Chemotaxis-Versuche in C. elegans

Die Bewegung einer Zelle oder eines Organismus als Antwort auf chemische Impulse ist ein Verhalten, dass auch als Chemotaxis bezeichnet wird. In diesem Video werden wir lernen wie ein Chemotaxis Experiment mit dem Fadenwurm C. elegans durchgeführt wird. Wir behandeln außerdem wie Chemotaxis Experimente in C. elegans angewendet werden, um Lernen und Gedächtnis, Geruchsadaption, und Alzheimer besser zu verstehen.

Zuerst gehen wir auf die zwei verschiedenen Arten von Chemotaxis ein. Die Bewegung zu einem chemischen Stimulus hin wird als positive Chemotaxis bezeichnet. Im Gegensatz dazu wird die Bewegung weg von einem chemischen Stimulus als negative Chemotaxis bezeichnet. Durch negative Chemotaxis können sich Organismen weg von schädlichen Chemikalien bewegen.

Chemotaxis kann auf der Ebene von Organismen stattfinden, wenn sie sich zu einer Nahrungsquelle bewegen. Chemotaxis kann allerdings auch auf zellulärer Ebene, in Organismen, stattfinden. Immunzellen migrieren beispielsweise zu den Pathogenen oder der Stelle der Entzündung. Ein anderes Beispiel sind Spermazellen, die sich als Antwort auf einen chemischen Lockstoff zu einer Eizelle hin bewegen. Chemotaxis ist auch ein wichtiger Prozess in der Entwicklung, in welcher Zellen sich als Antwort auf einen chemischen Stimulus bewegen, um Gewebe und Organe in sich entwickelnden Organismen zu bilden.

Für freie, in der Erde lebende C. elegans ist die Chemotaxis wichtig, um Bakterien – ihre Hauptnahrungsquelle - aufzuspüren und sich zu ihnen hin zu bewegen. Im Gegensatz dazu werden C. elegans durch Schwermetalle, Substanzen mit niedrigem pH-Wert und Detergenzien, die giftig für den Organismus sind, abgeschreckt.

Chemotaxis Experimente fangen normalerweise mit der Herstellung einer Chemotaxis-Platte an. Mit einem Lineal und einem Stift unterteil man eine 5 cm Platte mit Wurmwachstumsmedium in 4 gleich große Quadranten. Dann zeichnet man einen Kreis mit einem Radius von 0.5 cm um den Mittelpunkt des Quadranten. Das ist der Startpunkt der Würmer. Dann markiert und beschriftet man einen Punkt in jedem Quadranten, so dass alle Punkte die gleiche Entfernung von dem Mittelpunkt und voneinander haben.

Wenn man Würmer für das Experiment vorbereitet, ist es wichtig alters-synchronisierte, junge erwachsene Würmer zu nehmen, so dass Unterschiede in der Chemotaxis keine Artefakt der Entwicklungsstufe sind. Wenn die Würmer synchronisiert sind, sammelt man sie durch das Pipettieren von 2 ml S-basal Puffer auf die Platte mit den jungen Erwachsenen. Man schwenkt und kippt die Platte, um die Würmer von der Platte zu waschen.

Nun pipettiert man die Wurm/S-Basal Lösung in ein Zentrifugiergefäß. Man wäscht die Würmer kurz, indem man die Wurm/S-basal Lösung zentrifugiert und den Überstand abgießt. Danach gibt man nochmals einen Milliliter der S-basal Lösung zu dem Wurmpellet. Man dreht das Gefäß um und wäscht zwei weitere Male. Nach dem Waschen entfernt man die S-basal Lösung und lässt 100 µl übrig. Nun gibt man 2 µl der Wurm/S-basal Mischung auf eine NGM platte. Mit einem Mikroskop zählt man wie viele Würmer vorhanden sind. Idealerweise sollten 50-250 Würmer in 2µl S-basal Lösung sein.

Nun dass die Chemotaxis-Platten und die Würmer bereit sind, können wir mit dem Chemotaxis Experiment beginnen. Zuerst mischt man das gleiche Volumen der Testlösung mit 0.5 M Natriumazid, einem Anästhetikum, welches die Würmer lähmt wenn sie ihr Ziel erreicht haben. Dass selbe macht man mit der Kontrolllösung. Nun pipettiert man 2 µl der Wurm/S-basal Mischung auf die Mitte der Chemotaxisplatte. Danach pipettiert man 2 µl der Test oder Kontrolllösung auf die richtig beschrifteten Punkte auf der Chemotaxisplatte. Wenn die Test- und Kontrolllösungen absorbiert worden sind, setzt man den Deckel auf, dreht die Platte um, und stellt den Timer auf eine Stunde.

