Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige RNA aus Motoneuronen des Rückenmarks ohne Kontamination durch RNA aus Nachbarzellen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem das Kabel zunächst geborgen, geteilt und in Kryo-Einbettungsmedium eingebettet und bei minus 160 Grad Celsius eingefroren wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Kabel bei minus 20 Grad Celsius auf Stiftmembran-Objektträger zu kryoschneiden.

Anschließend werden die Objektträger in 70 % Ethanol gewaschen und mit Azure B in 70 % Ethanol gebeizt. Der letzte Schritt ist die Laser-Capture-Mikrodissektion von identifizierten Motoneuronenzellkörpern in Guinea-Thiocyanat-Lysepuffer. Letztendlich wird die Gesamt-RNA aus den kombinierten Lysaten hergestellt und getestet, um Unterschiede in der allgemeinen oder spezifischen RNA-Transkription in Neuronen von mutierten und Wildtyp-Tieren aufzudecken.

Die Laser-Capture-Mikrodissektion ermöglicht die Gewinnung von Zellkörpern von Motoneuronen aus Rückenmarksschnitten ohne Kontamination durch die zahlreicheren Scalia und andere Zelltypen. Dies bietet die Möglichkeit, RNA vorzubereiten und die Transkription zwischen Neuronen eines erkrankten Tieres und einem normalen Tier zu vergleichen. Der schwierigste Aspekt bei der Entwicklung dieses Verfahrens bestand darin, eine Färbemethode zu finden, die es uns ermöglicht, Motoneuronen in Rückenmarksschnitten zu erkennen und gleichzeitig ein hohes Maß an RNA-Integrität und Extraktionsfähigkeit sowohl vor als auch während der Lasererfassung aufrechtzuerhalten.

Wir fanden heraus, dass Färbeabschnitte in Azure B und 70 % Ethanol diese Kriterien erfüllten, wenn sie mit der Sammlung der präparierten Zellkörper direkt in Guine Thiocyanate Lysis Buffer kombiniert wurden, was zeigt, dass das Verfahren bei Ine Van Padia, einem Postdoc in unserem Labor, für die besten Ergebnisse ist. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte mit RNAs, Dekontaminationslösung, gefolgt von RNAs, freiem 70%igem Ethanol nach Euthanasie und transkardialer Perfusion gereinigt werden. Isolieren Sie das Rückenmark sorgfältig. Spülen Sie die Nabelschnur 10 Sekunden lang in RNAs.

Kostenloses Wasser, um eventuelles Restblut abzuwaschen und es sehr sanft, aber schnell auf einen RNAs-freien Glasobjektträger zu legen. Als nächstes teilst du das Rückenmark mit einer sauberen Rasierklinge quer in neun bis 10 Stücke. Positionieren Sie die Stücke in einer mit OCT gefüllten Kryoform und richten Sie sie mit einer sauberen Nadel vertikal aus.

Legen Sie die Form in eine flache Schale, in der sich zwei Methylbutan befinden, die mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt werden. Um einen RNA-Abbau zu vermeiden, stellen Sie die Schale in ein Flüssigstickstoffbad. Zum schnellen Einfrieren der Rückenmarksstücke.

Lagern Sie den eingebetteten OCT-Block bis zu sechs Monate lang bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie ihn schneiden. Wenn das OCT für die Schnittposition bereit ist, blockiert es in einen gekühlten Kryostaten. Produzieren Sie 20-Mikron-Scheiben mit jeweils neun bis 10 Querschnitten des Rückenmarks.

Platzieren Sie die Schnitte auf RNAs freier Stiftmembran. Zwei Mikrometer Objektträger werden zunächst bei Raumtemperatur gehalten, um sicherzustellen, dass die Schnitte haften. Frieren Sie den Abschnitt sofort auf einer negativen Oberfläche von 20 Grad Celsius im Inneren des Kryostaten wieder ein.

Bewahren Sie die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie in einem sauberen Rackbereich verwendet werden. Sechs konische 50-Milliliter-Röhrchen, gefüllt mit RNAs, frei von 70 % Ethanol. Die Tiefe sollte ausreichend sein, um alle Abschnitte einer Folie abzudecken, wenn die Folie eingetaucht wird.

Platzieren Sie als Nächstes 1 %Azure B-Lösung im selben Rack. Um die Zeit zwischen dem Wechseln der Lösungen während des Waschens oder Färbens zu minimieren, bewahren Sie drei oder vier Labortücher vor dem Gestell auf, damit die zusätzliche Lösung schnell abtropfen kann. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Objektträger aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Trockeneis. Tauen Sie einen Objektträger auf, indem Sie ihn auf eine behandschuhte Handfläche legen.

Entfernen Sie den größten Teil der Feuchtigkeit und des Kondenswassers auf dem Objektträger, indem Sie es mit einem Labortuch abwischen und darauf achten, die Abschnitte nicht zu berühren. Legen Sie den Objektträger für 30 bis 40 Sekunden auf frisches Kieselgel-Trockenmittel in eine Petrischale, um ihn vollständig zu trocknen. Wenn es trocken ist, tauchen Sie den Objektträger in das erste Röhrchen mit RNAs, frei von 70 % Ethanol.

Weichen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang ein und waschen Sie dann das OCT ab, indem Sie es 45 Sekunden bis eine Minute lang auf und ab tauchen. Nehmen Sie dann den Objektträger aus der Lösung und lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf Labortüchern ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Objektträger in die zweite Tube mit 70 % Ethanol tauchen.

