Volumen über die Spalte.Waschen Sie das Harz viermal mit 15 Millilitern Waschpuffer. Lassen Sie den Waschpuffer aus der Säule abtropfen und verschließen Sie die untere Seite mit der Kappe. Fügen Sie zwei Milliliter elucianischen Puffer hinzu und lassen Sie uns fünf Minuten lang sitzen.Öffne die Säule und sammle das Eit, wobei du es nach Möglichkeit auf nassem Eis aufbewahrst. Wiederholen Sie dies noch dreimal. Ein EIT, das hohe Proteinkonzentrationen enthält, zeigt typischerweise Schaum, wenn es geschüttelt wird, um den Puffer auszutauschen und das Protein zuerst zu konzentrieren, 15-Milliliter-Ultrafiltrationszentrifugationseinheiten mit PBS bei 3000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.Verwerfen Sie den Durchfluss und laden Sie das EIT auf die Spin-Säule. Füllen Sie die Säule mit fünf Millilitern sterilem, eiskaltem PBS, bevor Sie sie unter den gleichen Bedingungen 60 Minuten lang schleudern. Den Durchfluss wieder ablassen, mit 15 Millilitern eiskaltem PBS nachfüllen und weitere 60 Minuten schleudern.Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal und sammeln Sie dann das ausgetauschte Pufferkonzentrat, das das hochkonzentrierte rekombinante Protein darstellt. Bewahren Sie das Konzentrat immer auf Eis auf. Spülen Sie die Schleudersäule mit 400 Mikrolitern sterilem eiskaltem PBS und geben Sie dieses zum Konzentrat.Das Protein kann dann wie im Textprotokoll beschrieben charakterisiert werden. Die HA- und NA-Proteine, die von den ENUE- und Shanghai-Stämmen exprimiert wurden, zeigten moderate Expressionsniveaus von 0,2 Milligramm pro Liter für Influenza A, die in Shanghai gesammelt wurde, bis zu 0,7 Milligramm pro Liter für Influenza. A, das in Enue, Neuraminidase- oder NA-Molekülen beider Stämme gesammelt wurde, zeigte moderate Expressionswerte, die von 0,2 Milligramm pro Liter Kultur für Influenza A in Shanghai bis 0,7 Milligramm pro Liter für Influenza A in Enue reichten.Alle vier Proteinpräparate wiesen sehr geringe bis gar keine Verunreinigungen auf, wobei ha von höherer Reinheit als nas war, was durch den Expressionsgrad erklärt werden kann. Influenza A, das in Shanghai HA gesammelt wurde, wurde mit ELI SA mit dem breit neutralisierenden stielreaktiven humanen monoklonalen Antikörper CR 9 1 1 4 weiter analysiert. Wie hier in Blau dargestellt, bindet dieser monoklonale Antikörper an ein sensitives Bestätigungsepitop in der Stammdomäne und wird hier als Sonde für die korrekte Faltung dieser Domäne verwendet.Der Antikörper zeigt eine gute Bindung, was sich in einer erhöhten Absorption bei 490 Nanometern zeigt, was die Sicherheit gibt, dass das HA tatsächlich korrekt gefaltet ist. Eine zweite, Eliza mit Anti-Hämagglutinin des polyklonalen Mausserums vom Subtyp 7, wurde durchgeführt, um die Identität des erhaltenen Proteins als Hämagglutinin des Subtyps 7 zu bestätigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie Sie rekombinante Influenzavirus-, Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine in Ihrem Labor exprimieren können.Dieser Prozess könnte auch für die Expression anderer viraler oder zellulärer Membranproteine nützlich sein. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Oberflächenplasmonenresonanz zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen mit einem Sensorchip

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Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

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Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

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Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

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Lernen Sie die rekombinante Expression funktionaler Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine aus dem H7N9-Influenzavirus im Baculovirus-Expressionssystem. Diese Methode ermöglicht die Produktion korrekt gefalteter viraler Oberflächenantigene für immunologische Studien.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem (Video) | JoVE Journal

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

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