Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Untergruppen von multipotenten Vorläuferzellen des menschlichen Blutgefäßes zunächst aus einer einzigen Skelettmuskelbiopsie zu isolieren und zu reinigen, die Muskelbiopsie zu dissoziieren und mit einer Kombination aus Kollagenase Typ eins, zwei und vier zu verdauen. Markieren Sie dann die Einzelzellsuspension mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern, die eine Kombination ausgewählter Zelloberflächenmarker erkennen. Führen Sie als Nächstes eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch Durchflusszytometrie durch.

Sehen und erweitern Sie die sortierten Zellsubtypen unter bestimmten Kulturbedingungen bei optimalen Dichten. Letztendlich wird die Post-Sort-Analyse von gereinigten Zellen sowie die anschließende Durchflusszytometrie und R-T-P-C-R-Analyse von kultivierten Zelluntergruppen verwendet, um die Reinheit dieser homogenen BVSE-Untergruppen zu zeigen. Ja, diese Methode, wissen Sie, kann wirklich beantworten, wissen Sie, was ist der Ursprung dieser Meso-Kamel-Stammzellen?

Wissen Sie, weil viele Menschen verschiedene Arten von Stammzellen in verschiedenen Geweben gefunden haben. Ich denke also, dass dies eine Antwort auf die Herkunft dieser Stammzellen geben kann, sowie auf die Rolle, die perivaskuläre und alle anderen aus Blutgefäßen abgeleiteten Zellen bei der Geweberegeneration und -reparatur spielen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist ebenso wichtig wie die Muskelbiopsie.

Dissoziationsschritte können schwer zu erlernen sein. Technische Details und die Optimierung des Kollagenaseverdaus sind sehr wichtig für die Ausbeute und die Reinigung der Zielzellen. Transportieren Sie die menschliche Skelettmuskelbiopsie auf Eis.

In DM M ergänzt mit 5% FBS und 1% Penicillin Streptomycin unter sterilen Bedingungen. Waschen Sie die Probe zweimal mit PBS, das 2%antibiotisches Antimykotikum enthält, dann in dms, ergänzt mit 2%aa. Entfernen Sie das anhaftende Fett- und Bindegewebe.

Entfernen Sie auch die großen Blutgefäße unter einem Präpariermikroskop. Schneide nun die Muskelprobe in kleine Stücke. Füllen Sie die Proben in 20 Milliliter Konservierungsmedium um, um sie bis zu fünf Tage lang bei vier Grad Celsius zu lagern.

Am Tag der Zellisolierung. Entfernen Sie die Muskelteile und waschen Sie sie zweimal in PBS mit 2% Penstrip. Um nun die Aufschlusslösung herzustellen, fügen Sie 100 Milligramm pro Milliliter hinzu, jeweils Kollagenase vom Typ eins, vom Typ zwei und vom Typ vier in pm.

Zum Schluss werden die Muskelstücke mit einer kleinen Menge PM gehackt und mechanisch zerkleinert. Die Lösung wird durch eine serologische 10-Milliliter-Pipette geleitet, die auf Gerinnungsfreiheit überwacht wird. Entfernen Sie dabei das restliche Fett- und Bindegewebe.

Übertragen Sie dann die Hälfte der erwachsenen Probe auf 20 Milliliter oder die gesamte fötale Probe auf 10 Milliliter der Aufschlusslösung. Eine Probe wird 50 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 70 bis 80 U/min verdaut. Beobachten Sie den Verdauungsstatus alle 15 bis 20 Minuten.

Optimieren Sie die Zellausbeute und die Konservierung von Oberflächenantigenen, indem Sie die Verdauungszeit und/oder die Agitationsgeschwindigkeit entsprechend der Gewebemenge anpassen, wenn die Trübungen fast abklingen, pipettieren Sie das Verdauungsgewebe drei- bis fünfmal kräftig. Fügen Sie eine gleiche Menge PM hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie dann bei 400 Gs. Entfernen Sie vier Minuten lang vorsichtig das Supra natant, um das Pellet zu waschen und in 10 Millilitern PM zu resuspendieren. Filtrieren Sie vier Minuten lang durch eine 100-Mikron-Zellensiebzentrifuge bei 400 g und entfernen Sie vorsichtig das SUP-Natant.

Nach der Reanimation werden die Pellets in Erythrozyten-Lysepuffer suspendiert und durch ein 70-Mikron-Zellsieb filtriert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Suspension durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb filtriert. Wenn ein Niederschlag beobachtet wird, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugationsreanimation.

Suspendieren Sie in 0,5 Millilitern PBS und zählen Sie die Anzahl der Zellen für die Färbung. Verdünnen Sie die Einzelzellsuspension auf weniger als 5 Millionen Zellen pro Milliliter mit PBS-Aliquot, 50 bis 100 Mikroliter der Zellsuspension und teilen Sie sie in 11 Röhrchen für die ungefärbte Kontrolle, die Negativkontrollen und die einfarbigen Positivkontrollen auf. Blockieren Sie die Einzelzellsuspension bei Bedarf 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius in Mausserum.