Wenn OCT um die Rückenmarksabschnitte herum verbleibt, wiederholen Sie das Waschen in der dritten Tube. Nachdem Sie die überschüssige Flüssigkeit abgelassen haben, tauchen Sie den Objektträger in 1%Azure B-Lösung in 70%RNAs, freies Ethanol für 30 bis 45 Sekunden. Lassen Sie das überschüssige Azure B auf einem Labortuch ab.

Zu diesem Zeitpunkt ist die gesamte Folie blau. Tauchen Sie den Objektträger in die nächste Tube mit 70 % Ethanol und tauchen Sie ihn drei- bis viermal schnell auf und ab, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und die spezifische Färbung des Motoneurons sichtbar zu machen. Wenn die Abschnitte sehr dunkel gefärbt aussehen, wiederholen Sie den Färbeschritt in einer frischen Tube mit 70 % Ethanol.

Wenn die Färbung zu hell erscheint, geben Sie den Objektträger für einen weiteren 32. Ton an die Azure B-Lösung zurück, und wiederholen Sie die Färbung. Wenn die Färbung zufriedenstellend ist, lassen Sie den Objektträger kurz an der Luft trocknen und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Nach der DES-Färbung und -Trocknung ist die graue Substanz hellblau und die tiefblau gefärbten Motoneuronen sind gut sichtbar.

Beginnen Sie sofort nach dem Einschalten des Mikroskops mit der Dissektion. Entladen Sie den Rohrhalter, um die Kappe eines 0,6 Millimeter Mikrofugerohrs zu befestigen. Für die Probenentnahme geben Sie 30 Mikroliter Guine- und Thiocyanat-Lysepuffer in die Kappe und bedecken die Oberfläche durch Verteilen der Lösung.

Richten Sie die Kappe mit einer Pipettenspitze auf das Loch und das Objektiv aus. Halten Sie die Kappe bei Verschleiß der Mikroskopsoftware in der abgedeckten Position, bis Sie mit der Laseraufnahme beginnen. Legen Sie den luftgetrockneten Objektträger kopfüber auf den Tisch des Mikroskops, so dass die Membranseite nach unten zeigt und der Schnitt mit dem Loch ausgerichtet ist.

Konzentrieren Sie sich mit dem Schieber auf einen Rückenmarksabschnitt mit dem Fünf-fach-Objektiv und gehen Sie dann zum 20-fach-Ziel für die Dissektion über. Markieren Sie zunächst eine Dummy-Region mit dem Lichtstift und lassen Sie sie vom Laser ausschneiden, ohne sie einzusammeln. Dadurch wird die Membran entspannt und es ist möglich, mehrere Bereiche nacheinander zu markieren und zu schneiden.

Als nächstes fokussieren und identifizieren Sie Motoneuronen in der Bauchhornregion. Diese Neuronen sind an ihrer parmalen Morphologie, ihrer Größe und ihrer dunkelblauen Färbung mit Azure B zu erkennen.Wählen Sie mit dem hellen Stift das Zeichenwerkzeug aus und markieren Sie entlang der Kante der Motoneuronen, um einen vollständigen Umriss zu erstellen. Versuchen Sie, den Umriss so nah wie möglich am Motoneuron zu machen, um eine Kontamination durch andere Zellen zu vermeiden.

Vor dem Schneiden können mehrere Zellen markiert werden, da sich die Software die Positionen merkt, wenn sie zum Schneiden bereit ist, die Kappe unter die Schnittposition bringt und auf die Startschaltfläche klickt, um die Dissektion von Motoneuronen mit dem Laser zu starten. Sammeln Sie alle Motoneuronen aus allen Abschnitten auf einem Objektträger in die Kappe eines Mikro-Fuge-Röhrchens. Nachdem die Entnahme abgeschlossen ist, nehmen Sie das Mikrofuge-Röhrchen aus der Halterung, indem Sie das Tablett entladen und das Röhrchen vorsichtig vollständig entfernen. Lösen Sie die Motoneuronen und den Puffer auf, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren.

Bewegen Sie die Lösung durch Zentrifugieren in den Körper des Röhrchens, frieren Sie die Probe sofort in Trockeneis ein und lagern Sie sie nach der Färbung mit Azure B bei minus 80 Grad Celsius.Die Motoneuronen erscheinen als große, dunkel gefärbte Zellkörper. Sie werden durch Anti-CHATT-Antikörper bestätigt, färben sich und lassen sich leicht von kleineren Nachbarzellen unterscheiden. In diesem Beispiel wurden die Zellkörper der Motoneuronen mit dem Leuchtstift umrandet und von der Software nummeriert.

Hier wurden die Zellkörper mit dem Laser ausgeschnitten und mit ausgeschalteten Umrissen in das Entnahmeröhrchen fallen gelassen. Das Ausmaß der Laserschädigung benachbarter Regionen ist ersichtlich. Typische Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse der RNA-Integrität einer Probe aus ca. 4.000 Maus-Motoneuronenzellkörpern, die mit LMD gesammelt wurden, sind hier dargestellt.

Beachten Sie die markanten ribosomalen RNA-Peaks. Dieser Prozess von der Färbung des Objektträgers bis zur Dissektion der Motoneuronen sollte innerhalb von 30 Minuten für alle Schnitte auf einem Objektträger abgeschlossen sein, um den RNA-Abbau zu minimieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, so schnell wie möglich zu arbeiten, sowohl bei der ersten Dissektion und Einbettung des Nabelschnurs als auch bei den letzten Schritten der Färbung und der Laser-Capture-Mikrodissektion der Motoneuronen.