Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige RNA aus Rückenmark-Motorneuronen zu gewinnen, ohne Kontamination durch RNA benachbarter Zellen. Dies wird erreicht, indem das Rückenmark zunächst gewonnen, geteilt und in Kryo-Einbettmedium eingebettet und anschließend bei minus 160 Grad Celsius eingefroren wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Rückenmark bei minus 20 Grad Celsius in Kryoschnitten auf Membranobjektträger abzuschneiden.

Anschließend werden die Objektträger in 70 %igem Ethanol gewaschen und mit Azure B in 70 %igem Ethanol gefärbt. Der letzte Schritt ist die Laser-Mikrodissektion identifizierter Motoneuronenzellkörper in Guanin-Thiocyanat-Lysepuffer. Abschließend wird aus den vereinigten Lysaten Gesamt-RNA gewonnen und analysiert, um Unterschiede in der allgemeinen oder spezifischen RNA-Transkription in Neuronen von mutierten im Vergleich zu Wildtyp-Tieren aufzudecken.

Mittels Laser-Kapture-Mikrodissektion können Motoneuronenzellkörper aus Schnitten des Rückenmarks gewonnen werden, ohne dass sie durch die zahlreicheren Gliazellen und andere Zelltypen kontaminiert werden. Dies ermöglicht die Aufbereitung von RNA und den Vergleich der Transkription zwischen Neuronen eines erkrankten und eines gesunden Tieres. Der schwierigste Aspekt bei der Entwicklung dieses Verfahrens bestand darin, eine Färbemethode zu finden, die es uns erlaubt, Motoneurone in Rückenmarkschnitten nachzuweisen, während gleichzeitig hohe RNA-Integrität und Extrahierbarkeit vor und während der Laser-Kapture erhalten bleiben.

Wir fanden, dass die Färbung von Schnitten mit Azure B und 70 % Ethanol, kombiniert mit der direkten Sammlung der dissezierten Zellkörper in Guanidin-Thiocyanat-Lysepuffer, diese Kriterien erfüllt, was die Methode demonstriert. Van Padia, eine Postdoktorandin in unserem Labor, führte dies durch. Für die besten Ergebnisse stellen Sie sicher, dass sämtliche Geräte nach der Tötung und transkardialer Perfusion mit einer RNAse-Deskontaminierungslösung und anschließend mit RNAse-freiem 70 % Ethanol gereinigt werden. Isolieren Sie sorgfältig das Rückenmark. Spülen Sie das Rückenmark 10 Sekunden lang in RNAse-freiem Puffer.

Freies Wasser verwenden, um eventuelles restliches Blut abzuwaschen, und das Gewebe vorsichtig, aber schnell auf einen RNA-freien Objektträger legen. Anschließend das Rückenmark mit einer sauberen Rasierklinge quer in neun bis zehn Stücke teilen. Die Stücke in einer mit OCT gefüllten Kryoschneidform platzieren und mit einer sauberen Nadel senkrecht ausrichten.

Stellen Sie die Form in eine flache Schale, die zwei Methylbutan enthält, das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt wurde. Um eine RNA-Degradation zu vermeiden, stellen Sie die Schale in ein Bad aus flüssigem Stickstoff, um die Rückenmarkstücke schnell einzufrieren.

Lagern Sie den OCT-eingebetteten Block bis zu sechs Monate lang bei minus 80 Grad Celsius vor der Schnittführung. Wenn Sie zur Schnittführung bereit sind, bringen Sie den OCT-eingebetteten Block in einen gekühlten Kryostaten ein. Erzeugen Sie 20 Mikrometer dicke Schnitte, von denen jeder neun bis zehn Querschnitte des Rückenmarks enthält.

Legen Sie die Schnitte auf eine RNA-freie Pen-Membran. Zwei-Mikrometer-Dickschnitte werden zunächst bei Raumtemperatur aufbewahrt, um sicherzustellen, dass die Schnitte haften. Gefrieren Sie den Schnitt umgehend auf einer Oberfläche bei minus 20 Grad Celsius innerhalb des Kryostaten ein.

Bewahren Sie die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie auf einer sauberen Halterung verwendet werden. Sechs 50-Milliliter-Konischöfen mit RNasefreiem 70 %igem Ethanol. Die Flüssigkeitstiefe sollte ausreichen, um alle Schnitte auf einem Objektträger vollständig zu bedecken, wenn der Objektträger eingetaucht wird.

Als Nächstes 1 %ige Azure B-Lösung auf denselben Rack geben. Um die Zeit zwischen dem Wechseln der Lösungen während des Waschens oder Färbens zu minimieren, drei oder vier Laborwischtücher vor dem Rack platzieren, um überschüssige Lösung schnell ablaufen zu lassen. Wenn bereit, die Objektträger aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank nehmen und auf Trockeneis legen, wobei man einen Objektträger nimmt und ihn auf die behandschuhte Handfläche legt, um ihn aufzutauen.

Entfernen Sie die meiste Feuchtigkeit und Kondensation auf dem Objektträger, indem Sie sie vorsichtig mit einem Laborabwischvlies abwischen, wobei Sie darauf achten, die Schnitte nicht zu berühren. Stellen Sie den Objektträger für 30 bis 40 Sekunden auf frisches Silikagel-Trockenmittel in eine Petrischale, um ihn vollständig zu trocknen. Tauchen Sie den Objektträger nach dem Trocknen in das erste Gefäß mit RNAs, free 70% Ethanol.

Die Objektträger 30 Sekunden lang einweichen und anschließend das OCT durch Eintauchen für 45 Sekunden bis eine Minute auf und ab waschen. Danach den Objektträger aus der Lösung nehmen und die überschüssige Flüssigkeit auf Laborpapier abtropfen lassen. Diesen Vorgang wiederholen, indem der Objektträger in das zweite Reagenzglas mit 70 % Ethanol getaucht wird.