Die Antikörperlösungen nach Versuchsplan zugeben und 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und jedes Probenpellet einmal in verdünntem PM bei einer Endkonzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter gewaschen, um tote Zellen bei einer Verdünnung von sieben a bis 100 zu eliminieren, und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur für die Negativkontrolle und die einfarbige Positivkontrolle inkubieren. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,5 Millilitern verdünntem pm.

Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in durchflusszytometrische Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden. Bereiten Sie nun Zellentnahmeröhrchen mit 500 Mikrolitern des entsprechenden Coer-Mediums vor. Transportieren Sie die Zellsuspensionen auf Eis zur Zelle.

Sortieren Sie die Zellsuspensionen auf dem Zellsortierer in der Reihenfolge der ungefärbten Kontroll-Negativkontrollen, der einfarbigen Positivkontrollen und der Hauptzellsuspension, während Sie die Laserintensität, die Kanalkompensation und das Zellpopulations-Gating streng einstellen, um die Zellreinheit zu maximieren. Sammeln Sie die gewünschten Zellpopulationen in den entsprechenden Entnahmeröhrchen. Lagern Sie gesammelte Zellen bei vier Grad Celsius.

Wenn nicht sofort. Saatgut frisch sortiert. Myogene Endothelzellen in MPM auf Platten, die mit Typ-1-Kollagen vorkodiert wurden, um anschließend ECS-Samen zu verpacken.

3.500 bis 4.000 Zellen pro Quadratzentimeter MPM auf Platten oder Kolben, die mit Kollagensamen vom Typ 1 vorbeschichtet sind. Frisch sortierte Parasiten in e gm zwei auf Teller frisch mit 0,2%iger Gelatine für den ersten und zweiten Durchgang überzogen. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis eins bis drei in PC-Medium auf eine normale Polystyrolkultur.

Platten ab 3 M aufwärts. Sehen Sie die Zellen bei 6.500 bis 7.000 Zellen pro Quadratzentimeter in PC-Medium auf normalen Polystyrol-Kulturplatten. In Flaschen werden die frisch sortierten Adventsgewebezellen in AC-Medium auf reguläre Polystyrol-Kulturplatten aufgebracht, um anschließend ACS-Samenzellen mit 6.000 bis 7.000 Zellen pro Quadratzentimeter in AC-Medium auf reguläre Polystyrol-Kulturplatten zu verpacken.

Parameter der Fläschchen werden zunächst auf der Grundlage der Daten korrigiert, die aus der ungefärbten Kontrolle, den Negativkontrollen und den einfarbigen Positivkontrollen erhalten wurden. Nach dem Ausschluss toter Zellen wird die fluoreszenzmarkierte Zellsuspension einer Reihe von negativen und positiven Zelloberflächenmarkerauswahlen unterzogen. Die ersten CD 45-positiven Zellen werden ausgeschaltet. Dann werden die CD 56 positiven und CD 56 negativen Zellen von der CD 45 negativen Fraktion getrennt.

Die CD 56-positive Fraktion wird weiterhin der CD 34, CD 1 44-Selektion unterzogen, wobei nur dual positive Zellen als myogene Endothelzellen markiert und anschließend gesammelt werden. In ähnlicher Weise wird die CD 56-negative Fraktion weiterhin einer CD 34, CD 1 46-Selektion unterzogen, wobei nur CD 34-negative CD 1 46-positive Zellen als Parasiten markiert und anschließend gesammelt werden. Die CD 34-positive CD 1 46-negative Fraktion wird einer zusätzlichen negativen CD 31-Selektion unterzogen, um Endothelzellen auszuschließen, und nur die CD 34-positive CD 31-negative Untergruppe wird als adv-Zellen für die Entnahme markiert. Hier kann CD 1 44 verwendet werden, um den EG-Ausschluss durch CD 31 zu ersetzen.

Diese H-P-V-S-C-Untergruppen wurden aus Muskelbiopsien eines einzelnen Spenders gereinigt. Im Gegensatz zu den typischen heterogenen Muskelstammzellen bleiben Kulturen von Stammzelluntergruppen aus menschlichen Blutgefäßen auch nach langfristiger Vermehrung homogen. Wie Sie wissen, denke ich, dass es für Autoforscher sehr wichtig ist, die gleiche Technik zu verwenden, um die aus Blutgefäßen gewonnenen Stammzellen zu isolieren, die wir in unseren Labors beschrieben haben.

Wir glauben also, dass diese Technik es den Menschen ermöglichen wird, unser Ergebnis zu reproduzieren und das Ergebnis von einem Team zum anderen wirklich zu vergleichen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit frischem menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Nitrilhandschuhen und Augenschutz getroffen werden.