Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zunächst Subpopulationen von menschlichen, aus Blutgefäßen stammenden multipotenten Vorläuferzellen aus einer einzigen Skelettmuskelbiopsie zu isolieren und zu reinigen, danach die Muskelbiopsie zu dissociieren und mit einer Kombination aus Kollagenase Typ eins, zwei und vier zu verdauen. Anschließend wird die Einzelzell-Suspension mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert, die eine bestimmte Kombination ausgewählter Oberflächenmarker erkennen. Danach erfolgt die Durchführung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie.

Sehen und erweitern Sie die sortierten Zellsubtypen unter spezifischen Kulturbedingungen bei optimalen Dichten. Letztendlich dient die Analyse nach der Sortierung der gereinigten Zellen sowie anschließende Durchflusszytometrie- und RT-PCR-Analysen kultivierter Zellsubpopulationen dazu, die Reinheit dieser homogenen BVSE-Teilpopulationen nachzuweisen. Ja, diese Methode kann tatsächlich klären, woher diese mesenchymalen Stammzellen stammen.

Sie wissen, dass viele Menschen verschiedene Arten von Stammzellen in unterschiedlichen Geweben gefunden haben. Ich denke daher, dass dies die Herkunft jener Stammzellen sowie die Rolle, die perivaskuläre und andere aus Blutgefäßen stammende Zellen bei der Geweberegeneration und -reparatur spielen, erklären kann. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist ebenso entscheidend wie die Muskelbiopsie.

Die Dissoziationsschritte können schwer zu erlernen sein. Technische Einzelheiten und die Optimierung der Kollagenase-Digestion sind entscheidend für die Ausbeute und die Reinigung der Zielzellen. Transportieren Sie die humane Skelettmuskelbiopsie auf Eis.

In DM M, ergänzt mit 5 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, unter sterilen Bedingungen. Spülen Sie die Probe zweimal mit PBS, das 2 % Antibiotikum-Antimykotikum enthält, und anschließend mit DMS, ergänzt mit 2 % aa. Entfernen Sie das anhaftende Fett- und Bindegewebe.

Entfernen Sie außerdem die großen Blutgefäße unter einem Präparationsmikroskop. Schneiden Sie die Muskelprobe nun in kleine Stücke. Überführen Sie die Proben in 20 Milliliter Konservierungsmedium zur Lagerung bei vier Grad Celsius für bis zu fünf Tage.

Am Tag der Zellisolierung. Entfernen Sie die Muskelstücke und waschen Sie sie zweimal in PBS, das 2 % Pen-Streifen enthält. Um nun die Verdauungslösung herzustellen, geben Sie jeweils 100 Milligramm pro Milliliter Typ eins, Typ zwei und Typ vier Kollagenase in pm.

Schließlich die Muskelstücke mit einer geringen Menge pm hacken und mechanisch zerkleinern. Die Lösung durch eine 10-Milliliter-Serologische Pipette geben und dabei auf das Fehlen von Gerinnung achten. Entfernen Sie während dieses Vorgangs das restliche Fett- und Bindegewebe.

Überführen Sie anschließend die Hälfte der erwachsenen Probe in 20 Milliliter oder die gesamte fetale Probe in 10 Milliliter der Digestionslösung. Inkubieren Sie die Probe 50 bis 60 Minuten bei 37 °C auf einem Rotationskorb bei 70 bis 80 U/min. Überprüfen Sie den Digestionszustand alle 15 bis 20 Minuten.

Optimieren Sie die Zellausbeute und die Erhaltung der Oberflächenantigene, indem Sie die Verdauungszeit und/oder die Schüttelgeschwindigkeit entsprechend der Menge des Gewebes anpassen. Wenn die Trübung fast vollständig verschwunden ist, pipettieren Sie das verdauende Gewebe kräftig drei bis fünf Mal um. Geben Sie eine gleiche Menge PM zu, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie dann vier Minuten bei 400 G. Entfernen Sie vorsichtig das Überstand, um das Pellet aufzuspülen, und resuspendieren Sie es in 10 Milliliter PM. Filtrieren Sie durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb und zentrifugieren Sie vier Minuten bei 400 G, anschließend entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Als Nächstes resuspendieren Sie die Pellets in Erythrozytenlysepuffer und filtrieren die Suspension durch einen 70 µm Zellfilter, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Suspension erneut durch einen 70 µm Zellfilter filtriert. Falls eine Präzipitation beobachtet wird, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren erneut.

Suspendieren Sie in 0,5 Milliliter PBS und zählen Sie die Anzahl der Zellen für die Färbung. Verdünnen Sie die Einzelzell-Suspension mit einem Aliquot von PBS auf weniger als 5 Millionen Zellen pro Milliliter, 50 bis 100 Mikroliter der Zell-Suspension, und verteilen Sie sie auf 11 Röhrchen für die unbehandelte Kontrolle, die negativen Kontrollen und die Einzelfarben-Positivkontrollen. Falls erforderlich, blockieren Sie die Einzelzell-Suspension 10 Minuten bei vier Grad Celsius in Mausserum.