Nachdem die Würmer eine Stunde Zeit hatten, um auf den chemischen Impuls auf der Platte zu reagieren, können die Daten analysiert werden. Man zählt die Anzahl der Würmer in jedem Quadranten manuell. Wenn die Würmer von der Testchemikalie angezogen werden, findet man mehr Würmer in diesen Quadranten vor. Wenn sie der Chemikalie gegenüber gleichgültig sind, sind gleich viele Würmer in den Quadranten zu finden.

Diese Daten werden benutzt, um den chemotaktischen Index zu berechnen, also der Anzahl der Würmer in dem Testquadranten minus der Anzahl der Würmer in dem Kontrollquadranten, geteilt durch die Gesamtanzahl der Würmer. Ein chemotaktischer Index um 1 weist auf eine Anziehung, und ein chemotaktischer Index um -1 auf eine Abstoßung hin.

Nun dass wir gelernt haben wie man ein Chemotaxis Experiment ansetzt, schauen wir uns an wie diese Experimente angewendet werden, um wissenschaftliche Fragen zu beantworten.

Eine Art wie Chemotaxis Experimente verwendet werden, ist um Lernen und Gedächtnis zu untersuchen. Zum Beispiel können Würmer konditioniert werden, um einen chemischen Stimulus mit einer Nahrungsquelle zu assoziieren. Gut gefütterte Würmer werden für eine Stunde ausgehungert und dann mit Nahrung und einer Chemikalie wie zum Beispiel Butanon konditioniert.

Danach werden die Würmer auf einer Platte mit Nahrung, aber ohne Butanon gehalten. Ein Chemotaxis Experiment kann denn bestimmen, ob die Würmer gelernt haben Butanon mit Nahrung zu assoziieren. Viele Variationen dieses Experiments können ausgeführt werden, um andere Informationen zu erhalten, wie zum Beispiel welche Gene oder welche Neuronen wichtig für das Lernen und das Gedächtnis sind.

Die Geruchsadaption ist ein Phänomen, das auftritt wenn sensorische Neuronen mit der Zeit ihre Antwort auf Stimuli verringern, wodurch die Tiere auf andere, potentiell wichtigere Stimuli, reagieren können. Zum Beispiel, wenn wildtyp C. elegans einem Geruch über längere Zeiträume ausgesetzt sind, ignorieren sie diesen Geruch und werden nicht von ihm in einem Chemotaxis Experiment angezogen, da die Geruchsadaption stattgefunden hat. Dadurch können Hochdurchsatz genetische Screen gemacht werden, um die genetische Regulation der Geruchsadaption zu erforschen, wie zum Beispiel durch das Gen egl-4. Darüber hinaus können transgene Würmer welche fluoreszent-markierte Proteine enthalten, beobachtet werden, um zu sehen ob sich ihre Lokalisation währen der Geruchsadaption verändert.

Letztlich können Chemotaxis Experimente in C. elegans benutzt werden, um Alzheimer zu erforschen. Wissenschaftler können fluoreszent-markierte, humane amyloid-beta Peptide – ein Markenzeichen von Alzheimer – in den Neuronen von C. elegans exprimieren. Interessanterweise haben Chemotaxis Experimente gezeigt, dass die Expression von Beta-Amyloid in einer Population von Neuronen zu weniger Chemotaxis hin zu einem Lockstoff im Vergleich zu einer Kontrolle führt. Viele Variationen dieses Experiments können ausgeführt werden, einschließlich der Expression von Beta-Amyloid in anderen Neuronenpopulationen oder Geweben, oder der Bestimmung, ob es Substanzen gibt, welche die Effekte der Beta-Amyloid Expression vermindern, was schließlich zu potentiellen Therapien führen kann.

Das war die Einführung in Chemotaxis in C. elegans von JoVE. Zu erst haben wir definiert was Chemotaxis ist und weshalb sie wichtig für Organismen und Zellen in der Natur ist. Danach haben wir gezeigt wie man ein Chemotaxis Experiment mit C. elegans ansetzt. Letztlich haben wir behandelt wie Chemotaxis angewendet wird um Lernen, Gedächtnis, Geruchsadaption, und Alzheimer besser zu verstehen. Danke für eure Aufmerksamkeit.