Haltung von C. elegans

<em>C. elegans</em> Maintenance

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Maintenance

3.2: Drosophila Maintenance

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10:54 min

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May 10, 2013

Overview

Caenorhabditis elegans war, und ist immer noch, einer der erfolgreichsten Modellorganismen, um vielfältige entwicklungsbiologische, genetische, molekulare und physikalische Phänomene zu untersuchen. Um das volle Potenzial von C. elegans auszuschöpfen, muss man auf die richtige Pflege und Versorgung dieses leistungsstarken Modellorganismus achten.

In diesem Video werdet ihr die grundlegenden Anforderungen der Behausungs- und Fütterung von C. elegans lernen. Außerdem behandeln wir wie man Würmer mit einem Wurmspatel handhabt, und wie man Wurmvorräte einfriert und wieder auftaut. Am Ende des Videos zeigen wir ein paar Anwendungen, bei denen man die Behausung, Fütterung und Handhabung dieser wichtigen Tiere modifiziert.

Procedure

Die richtige Pflege und Haltung von Caenorhabditis elegans ist wichtig für das Ausführen von erfolgreichen Experimenten.

Sie brauchen sehr wenig Platz, ihre Behausung ist kostengünstig und sie sind sehr fruchtbar und einfach zu handhaben. Aber nur weil es einfach ist sie zu halten, bedeutet dass nicht dass die Forschung mit den Würmern schlecht ist! Sydney Brenner hat C. elegans sogar als das Geschenk der Natur an die Wissenschaft bezeichnet. Seit seiner ersten Benutzung im Jahr 1974 wurde der Wurm für Experimente benutzt, welche mit dem Nobelpreis ausgezeichnet worden sind.

In diesem Video zeigen wir einige einfache Methoden um C. elegans im Labor zu halten, einschließlich der Behausung und der Fütterung, der Handhabung und dem Gefrieren und dem Auftauen von Würmern.

In der freien Wildbahn sind C. elegans meist in der Erde vorzufinden und ernähren sich von sich zersetzenden, pflanzlichen Material. Im Labor ist es wichtig die Würmer so zufrieden wie möglich zu halten. Dafür gibt es bestimmte Methoden zur Behausungen und zur Fütterung.

C. elegans können bei 16, 20, oder 25ºC, abhängig von den experimentellen Anforderungen, entweder auf festem oder in flüssigem Medium gehalten werden. In beiden Fällen werden sie mit OP50 gefüttert, also einem standardisierten E. coli Stamm, der speziell für Würmerkulturen in Labors weltweit verwendet wird.

Bei 25ºC durchlaufen C. elegans ihren Lebenszyklus 2.1 Mal schneller als bei 16ºC. Ein schnellerer Lebenszyklus bedeutet dass die Würmer schneller reifen, mehr Eier legen, und mehr Essen essen. Wenn die Würmer hungern gelassen werden oder wenn die Bevölkerung zu dicht ist, gehen sie in ein Larvenstadium über, was auch „Dauer-Stadium“ genannt wird. Larven im Dauer-Stadium sind stressresistent und altern nicht.

Wenn sie auf festem Medium gehalten werden, wachsen C. elegans auf Agarplatten, die mit dem Wurmwachstumsmedium, auch NGM genannt, vorbereitet worden sind. Am Tag bevor man die Platten herstellt, impft man LB Medium mit einer einzelnen OP50 E. coli Kultur. Nun inkubiert man das Medium über Nacht bei 37ºC unter Schütteln. Um festes Medium herzustellen, misst man die entpsrechenden Mengen dieser Inhaltsstoffe und vermischt sie mit destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben.

Nachdem man die Mischung für mindestens 15 Minuten autoklaviert hat, lässt man den Agar im Wasserbad bis auf 55ºC abkühlen. Wenn es auf 55ºC abgekühlt ist, sollte man das Behältnis problemlos mit bloßen Händen anfassen können. Mit angemessener, aseptischer Vorgehensweise können Zusatzstoffe wie Medikamente oder Antibiotika jetzt hinzugegeben werden. Nun vermischt man durch Schwenken. Danach pipettiert man geschmolzenes NGM in Petrischalen bis sie ca. 2/3 voll sind. Die neu hergestellten Platten werden dann zum Trocken über Nacht auf die Laborbank gestellt.