Falls OCT weiterhin um die Schnitte des Rückenmarks herum vorhanden ist, wiederholen Sie die Wäsche im dritten Reagenzglas. Nach dem Abtropfen der überschüssigen Flüssigkeit tauchen Sie den Objektträger für 30 bis 45 Sekunden in eine 1 %ige Azure-B-Lösung in 70 % RNasefreiem Ethanol ein. Entfernen Sie den überschüssigen Azure-B-Farbstoff durch Abtupfen auf einem Laborreinigungstuch.

An diesem Punkt wird die gesamte Probe blau sein. Tauchen Sie die Probe in das nächste Gefäß mit 70 % Ethanol und bewegen Sie sie dort schnell drei- bis viermal auf und ab, um überschüssiges Farbstoffmittel zu entfernen und die spezifische Motoneuron-Färbung sichtbar zu machen. Falls die Schnitte sehr dunkel gefärbt erscheinen, wiederholen Sie den Entfärbungsschritt in einem frischen Gefäß mit 70 % Ethanol.

Falls die Färbung zu schwach erscheint, geben Sie den Objektträger erneut in die Azure-B-Lösung für weitere 32. und wiederholen Sie die DES-Färbung. Falls die Färbung zufriedenstellend ist, lassen Sie den Objektträger kurz an der Luft trocknen und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Nach der DES-Färbung und dem Trocknen erscheint die graue Substanz hellblau, und die dunkelblau gefärbten Motoneurone sind leicht sichtbar.

Beginnen Sie die Dissektion unmittelbar nach dem Einschalten des Mikroskops. Entladen Sie den Röhrchenhalter, um die Kappe eines 0,6-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchens anzubringen. Geben Sie für die Probenentnahme 30 Mikroliter Guanidin-Thiocyanat-Lysepuffer in die Kappe und bedecken Sie die Oberfläche, indem Sie die Lösung verteilen.

Mit einer Pipettenspitze richten Sie die Kappe an der Öffnung und am Objektiv aus. Lassen Sie die Kappe mithilfe der Mikroskop-Software in geschlossener Position, bis die Laser-Mikrodissektion beginnt. Legen Sie den luftgetrockneten Objektträger verkehrt herum auf den Mikroskoptisch, sodass die Membranseiten nach unten zeigt und der Schnitt mit der Öffnung ausgerichtet ist.

Bei eingeschobenem Objektträger fokussieren Sie mit dem 5x-Objektiv auf einen Schnitt des Rückenmarks und wechseln dann zum 20x-Objektiv für die Dissektion. Markieren Sie zunächst einen Testbereich mit dem Lichtstift und lassen Sie den Laser diesen ausschneiden, ohne ihn einzusammeln. Dadurch entspannt sich die Membran, und es wird möglich, mehrere Bereiche nacheinander zu markieren und auszuschneiden.

Als Nächstes erneut fokussieren und Motoneurone im Bereich des Vorderhörns identifizieren. Diese Neurone sind anhand ihrer Lage, ihrer charakteristischen Morphologie, ihrer großen Größe und der intensiv blauen Färbung mit Azure B erkennbar. Mit dem Lichtstift das Zeichenwerkzeug auswählen und entlang der Kante der Motoneurone eine vollständige Umrandung zeichnen. Dabei die Umrandung so nah wie möglich am Motoneuron anlegen, um Kontamination durch andere Zellen zu vermeiden.

Mehrere Zellen können vor dem Schneiden markiert werden, da die Software die Positionen speichert, bis zum Schneiden bereit ist, den Deckel unter die Schneidposition bringt und dann auf die Schaltfläche „Start“ klickt, um die motorische Neuronen-Dissektion mit dem Laser einzuleiten. Sammeln Sie alle motorischen Neuronen aus allen Abschnitten auf einem Objektträger im Deckel eines Mikrozentrifugenröhrchens. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, nehmen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Halter, indem Sie das Tablett entladen und das Röhrchen vorsichtig herauslösen, und lösen Sie die motorischen Neuronen und den Puffer vollständig auf, indem Sie die Lösung mehrmals auf- und abpipettieren.

Bringen Sie die Lösung durch Zentrifugation in den Röhrenkörper, frieren Sie die Probe sofort in Trockeneis ein und lagern Sie sie nach der Färbung mit Azure B bei minus 80 Grad Celsius. Die Motoneurone erscheinen als große, dunkel angefärbte Zellkörper. Sie werden durch Anti-CHATT-Antikörper-Färbung bestätigt und lassen sich leicht von kleineren benachbarten Zellen unterscheiden. In diesem Beispiel wurden die Zellkörper der Motoneurone mit dem Lichtstift umrissen und vom Software nummeriert.

Hier wurden die Zellkörper mit dem Laser ausgeschnitten und in das Sammelröhrchen abgelegt, wobei die Konturen deaktiviert wurden. Das Ausmaß der Laserbeschädigung benachbarter Bereiche ist erkennbar. Typische Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse der RNA-Integrität einer Probe von etwa 4.000 mit LMD gesammelten Maus-Motoneuron-Zellkörpern werden hier gezeigt.

Achten Sie auf die deutlichen Ribosomen-RNA-Peaks. Der gesamte Prozess, beginnend mit der Färbung des Objektträgers bis hin zur Dissektion der Motoneurone, sollte für alle Schnitte auf einem Objektträger innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen sein, um eine RNA-Degradation zu minimieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, sowohl bei der initialen Dissektion und Einbettung des Rückenmarks als auch in den abschließenden Schritten der Färbung und der laserbasierten Mikrodissektion der Motoneurone so schnell wie möglich zu arbeiten.