Fügen Sie die Antikörperlösungen gemäß dem experimentellen Design hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie jedes Probenpellet einmalig in verdünntem PM mit einer Endkonzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter zur Ausschließung toter Zellen bei einer Verdünnung von eins zu 100 von seven a a d und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur für die Negativkontrolle und die Einzelfarben-Positivkontrollen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,5 Milliliter verdünntem PM.

Überführen Sie alle Zellsuspensionen in rundbodige Polystyrol-Durchflusszytometrie-Röhrchen. Bereiten Sie nun Zellsammelröhrchen mit 500 Mikrolitern des entsprechenden Kulturmediums vor. Transportieren Sie die Zellsuspensionen auf Eis zur Zelle.

Sortieren Sie die Zellsuspensionen am Zellsorter in der Reihenfolge ungestärkte Kontrolle, negative Kontrollen, Einzelfarben-positivkontrollen und die Hauptzellsuspension, wobei Sie die Laserintensität, Kanalkompensation und Zellpopulationstrennung streng anpassen, um die Zellreinheit zu maximieren. Sammeln Sie die gewünschten Zellpopulationen in den entsprechenden Sammelröhrchen. Lagern Sie die gesammelten Zellen bei vier Grad Celsius.

Falls nicht sofort gepflanzt wird. Frisch sortierte myogene endotheliale Zellen in MPM auf Platten aussäen, die zuvor mit Typ-I-Kollagen für die anschließende Verpackung der ECS-Saat präkodiert wurden.

3.500 bis 4.000 Zellen pro Quadratzentimeter in MPM auf Platten oder Kolben aussäen, die zuvor mit Typ-I-Kollagen beschichtet wurden. Frisch sortierte Parasiten in e gm zwei auf Platten aussäen, die frisch mit 0,2 % Gelatine beschichtet wurden, für die erste und zweite Passage. Die Zellen im Verhältnis 1:3 in PC-Medium auf regulärem Polystyrol-Kulturgefäß aufteilen.

Platten ab P drei und danach. Säen Sie die Zellen mit 6.500 bis 7.000 Zellen pro Quadratzentimeter in PC-Medium auf normale Polystyrol-Kulturplatten auf. Für Kolben: Säen Sie die frisch sortierten Adventgewebe-Zellen in AC-Medium auf normale Polystyrol-Kulturplatten auf, um anschließend ACS-Saat-Zellen mit 6.000 bis 7.000 Zellen pro Quadratzentimeter in AC-Medium auf normale Polystyrol-Kulturplatten aufzupacken.

Die Fluss-Faktoren-Parameter werden zunächst anhand der Daten aus der unbehandelten Kontrolle, den negativen Kontrollen und den Einzelfarben-positiven Kontrollen korrigiert, nachdem tote Zellen ausgeschlossen wurden; anschließend wird die fluoreszenzmarkierte Zellsuspension einer Reihe von negativen und positiven Selektionen von Oberflächenmarkern unterzogen. Zunächst werden die CD45-positiven Zellen ausgeschlossen. Danach werden CD56-positive und CD56-negative Zellen aus dem CD45-negativen Anteil getrennt.

Der CD56-positive Anteil wird anschließend einer CD34-, CD144-Selektion unterzogen, bei der nur doppelt positive Zellen als myogene endotheliale Zellen markiert und danach gesammelt werden. Ebenso wird der CD56-negative Anteil einer CD34-, CD146-Selektion unterzogen, wobei nur CD34-negative, CD146-positive Zellen als Parasiten markiert und anschließend gesammelt werden; der CD34-positive, CD146-negative Anteil wird einer zusätzlichen negativen CD31-Selektion unterzogen, um endotheliale Zellen auszuschließen, und nur das CD34-positive, CD31-negative Teilmengen werden als Adv-Zellen zur Sammlung markiert. Hier kann CD144 zur Ausschließung endothelialer Zellen anstelle von CD31 verwendet werden.

Diese H-P-V-S-C-Teilpopulationen wurden aus Muskelbiopsien eines einzelnen Spenders gewonnen. Im Gegensatz zu den typischerweise heterogenen Muskelstammzellen bleiben Kulturen menschlicher, aus Blutgefäßen stammender Stammzellteilpopulationen auch nach langfristiger Expansion homogen. Wie Sie wissen, halte ich es für sehr wichtig, dass Auto-Forscher dieselbe Technik zur Isolierung verwenden, wissen Sie, jener aus Blutgefäßen stammenden Stammzellen, die wir in unseren Laboren beschrieben haben.

Daher glauben wir, dass diese Technik in einer direkten Vergleichsanordnung es ermöglicht, unsere Ergebnisse zu reproduzieren und die Resultate verschiedener Arbeitsgruppen wirklich miteinander zu vergleichen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit frischem menschlichen Gewebe äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Nitrilhandschuhen und Augenschutz sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.