Am nächsten Morgen zentrifugiert man die OP50 Bakterien bei 3500 x g für 10 Minuten, und resuspendiert das Pellet in LB Medium um eine 10X Konzentration herzustellen. Nun pipettiert man die Bakterien in das Zentrum der Platte ohne dabei die Oberfläche des NGMs mit der Pipettenspitze zu berühren. Die Kultur sollte nicht die Wände der Platte berühren. Die Platten werden dann über Nacht auf der Laborbank getrocknet. Wenn sie trocken sind, werden sie unter UV Licht gestellt, um sie zu sterilisieren. Sie sind jetzt fertig, um Würmer zu kultivieren.

Einzelne C. elegans

können mit einem Spatel oder Draht gehandhabt werden. Der Spatel ist normalerweise aus einem 90% Platin- und 10% Iridiumdraht der Stärke 30 gefertigt. Einige Wissenschaftler bevorzugen eine andere Zusammensetzung von Materialen. Um einen Spatel herzustellen, bricht man zuerst die Spitze einer Pasteurpipette bei einer bestimmten Länge ab.

Nun schneidet man einen ca. 3-4cm langen Draht und führt ihn ca. 0.5 cm in die Spitze der Pipette ein. Man versiegelt den Draht und die Pasteurpipette mit einem Bunsenbrenner. Die Länge des Drahtes, der aus dem Glas hervorsteht, ist ca. 3-3.5 cm, kann aber je nach den persönlichen Bedürfnissen unterschiedlich sein.

Man flacht das Ende des Drahts an einer harten Ecke ab. Danach verbiegt man den abgeflachten Teil nach oben, um eine Kelle zu bilden. Danach schleift man die Ecken des Spatels, damit die Würmer nicht beschädigt werden.

Um Würmer auszuwählen, sterilisiert man den Draht des Spatels in einer Flamme. Danach benetzt man die Spitze mit dicken, klebrigen OP50 E. coli von der NGM Platte. Man sollte aufpassen dass die Agaroberfläche nicht durchstochen oder beschädigt wird.

Man schaut durch ein Seziermikroskop und nimmt den Wurm mit dem flachen, klebrigen Spatel auf, bis er daran kleben bleibt. Wenn der Wurm auf dem Spatel ist, transferiert man ihn sofort auf eine neue Platte durch sanftes Auftragen auf die neue Oberfläche mit neuen Bakterien. Der Wurm sollte von dem Spatel runterkrabbeln. Der Wurm sollte nicht allzu lange auf dem Spatel bleiben, da er sonst austrocknet.

Ein Grund weshalb C. elegans ein so beliebter Moldellorganismus für die Forschung ist, ist dass er für lange Zeit ohne Nachteile kultiviert und gelagert werden kann.

Zuerst wäscht man die frisch ausgehungerten Larven mit 0.5 ml M9 Puffer und schwenkt die Platte leicht um alle Larven und erwachsene Tiere zu lösen. Dann transferiert man sie in ein Eppendorf Gefäß oder ein Gefrierbehältnis. Danach gib man die gleiche Menge von 30% Glyzerin und M9 Puffer hinzu. Dann verstaut man die Behältnisse in einem gedämmten Karton und bei -80ºC .

Um die Würmer zurückzugewinnen, holt man sie aus dem -80ºC Gefrierschrank und taut sie bei Zimmertemperatur auf bis der Inhalt komplett geschmolzen ist. Nun wird die Flüssigkeit auf eine frische NGM Platte mit einem OP50 Rasen pipettiert und die Platte dann bei 20ºC inkubiert. Nach 2-3 Tagen transferiert man 10-15 Tiere auf eine neue Platte, wo sie sich für eine Generation fortpflanzen können. Man sammelt die Nachkommen und schaut nach den korrekten Phänotypen.

Nun dass wir gesehen haben wie C. elegans im Labor gehalten werden, schauen wir uns an wie man das Füttern, die Bauhausung und die Handhabung für Experimente verändern kann.

Der Entdeckung der RNA Interferenz, für welche ein Nobelpreis verliehen wurde, ermöglicht es Forschen jedes C. elegans Gen abzuschalten, damit man die Funktion des Gens verstehen kann.

RNAis können in C. elegans eingefügt werden, indem man zuerst Platten mit E. coli vorbereitetet, welche die Ziel-Gen dsRNA exprimieren, und welche von C. elegans gegessen werden. Dann werden Larven im 4. Stadium auf die RNAi Platte transferiert, damit sie Eier legen können. Die Nachkommen werden dann bei dem gewünschten Entwicklungsstadium aufgesammelt und der Phänotyp wird untersucht. Da wir etwa die Hälfte unseres Genoms mit dem Wurm teilen, können wir viele neue Einblicke in humane Krankheiten gewinnen.

Wegen ihres schnellen Lebenszyklus ist C. elegans sehr gut für Untersuchungen des Alterns geeignet.

Zuerst müssen wir eine synchronisierte Population von C. elegans vorbereiten, indem wir erwachsene Hermaphroditen auf NGM zum Eierlegen überführen. Die Würmer legen für 6-8 Stunden Eier und werden danach entfernt.

Wenn die Würmer das geeignete Stadium erreicht haben, werden sie auf neue NGM Platten mit Ampizillin (zur Vermeidung des Bakterienwuchses) und FUDR, um die Fortpflanzung zu verhindern, überführt.

Von hier aus an werden die erwachsenen Würmer alle 2-3 Tage beobachtet, bis alle Würmer gestorben sind. Die toten Würmer werden von der Platte entfernt, und die Anzahl der toten und lebenden Würmer wird notiert.

Die Analyse der Lebensspanne bei speziellen genetischen oder umweltlichen Bedingungen können wichtige Einblicke in die Alterungsprozesse geben.

Mit Lasern können Axotomien, also das Schneiden von einzelnen Axonen in lebenden C. elegans ausgeführt werden, um die Regeneration von Nerven zu untersuchen.

Da aber die Würmer nie still halten, werden sie auf ein 10% Agarpolster in eine Lösung von Mikrokugeln gelegt. Ein Deckglas wird dann daraufgelegt. Die Mikrokugeln erhöhen den Reibungskoeffizienten der Unterlage/Deckglas Interaktion, wodurch die Würmer am gleichen Platz bleiben.

Der Objektträger wird nun für die Axotomien vorbereitet. Die Neuronen werden unter dem Mikroskop zentriert. Der Laser wird dann durch ein Fußpedal betätigt. Die richtige Stärke des Lasers durchtrennt die Neuronen ohne die benachbarten Strukturen zu beeinträchtigen. Es werden so viele Axonen wie möglich pro Tier durch trennt.

Das Agarosekissen wird sorgfältig von dem Objektträger entfernt und die Würmer können sich auf einer NGM Platte mit Bakterien erholen. Zwischen 8-48 Stunden nach der Axotomie werden die Neuronen auf ihre Regeneration überprüft. Distal von dem Schnitt bilden die Neuronen einen Stumpf. Der proximale Teil der Neuronen regeneriert sich und bildet längliche Neuriten.

Das war die Einführung von JoVE in die Haltung von Caenorhabditis elegans. In diesem Video haben wir uns die Behausung und Fütterung, Handhabung, und das Gefrieren und Auftauen von C. elegans angeschaut.

Wir haben uns außerdem einige Anwendungen, weshalb C. elegans ein so leistungsstarkes Forschungswerzeug ist, angeschaut. Auch wenn C. elegans in vielerlei Hinsicht anders als Säugetiere sind, haben sie eine ähnliche genetische Bauweise, und sind einfach zu halten. Da man sie einfach verändern kann sind sie ein wichtiges Modellsystem um Säugetierbiologie und Krankheiten zu verstehen. Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

Correct care and maintenance of Caenorhabditis elegans is essential for successful experiments.

They require very little space, are cheap to house, have high fecundity, and are easy to manipulate. But just because they are simple to keep around does not mean wimpy science. In fact, Sydney Brenner famously called C. elegans “Nature’s gift to science,” and since its introduction in 1974 the worm has been featured in a number of Nobel prize winning experiments.

In this video we will demonstrate basic methods for maintaining C. elegans in the lab, including: housing and feeding, handling, as well as freezing and thawing of worms.

In the wild, C. elegans are found in the soil and feed upon decomposing plant matter. In the lab, it’s important to keep nematodes as happy as possible, and so we house and feed them using very specific methods.

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending upon the requirements of the experiment, and can either be grown on solid or in liquid media. In both cases they are fed OP50, a standardized strain of E. coli used specifically for nematode culture in every worm lab around the world.

When grown at 25 °C, C. elegans complete their life cycle 2.1 times faster than when grown at 16 °C. A faster life cycle means the worms mature faster, lay more eggs and consume more food. If worms are allowed to starve or become too crowded they enter a larval stage called the dauer stage. Dauer larvae are stress resistant and do not age.

When maintained on solid media, C. elegans are grown on agar plates prepared with nematode growth media or NGM media. The day before making plates, inoculate liquid LB media with a single colony of OP50 E. coli. Incubate the media at 37 °C overnight with shaking.

To make solid media, measure and combine the appropriate amounts of these ingredients with deionized water in an Erlenmeyer flask.

After autoclaving for at least 15 minutes, let the agar cool to 55 °C in a water bath. Once the media has cooled to 55 °C you should be able to comfortably hold the glass container with bare hands. Using proper aseptic technique, additives like drugs or antibiotics can be added at this time. Swirl to mix. Then, pipette molten NGM into Petri plates until they are 2/3 full. Let the newly made plates dry on the bench overnight.

The next morning pellet the OP50 at 3500 x g for 10 minutes and then resuspend the bacteria in LB media to a 10X concentration. Now, pipette a central lawn onto each plate. Avoid touching the pipet tip to the surface of the NGM and take care not to allow the culture to touch the plate walls. Leave plates to dry on the bench overnight. Once dry, expose plates to UV light to sterilize them. They are now ready to be used when culturing worms.

C. elegans are individually manipulated using a tool known as the worm pick. The pick is typically is made from 30 gauge 90% platinum and 10% iridium wire, though some researchers may prefer slightly different metal compositions. To make a pick, start by breaking the tip of a Pasteur pipet to the preferred length.

Cut about 3 to 4 cm of wire and place 0.5 cm of it inside the tip of the pipet. Seal the wire to the glass over a Bunsen burner. The length of the wire protruding from the glass is about 3 to 3.5 cm but can vary according to individual preferences.

Flatten the end of the wire using a hard edge. Then bend the flattened portion upward to form a scoop. Finally, sand the edges of the pick to prevent damaging the worm or the agar.

To pick worms sterilize the wire of the pick on a flame. Then coat the tip with thick, sticky OP50 E. coli from an NGM plate. Use care to not puncture or scar the agar surface.

While looking through a dissection scope, lightly scoop the worm onto the flattened, sticky pick until the worm sticks to the pick.

Once the worm is on the pick, immediately transfer by lightly holding the tip to the new surface of a new plate and sliding it across the bacterial lawn. The worm should crawl off the pick. The worm should not stay on the pick for too long or it might dry out.

One of the reasons why C. elegans is a popular model for research is because cultures can be stored for long periods of time without any adverse effect.

First, wash freshly starved larvae using 0.5 ml M9 Buffer, gently swirl to loosen all larva and adult animals, and then transfer to a microcentrifuge or cryotube. Then, add equal amount 30% glycerol in M9 Buffer. Finally, pack the vial into an insulated box and store at -80 °C.

To recover worms, remove the tube from a -80 freezer and let thaw at room temperature until the contents fully melt. Pipette the liquid onto a fresh NGM plate with OP50 lawn and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer 10-15 animals to a new plate and allow them to reproduce for one generation. Collect the progeny and score for correct phenotypes.

Now that we’ve seen how C. elegans is maintained in the lab, let’s have a look at how feeding, housing, and handling conditions are modified for experiments.

The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function.

We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat.

Then 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes. Since we share about half of our genome with the worm many of the insights gleaned are applicable to human disease.

Because of its quick life-cycle, C. elegans is particularly well suited as a model of aging.

First, a time-synchronized population of C. elegans is generated, by allowing adult hermaphrodites to lay eggs on NGM plates. The worms lay eggs for 6-8 hr and then are removed.

When worms are at the desired stage they are transferred to new NGM plates containing ampicillin to prevent bacterial contamination and FUDR to prevent reproduction.

From this point forward adult worms are observed every 2-3 days until all worms have died. Dead worms are removed from the plate and the number of live and dead worms are recorded.

Analyzing life span in the context of genetic or environmental insults can yield significant insights into the aging process.

Using lasers it is possible to perform axotomies or the cutting of individual axons, in live C. elegans to study how nerve cells regenerate.

But, because worms never keep still, they are placed on 10% agarose pads in solution of microbeads. A cover slip is placed on top. The microbeads increase the coefficient of friction of the pad-coverslip interaction, effectively freezing the worm in place.

The slide is now prepared for performing axotomies. The neurons are brought into view and centered on the microscope. The laser is then fired using the foot pedal. Optimum laser power will sever the neuron without harming adjacent structures. As many axons as possible are cut per animal.

The agarose pad is then carefully removed from the slide, and worms are allowed to recover on a seeded NGM plate at 20 °C. Between 8-48 hr after the axotomy, the neurons can be prepared to score for regeneration. At the distal part of the cut, the neuron forms a stump. However, at the proximal portion the neuron regenerates forming elongated neurites.

You’ve just watched JoVE’s take on basic Ceanorhabditis elegans maintenance. In this video we reviewed: housing and feedings of C. elegans, handling them, and freezing and recovery of nematodes.

We also took a brief tour through some applications that make C. elegans such a powerful research tool. Although C. elegans are dissimilar to mammals in many ways, their similar genetic makeup, ease of maintenance, and simple manipulation make them an important model in the quest for understanding mammalian biology and disease. Thanks for watching!